Xác định vi khuẩn lậu và phát hiện đột biến gen kháng ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007

Xác định vi khuẩn lậu và phát hiện đột biến gen kháng ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005 - 2007

Trường đại học y hμ nội

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Y Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Lê Văn Phủng

2 TS Lê Thị Phương

Phản biện 1: PGS.TS Phạm Văn Hiển

Phản biện 2: PGS.TS Vũ Tân Trào

Phản biện 3: PGS.TS Đinh Duy Kháng

Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án cấp Nhà nước tại: Trường Đại học Y Hà Nội

Vào hồi 14 giờ 00 ngày 22 tháng 12 năm 2009

Có thể tìm hiểu luận án tại các thư viện:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội

- Thư viện thông tin Y học Trung ương

Danh mục nhữ

n tác giả

Danh mục những công trình của tác giả

đ∙ đăng in có liên quan đến luận án

sinh của lậu cầu tại Viện Da liễu Trung −ơng từ năm 1996-2000" Nội san Da liễu, số

2, Tổng hội Y D−ợc học Việt Nam: trang 34-43

3 Lê Văn H−ng (2006), "Sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập

đ−ợc tại Viện Da liễu Quốc gia năm 2005" Tạp chí Nghiên cứu y học 46 (6): trang 83-86

4 Lê Văn H−ng, Nguyễn Thị Nh− Lan (2008), "Giá trị của kỹ thuật PCR trong

chẩn đoán vi khuẩn lậu", Tạp chí Y học Việt Nam, tập 351 (2): trang 66-70

5 Lê Văn H−ng, Nguyễn Thị Nh− Lan (2008), " Sự kháng kháng sinh của các

chủng vi khuẩn lậu phân lập đ−ợc tại Viện Da liễu Quốc gia năm 2006", Tạp chí Y học Việt Nam, tháng 10 số 2/2008, trang 183-187

Đặt vấn đề

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh Lậu là một trong những bệnh lây truyền qua đường tình dục (LTQĐTD) phổ biến hiện nay ở nước ta và nhiều nước trên Thế giới Bệnh không gây tử vong nhưng nếu điều trị không kịp thời, không đúng phác đồ

sẽ để lại nhiều biến chứng và di chứng làm ảnh hưởng không những đối với bản thân mà còn đến xã hội, kinh tế, gia đình và giống nòi

Ciprofloxacin là một kháng sinh mới được đưa vào điều trị bệnh Lậu trong những năm gần đây với một liều uống duy nhất (500 mg) đã điều trị

được bệnh Lậu cấp; vì vậy đây là kháng sinh được cả thầy thuốc và bệnh nhân rất ưa chuộng Chính vì thế, việc lạm dụng kháng sinh này đã làm gia tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn và gây khó khăn rất nhiều cho việc chẩn đoán Các kỹ thuật chẩn đoán thông thường như nhuộm soi, nuôi cấy thường không phát hiện được vi khuẩn lậu trong các trường hợp này Vì vậy, bổ sung phương pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp kinh điển là cần thiết, để đánh giá đúng hơn về tình hình bệnh Lậu hiện nay và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu, từ đó có biện pháp can thiệp hữu hiệu Nếu không, ciprofloxacin có thể trở thành kháng sinh không có tác dụng đối với vi khuẩn lậu trong thời

gian tới Tôi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu: - Xác định tỷ lệ

nhiễm vi khuẩn lậu ở những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo,

âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007

- So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật: PCR, nhuộm soi

và nuôi cấy

- Tìm hiểu sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập

được tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007

- Phát hiện đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu

2 ý nghĩa thực tiễn và đóng góp mới của luận án:

* ý nghĩa thực tiễn của luận án:

- Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu qua từng năm ở bệnh nhân

có hội chứng tiết dịch niệu đạo âm đạo giúp cho vấn đề xây dựng chương trình can thiệp có hiệu quả nhằm hạ thấp tỷ lệ lây lan

- Đánh giá được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở giai đoạn cấp tính và mạn tính bằng những phương pháp chẩn đoán kinh điển và hiện đại, có thể áp dụng được ở những labo có điều kiện

