Xây dựng phương pháp đánh giá kháng nguyên ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao tại Viện Vắcxin Nha Trang

Xây dựng phương pháp đánh giá kháng nguyên ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao tại Viện Vắcxin Nha Trang

_

nguyễn thị lan phương

xây dựng phương pháp đánh giá kháng

nguyên ngoại vμ nội độc tố trong vắcxin

ho gμ - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho

gμ an toμn cao tại viện vắcxin nha trang

Chuyên ngành: Vi khuẩn học Mã số: 62.72.6801

Tóm tắt luận án tiến sĩ y học

Hμ nội -2008

Công trình được hoàn thành tại:

Viện vệ sinh dịch tễ trung ương

Viện vắcxin nha trang

Người hướng dẫn khoa học:

pgs.ts.lê văn hiệp pgs.ts đặng đức anh

Phản biện 1: PGS.TS Đinh Hữu Dung

Phản biện 2: PGS.TS Lê Văn Phủng

Phản biện 3: PGS.TS Đào Xuân Vinh

Luận án đã được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương vào hồi 9h ngày 24 tháng 6 năm 2006

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

MỞ ĐẦU

Bệnh ho gà do vi khuẩn B.pertussis gây nên Trước đây bệnh xảy ra rất

thơng thường, đặc biệt là ở trẻ em, gây nên những hậu quả nghiêm trọng Sau hơn 40 năm sử dụng vắcxin ho gà dưới dạng vắcxin phối hợp bạch hầu, ho gà và uốn ván (vắcxin DPT) trong chương trình tiêm chủng mở rộng (CTTCMR), đến nay bệnh cơ bản đã được kiểm sốt

Hàng năm Viện Vắcxin Nha Trang sản xuất và cung cấp cho CTTCMR từ

8 đến 10 triệu liều vắcxin DPT, đủ để miễn dịch 3 mũi cơ bản cho trẻ mới sinh trong năm

Thành phần ho gà trong vắcxin DPT do Viện sản xuất là dạng tồn tế bào bất hoạt, cĩ ưu điểm giá thành rẻ, hiệu lực bảo vệ kéo dài và bền vững Mặc dù được sản xuất tuân thủ theo những qui định nghiêm ngặt của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) và của cơ quan Kiểm định Quốc gia nhưng những vấn đề liên quan đến bản chất của vắcxin tồn tế bào vẫn cho thấy vắcxin cĩ tỷ lệ phản ứng phụ nhất định trên người sử dụng Cĩ ít nhất 5 loại độc tố là HLT, PT, LPS, ATC, và TCT tham gia vào độc tính đặc hiệu của ho gà Tuy nhiên hiện nay độc tính của vắcxin chỉ được kiểm tra bằng thử nghiệm tăng trọng chuột mang tính chất an tồn chung hơn là xác định độc tính đặc hiệu của từng kháng nguyên độc tố riêng biệt TCYTTG khuyến cáo các nhà sản xuấ nên hình thành các thử nghiệm phù hợp để giám sát chất lượng của vắcxin đặc biệt ngoại độc tố ho gà PT và nội độc

tố, 2 thành phần khơng bị huỷ bởi nhiệt nhưng chiếm tỷ lệ khá cao trong vắcxin

Việc hình thành hệ thống gồm 4 thử nghiệm giám sát nồng độ và hoạt tính của ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà thực sự cần thiết để bảo đảm tính an tồn và hiệu lực của vắcxin Đồng thời việc xác định các giới hạn phù hợp của các kháng nguyên này trong vắcxin là vấn đề quan trọng trong qui trình sản xuất vắcxin ho gà an tồn cao Xuất phát từ những quan

điểm trên chúng tơi thực hiện đề tài “Xây dựng các phương pháp đánh

giá kháng nguyên ngoại và nội độc tố trong vắcxin ho gà - đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an tồn cao tại Viện Vắcxin Nha trang”

với các mục tiêu sau:

1 Xõy dựng 4 phương phỏp đỏnh giỏ khỏng nguyờn ngoại độc tố ho gà và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt

2 Xác định và đánh giá tương quan giữa các thành phần kháng nguyên,

ảnh hưởng của một số yếu tố liên quan đến tính an toàn và công hiệu của vắcxin ho gà sản xuất tại Viện Vắcxin Nha Trang là căn cứ đề xuất tiêu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao

Những đúng gúp mới và giỏ trị thực tiễn của luận ỏn

Là cụng trỡnh đầu tiờn tại Việt Nam xõy dựng và thẩm định hoàn chỉnh cỏc phương phỏp xỏc định hàm lượng và hoạt tớnh khỏng nguyờn độc tố ho gà

và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt Đõy là những phương phỏp cho kết quả nhanh nờn cú giỏ trị ứng dụng cao để kiểm định trong qui trỡnh sản xuất vắcxin ho gà toàn tế bào hiện nay Đồng thời cỏc phương phỏp này cũn là những cụng cụ hữu ớch để đỏnh giỏ chất lượng khi phỏt triển cỏc vắcxin ho gà tinh chế tại Việt nam

Luận ỏn đó xỏc định được hàm lượng và hoạt tớnh của cỏc khỏng nguyờn gõy độc chớnh trong vắcxin ho gà và đỏnh giỏ sự tương quan giữa cỏc khỏng nguyờn đú với độc tớnh đặc hiệu của vắcxin Đõy là một trong những vấn đề quan trọng để giải quyết tớnh an toàn ở mức cao nhất cú thể đạt được của vắcxin ho gà toàn tế bào đang sản xuất tại Việt nam

Xỏc định được cỏc ảnh hưởng của phương phỏp bất hoạt, thời gian lưu trữ ảnh hưởng của chất hấp phụ đối với tớnh an toàn và cụng hiệu của vắcxin

ho gà mà trước đõy chưa cú tỏc giả nào đỏnh giỏ một cỏch cú hệ thống

Đề xuất được tiờu chuẩn sản xuất vắcxin ho gà an toàn cao với những chỉ tiờu cụ thể, cú thể ứng dụng ngay qui trỡnh đề xuất này trong thực tế sản xuất vắcxin ho gà hiện nay tại Viện Vắcxin

Cấu trỳc của luận ỏn

Luận ỏn gồm 120 trang, 4 chương Cấu trỳc từng phần như sau: Đặt vấn đề: 2 trang Chương 1: Tổng quan 28 trang, 6 hỡnh minh họa Chương 2: Vật liệu – Phương phỏp: 19 trang, 2 hỡnh minh họa Chương 3: Kết quả 43 trang, 30 bảng, 15 hỡnh Chương 4: Bàn luận 25 trang, 2 hỡnh Kết luận: 2 trang Đề nghị: 1 trang Phụ lục 2 trang 110 tài liệu trong đú 18 tài liệu tiếng Việt và 92 tài liệu tiếng Anh, 4 cụng trỡnh cú liờn quan đến luận ỏn

tỷ lệ mắc và chết vì ho gà giảm rõ rệt và từ năm 1995 đến nay bệnh đã được khống chế

Sinh bệnh học: lây truyền trực tiếp do tiếp xúc với ngưoời mang mầm

bệnh Cơ chế sinh bệnh do ngoại độc tố và nội độc tố của vi khuẩn

Đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào là

cơ chế bảo vệ quan trọng Miễn dịch qua trung gian tế bào có vai trò trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên và duy trì sự bảo vệ lâu dài sau mắc bệnh Đáp ứng miễn dịch của vắcxin ho gà toàn tế bào giống với quá trình nhiễm trùng tự nhiên Đáp ứng miễn dịch của vắcxin ho gà vô bào trên người bao gồm cả 2 hướng chọn lọc Th1 và Th2

1.2 Sản xuất và kiểm định vắcxin ho gà

1.2.1 Vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt

Liên quan đến sản xuất vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt bao gồm các yêu cầu về chủng giống, môi trường, nuôi cấy lên men, tách lọc thu sinh khối, bất hoạt và pha chế vắcxin

Kiểm định vắcxin ho gà tồn tế bào bất hoạt theo tiêu chuẩn của TCYTTG

1.2.2 Vắcxin ho gà vơ bào

Vắcxin ho gà vơ bào là vắcxin tinh chế thường chứa các kháng nguyên PT, FHA và PRN Tuy nhiên thành phần kháng nguyên, hàm lượng kháng nguyên chưa cĩ sự thống nhất của các nhà sản xuất