- Xác định được tỷ lệ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu qua từng năm, giúp cho bác sỹ lâm sàng lựa chọn kháng sinh thích hợp trong điều trị bệnh Lậu

- Lần đầu tiên kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng để giải trình tự

gen gyrA và parC và tìm hiểu cơ chế đề kháng ciprofloxacin của những

chủng vi khuẩn lậu phân lập được

3 Bố cục của luận án

Luận án gồm 118 trang trong đó:

- Chương II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 19 trang

Chương 1: Tổng quan 1.1 Tình hình bệnh Lậu trên thế giới

Theo thống kê của WHO, hàng năm trên thế giới có hơn 60 triệu người bị bệnh Lậu Riêng ở Mỹ hàng năm, có khoảng 2 triệu người mới mắc, tỷ lệ phụ nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 6% ở London (Anh), theo dõi 516 thai phụ, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 0,4% Matsumoto (2008) cho

biết, tại Nhật Bản: tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis tăng trên toàn thế

giới, trong khi đó tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu lại giảm, trừ những nước thuộc

châu á

1.2 Tình hình bệnh Lậu ở Việt Nam

Sau ngày giải phóng miền Nam, bệnh hoa liễu nói chung và bệnh Lậu nói riêng lan tràn khắp nơi Theo thống kê của ngành Da liễu từ năm 1999

khuẩn lậu với một số Neisseria hoại sinh khác

Trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn lậu là những cầu khuẩn đứng thành đôi, hình hạt cà phê, hai mặt dẹt quay vào nhau, bắt mầu Gram (-),

có kích thước 0,6 μm x 0,8 μm, khoảng cách giữa hai cầu khuẩn bằng 1/5 chiều rộng Khi ở trong tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, vi khuẩn lậu là loại vi khuẩn độc chiếm tế bào (có nó thì không có loại vi khuẩn nào sống trong tế bào) Người ta có thể gặp một cặp, hai cặp, bốn cặp hoặc nhiều hơn nữa trong lòng bạch cầu đa nhân trung tính

Vi khuẩn lậu khó nuôi cấy, khi ra khỏi cơ thể, chúng dễ chết Sức đề

kháng của vi khuẩn lậu rất kém, dễ bị bất hoạt khi ở điều kiện ngoại cảnh

Nuôi cấy vi khuẩn lậu trên môi trường Thayer-Martin có chất tăng sinh Isovitalex và chất ức chế V-C-N Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là

35-360C, độ ẩm > 70%, khí trường CO2 từ 3-10%, pH 7,3 Sau 24 giờ nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc 0,5-1 mm, tròn, lồi, bờ khuẩn lạc đều, nhầy và

có màu hơi xám, óng ánh như hạt sương

1.4 Plasmid

Vi khuẩn lậu chứa một plasmid tự truyền (tiếp hợp), có trọng lượng phân

tử 36 kb Các dẫn xuất lớn hơn một chút của plasmid 36 kb đã được phân

lập, có chứa transposon tetM kháng tetracyclin Nhiều plasmid mang gen

kháng β-lactamase (kháng penicilin) khác nhau của vi khuẩn lậu đã được phân lập và xác định đặc điểm Hai plasmid hay gặp nhất là loại có kích cỡ khoảng 5,3 hoặc 7,2 kb Phần lớn vi khuẩn lậu chứa một plasmid 4,2 kb (cryptic plasmid) nhưng chưa rõ chức năng ADN của plasmid này đã được giải trình tự hoàn toàn Đôi khi có thể phân lập được vi khuẩn lậu không chứa plasmid 4,2 kb sao chép tự do này nhưng chúng vẫn có vẻ bình thường về các đặc tính sinh học

Plasmid có khả năng tự nhân lên, nên trong một vi khuẩn sẽ có rất nhiều những bản sao, do đó nếu chọn primer nhằm khuếch đại một đoạn gen nào trên plasmid thì độ nhạy sẽ cao hơn khi đoạn gen đó nằm trên nhiễm sắc thể Tuy nhiên sẽ bỏ sót những chủng vi khuẩn lậu không có plasmid Nhưng những chủng vi khuẩn lậu không có plasmid chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ và chỉ có ở một số nơi trên thế giới Nên trong nghiên cứu này đã chọn primer HO1 và HO3 của hãng Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản

nhằm vào gen cppB trên plasmid pJD1 mà gen cppB lại rất ổn định trên

plasmid pJD1 Các tác giả khác trên thế giới khi nghiên cứu về plasmid

pJD1 này đã khảng định rằng có tới trên 96% số chủng vi khuẩn lậu chứa plasmid pJD1

1.5 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lậu

- ở người lớn: vi khuẩn lậu gây viêm niệu đạo cho cả nam và nữ Triệu

chứng điển hình là đái mủ, đái khó, chảy mủ niệu đạo, âm đạo, tử cung, vòi trứng, buồng trứng Có khoảng 1/5 số người không có triệu chứng điển hình

- ở trẻ em: thường biểu hiện bệnh ở mắt do lây vi khuẩn lậu từ mẹ trong

thời kỳ sinh con, phổ biến nhất là chảy mủ kết mạc sau đẻ 1-7 ngày Nếu không điều trị kịp thời, có thể dẫn tới mù loà

- Nhiễm trùng lan tỏa: bệnh thường gặp ở những người bị bệnh Lậu

nhưng không được điều trị kịp thời, đúng phác đồ Hầu hết nhiễm vi khuẩn lậu lan toả xảy ra ở phụ nữ Biểu hiện của bệnh như: viêm khớp, viêm gan, viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc, viêm màng não, nhiễm vi khuẩn lậu trên da

1.6 Các kỹ thuật chẩn đoán ở phòng xét nghiệm

- Kỹ thuật nhuộm soi

- Kỹ thuật nuôi cấy

- Kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh: để phát hiện kháng thể kháng vi

khuẩn lậu hoặc các thành phần của nó thông qua phản ứng kết hợp bổ thể, hấp phụ miễn dịch liên quan tới enzyme

- Kỹ thuật sinh học phân tử thường dùng

* PCR: Năm 1985, nhà khoa học người Mỹ, Kary B Mullis đã phát triển

“phản ứng chuỗi polymerase’’ (Polymerase Chain Reaction - PCR) Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo sự sao chép của ADN trong tế bào, trong đó, ADN được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Từ một phân tử ADN chuỗi kép ban đầu, chúng được tách ra làm hai chuỗi

đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi ADN mới

* Tách, tạo dòng gen: là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một

trình tự ADN xác định Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong một thư viện gen, dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm, tức là tập hợp ADN cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần tìm

* Giải trình tự gen: là quá trình xác định thứ tự nucleotide của một đoạn ADN

1.7 Nghiên cứu sinh học phân tử ở vi khuẩn lậu

Vi khuẩn lậu chỉ gây bệnh ở người Trình tự gen trên nhiễm sắc thể

của chủng N gonorrhoeae FA1090 đã được giải và số lượng nucleotide là

2.153.922 (GenBank accession No NC 004969) Vi khuẩn lậu là một vi khuẩn

dễ bị chết khi ra ngoài môi trường, nuôi cấy đòi hỏi những điều kiện ngặt nghèo về chất dinh dưỡng, khí trường… Các kỹ thuật sinh học phân tử đã khắc phục được các nhược điểm này của các kỹ thuật thông thường vì các

kỹ thụât sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện trực tiếp sự có mặt của

vật liệu di truyền của vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm thông qua quá trình khuếch đại vật liệu di truyền Các kỹ thuật này rất nhạy nên chỉ cần có một

số lượng rất ít vi khuẩn là phản ứng có thể cho kết quả dương tính Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong chẩn đoán bao gồm: kỹ thuật lai, khuếch đại acid nucleic, giải trình tự gen

1.8 Một số gen liên quan đến đề kháng của vi khuẩn lậu

Những thay đổi ở các vị trí (locus) khác như mtr và penB sẽ gây ra các tác dụng phụ Vị trí mtr quyết định sự đề kháng nhiều kháng sinh và chất sát khuẩn qua hệ thống bơm chủ động Đột biến ở vị trí penB, tác

động tới porin, dẫn tới giảm tính thấm của màng ngoài tế bào với kháng

sinh ưa nước và các hợp chất khác Vi khuẩn lậu cũng có "gen giả" porA nhưng không được biểu hiện Tác động phối hợp của các đột biến penA và tăng biểu hiện mtr là làm tăng MIC của penicillin lên 120 lần Đề kháng qua trung gian nhiễm sắc thể liên quan tới những biến đổi mtr và penB

cũng làm giảm độ nhạy với penicillin Các tác giả trên thế giới: Xiahong Su

và Inga Lind; Tiffany R Shultz; U Chaudhry; Masatoshi Tanaka nghiên cứu về đề kháng quinolon của vi khuẩn lậu lại có chung một nhận xét là những chủng vi khuẩn lậu đề kháng với quinolon thì đều có những đột biến

trên gen gyrA, gen parC và số lượng đột biến cũng tăng theo nồng độ MIC Vậy, những gen quyết định sự đề kháng của vi khuẩn như: gen gyrA, parC, gyrB, parE, penA, penB, mtr những gen này trên nhiễm sắc thể và

plasmid dẫn tới sự đề kháng rõ rệt trên lâm sàng Do hạn chế về thời gian, kinh tế, hơn nữa qua tham khảo những nghiên cứu đi trước của các tác giả

trên thế giới thì phần lớn những nghiên cứu này đều đề cập đến gen gyrA

và parC, còn những gen khác ít được đề cập nên tôi đã chọn gen gyrA và parC để nghiên cứu về sự đề kháng của vi khuẩn lậu với kháng sinh

ciprofloxacin và những gen khác ít được đề cập Mặt khác tôi cũng muốn

giành cho nghiên cứu vào dịp khác khi có điều kiện Gen gyrA có độ dài

2.751 nucleotid mã hoá 916 axít amin, vùng quyết định đề kháng quinolon

dài khoản 279 nucleotid mã hoá 93 axít amin Gen parC có độ dài 2.307

nucleotid mã hoá 768 axít amin, vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoản 255 nucleotid mã hoá 85 axít amin

1.9 Kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu

1.9.1 Trên thế giới

Thông báo của WHO (2008), cho biết tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại kháng sinh thuộc nhóm quinolon năm 2006 ở khu vực châu á Thái Bình Dương: Trung Quốc là 99,6%; Hồng Kông 97,8%; Hàn Quốc 89,4%; Nhật Bản 83,4%; Việt Nam 82,1%; Brunei 81,7%; Singapore 70%; Philippines 69%; Malaysia 62%; Australia 38,7%; New Zealand 13,7% và tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng tetracyclin ở mức độ cao: Singapore 76,8%; Hong Kong

48,9%; Trung Quốc 35,2%; Philippines 31%; New Zealand 25%; Việt Nam 16,2%; Australia 12%

1.9.2 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở Việt Nam

Cũng giống như tình hình kháng kháng sinh trên thế giới, tỷ lệ vi khuẩn lậu không những ngày càng kháng lại nhiều loại kháng sinh mà còn gia tăng mức độ đề kháng, đặc biệt với ciprofloxacin, như thông báo của

Lê Thị Phương năm 1996-2000 tỷ lệ này là 35,6% nhưng đến năm 2006 theo thông báo của Lê Văn Hưng thì tỷ lệ này là 56,6% và giảm nhạy cảm 25,5% nâng mức tổng kháng 82,1%

1.9.3 Ciprofloxacin và kháng ciprofloxacin

Kháng sinh ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon thế hệ thứ hai được

đưa ra thị trường vào những năm 1980 với liều uống duy nhất 500 mg đã

có thể điều trị được bệnh Lậu cấp Nhưng, bệnh nhân nước ta khi bị các bệnh LTQĐTD thường dấu bệnh, ít khi đi khám, mà lại tự sử dụng kháng sinh nên đã làm lan truyền và gia tăng những chủng vi khuẩn lậu kháng các kháng sinh nói chung và kháng với kháng sinh ciprofloxacin nói riêng.

- Công thức hóa học của Ciprofloxacin: C17H18FN3O3

Gyrase Cấu tạo Gyrase gồm hai tiểu phần GyrA và GyrB do gen gyrA và gyrB quy định Tương tự topoisomerase IV cũng tham gia vào mở xoắn

ADN Cấu tạo topoisomerase IV gồm hai tiểu phần ParC và ParE do gen

parC và parE quy định Khi enzyme DNA-gyrase bị thay đổi (do đột biến

gen), nó không tương tác với quinolon nữa Vì vậy, vi khuẩn vẫn nhân lên bình thường khi có mặt của quinolon (vi khuẩn kháng quinolon)

1.10 Các nghiên cứu về đột biến gen liên quan đến đề kháng

U Chaudhry và cộng sự (2002) nghiên cứu 63 chủng vi khuẩn lậu phân lập trên bệnh nhân ở Delhi, ấn Độ có 5 chủng (6%) nhạy cảm với

ciprofloxacin (MIC < 0,06 μg/ml) Phân tích trình tự ADN của gen gyrA và parC cho thấy: tất cả các chủng kháng ciprofloxacin (58 chủng) đều có sự

đột biến ở đoạn gen gyrA và parC GyrA (Ser91 thành Phe, Asp-95 thành

Asn, Val-120 thành Leu) Cũng về vấn đề này, Xie P và cộng sự (2003) cho biết: 20 chủng đề kháng và 20 chủng nhạy cảm với kháng sinh nhóm quinolon tại tỉnh Wusu, Trung Quốc đều có những đột biến điểm ở Asp-95

của gen gyrA và Asp-86, Ser-87, Ser-88, Glu-91 của gen parC Liên quan

đến giá trị MIC và số lượng các đột biến, Xu J S và cộng sự (2006) nghiên cứu 18 chủng kháng ciprofloxacin ở tỉnh Jiangsu, Trung Quốc và phát hiện

những đột biến tại gen gyrA và parC kết luận rằng những chủng có MIC

cao thì có nhiều điểm đột biến Qua nhiều nghiên cứu trên thế giới, các tác

giả đều có chung nhận xét rằng, đột biến gen gyrA và parC có liên quan

đến sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin

Chương 2: Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Là bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung

- Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

+ Có triệu chứng lâm sàng: miệng sáo đỏ, sưng, có mủ hoặc dịch tiết ở

niệu đạo màu trắng đục, vàng hoặc hơi xanh, khi đi tiểu thấy nóng buốt

hoặc có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung, nóng rát khi đi tiểu

+ Đồng ý tham gia vào nghiên cứu của tôi

- Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân

Đang dùng thuốc kháng sinh tại thời điểm lấy bệnh phẩm 7 ngày

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp

Nghiên cứu của tôi được thực hiện trên tất cả những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 với số mẫu 5.091 bệnh nhân, để tôi: xác định tỷ lệ nhiễm vi

khuẩn lậu và tìm hiểu sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được ở đối tượng này

Trong tổng số 5.091 bệnh nhân, tôi chọn ngẫu nhiên lấy 500 bệnh nhân để: so sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy, tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang Phân tích các trình tự nucleotide và acid amin tôi sử dụng phương pháp kết thúc chuỗi của Sanger và cộng sự (1977)

2.2.2 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

+ ở nữ giới: lấy bệnh phẩm ở cổ tử cung, niệu đạo, 2 bên của tuyến Skène,

2 bên tuyến Bartholin

+ ở nam giới: lấy bệnh phẩm ở niệu đạo

2.2.3 Kỹ thuật nhuộm soi hình thể: sau khi phết bệnh phẩm, cố định trên

ngọn lửa đèn cồn, nhuộm Gram Nhận định kết quả: vi khuẩn có hình hạt

cà phê, bắt màu Gram (-), nằm trong hay ngoài bạch cầu đa nhân trung tính (nghĩ tới vi khuẩn lậu)

2.2.4 Kỹ thuật nuôi cấy

Bệnh phẩm được ria trên môi trường Thayer-Martin bằng những đường dích dắc hoặc kỹ thuật cấy phân vùng Để đĩa thạch đã cấy vào tủ ấm nhiệt độ 35-360C, có 3-10% khí CO2, độ ẩm > 70% Sau 18-24 giờ, quan sát khuẩn lạc Nếu chưa thấy vi khuẩn mọc để thêm 24 giờ nữa

2.2.5 Xác định vi khuẩn lậu

Nhuộm Gram khuẩn lạc: vi khuẩn có hình hạt cà phê, Gram (-)

Test Oxidase dương tính; Kỹ thuật phân hủy đường nhanh (Test Neisseria4H): vi khuẩn lậu chuyển hoá đường glucose

2.2.6 Kỹ thuật kháng sinh đồ

+ Kỹ thuật khuếch tán trên thạch

Sử dụng môi trường Thayer-Martin: lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy 18-24 giờ, hoà đều với nước muối sinh lý 0,9%, so với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5 (tương đương với 3x108 vi khuẩn/1ml) Huyền dịch láng đều lên bề mặt đĩa thạch, để khô mặt thạch, đặt các khoanh giấy kháng sinh, để 10 phút, ủ tủ ấm 35-360C, 3-10% CO2, độ ẩm > 70% Đọc kết quả sau 18-24 giờ, đo đường kính vùng ức chế (mm) và so kết quả với bảng chuẩn

Tất cả các lần thử nghiệm, kết quả đường kính vùng ức chế của các khoanh giấy kháng sinh trên chủng mẫu đều nằm trong giới hạn cho phép; chứng tỏ các yếu tố kỹ thuật đảm bảo chất lượng, từ đó tôi có thể khẳng

định rằng kết quả kháng sinh đồ ở các chủng vi khuẩn lậu phân lập được là chính xác

+ Kỹ thuật xác định MIC của vi khuẩn lậu (E-test)

Tiến hành: lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu hoà đều với nước muối sinh lý 0,9% So với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5 Dùng tăm bông nhúng vào huyền dịch Ria tăm bông Đặt thanh giấy E-test Để khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng cho kháng sinh ở các thanh giấy khuyếch tán đều Để vào

tủ ấm nhiệt độ 35-36oC, nồng độ CO2 3-10%, độ ẩm >70% Sau 18-24 đọc kết quả

2.2.7 Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm

Sinh phẩm và hóa chất: “QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit” hãng Qiagen Thực hiện theo hướng dẫn của hãng: quy trình tách chiết ADN, chạy PCR (Khuếch đại ADN), phát hiện sản phẩm khuếch đại gen bằng điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose, xem và chụp ảnh bản thạch So sánh kích cỡ của sản phẩm với thang ADN chuẩn để kết luận sản phẩm có đặc hiệu cho vi khuẩn lậu hay không

2.2.8 Quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC

Các hoá chất (hãng Bio-Rad) (Mỹ) Thực hiện theo hướng dẫn của hãng: chạy PCR (khuếch đại ADN, phát hiện sản phẩm khuếch đại gen,

điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose, xem và chụp ảnh bản thạch các băng ADN sẽ phát sáng Xác định PCR bằng cách so sánh kích cỡ của

băng ADN với băng ADN của chứng dương (gyrA và parC) Sản phẩm

PCR được dùng để giải trình tự

2.2.9 Quy trình giải trình tự gen

Giải trình tự bằng ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit Tinh sạch sản phẩm sau khi làm phản ứng giải trình tự gen Đọc kết quả bằng máy ABI PRISM 310 của hãng Applied Biosystem Trình tự các nucleotide ở các mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự nucleotide

của gen gyrA và parC của các chủng lậu bình thường để tìm ra điểm đột biến

2.2.10 Xử lý số liệu

Số liệu xử lý theo chương trình SPSS 16.0 và Whonet 5 Các trình tự

nucleotide và acid amin được phân tích bằng phần mềm Bioedit 7.0.9.0

2.2.11 Y đức trong nghiên cứu

Tư vấn cho bệnh nhân khi lấy dịch tiết Thông tin về bệnh nhân tuyệt

đối giữ bí mật Được sự đồng ý của hội đồng y đức

2.2.12 Địa điểm nghiên cứu

Khoa xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia Labo trung tâm trường Đại học Y Hà Nội Khoa xét nghiệm - Viện các bệnh truyền nhiễm Quốc Gia - Nhật Bản

chương 3: kết quả nghiên cứu

3.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu

đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005 đến năm 2007 (n=5.091)