Tiêu chuẩn của vắcxin ho gà vơ bào giống với vắcxin ho gà tồn tế bào nhưng trong phương pháp kiểm định cần xác định hàm lượng của các kháng nguyên và hiệu quả đáp ứng miễn dịch trên súc vật thí nghiệm và xác định cơng hiệu của vắcxin Kiểm tra an tồn đặc hiệu bằng thử nghiệm tăng trọng chuột

1.3 Xây dựng và đánh giá phương pháp phân tích

1.3.1 Các thử nghiệm invitro và invivo xác định hàm lượng và hoạt

tính độc tố ho gà

Hiện nay phương pháp tăng trọng chuột (MWG) là phương pháp đánh giá tính an tồn dùng để xuất xưởng của vắcxin ho gà Một số thử nghiệm đã được phát triển dựa vào đặc tính kháng nguyên của vắcxin theo nhu cầu của nhà sản xuất:

- Định lượng kháng nguyên độc tố ho gà bằng phản ứng ELISA

- Các thử nghiệm trên tế bào CHO

- Xác định yếu tố nhạy cảm histamin (HSF)

- Thử nghiệm xác định yếu tố kích hoạt lymphơ bào (LPF)

- Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) …

1.3.2 Đánh giá qui trình phân tích và thẩm định phương pháp

Đánh giá qui trình phân tích là một yêu cầu trước khi áp dụng phương pháp Trong đĩ một số các thuộc tính của qui trình phân tích ( phương pháp phân tích) cần được đánh giá trong quá trình thẩm định bao gồm: độ đúng (accuracy), độ chính xác (precision), độ nhạy (sensitivity), độ đặc hiệu (selectivity)….Thực hiện một nghiên cứu tương quan giữa 2 phương pháp đơi khi cũng cần thiết trong thẩm định

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1.Sinh phẩm

- Nước cốt ho gà BP 509, BP134, PM (Viện Vắcxin )

- Vắcxin ho gà mẫu chuẩn Quốc gia RP5 (Viện KĐQG - Việt Nam), mẫu chuẩn xác định yếu tố kích hoạt lympho bào PU585 (Viện RIVM –Hà Lan)

- Độc tố ho gà mẫu chuẩn Quốc tế JNIH-5 (Viện NIBSC - Anh) - Kháng thể đơn dòng kháng độc tố ho gà (Biken -Nhật bản) - Cộng hợp kháng thỏ gắn biotin ( Sigma)

- Fetuin (Sigma)

- Lysat ( Bio Whitake) - Endotoxin chuẩn (Cambrex)

2.1.2.Tế bào – Môi trường – Dung dịch

- Tế bào CHO –K1 (Viện Biken - Nhật)

- Môi trường EMEM + 10% HTBTB (Sigma)

- Các dung dịch đệm, dung dịch thuốc nhuộm…

2.1.3 Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt 11-14g; 15-17g

2.1.4 Hoá chất: Tetramethylbenzidine, Tween 20, axit sulfuaric…

2.1.5 Dụng cụ thiết bị: Multichannels, máy đọc ELISA, máy siêu âm

đồng hoá, máy ly tâm lạnh, tủ ấm, cân…

2.2 Phương pháp

2.2.3 Xây dựng các phương pháp xác định kháng nguyên độc tố ho gà

PT và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào bất hoạt

™ Các bước cơ bản để hình thành và ứng dụng phương pháp mới: xác định

các điều kiện tối ưu của phương pháp, xây dựng qui trình thực hiện và thẩm định phương pháp (độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng)

™ 4 phương pháp xác định kháng nguyên ngoại độc tố ho gà và nội độc tố là:

- Xây dựng và chuẩn hoá phương pháp ELISA định lượng nồng độ

kháng nguyên độc tố ho gà PT trong vắcxin ho gà toàn tế bào

- Xây dựng, chuẩn hoá và thẩm định phương pháp chuẩn độ độc tố ho

gà hoạt động trên tế bào CHO-K1

- Xây dựng phương pháp xác định yếu tố kích hoạt tăng lymphô bào

(LPF) trên chuột nhắt trắng

- Xây dựng và chuẩn hoá phương pháp LAL xác định nội độc tố

(endotoxin) trong vắcxin ho gà toàn tế bào

2.2.4 Phương pháp kiểm định công hiệu và an toàn đặc hiệu vắcxin ho

gà toàn tế bào bất hoạt

- Phương pháp thử thách xác định công hiệu của vắcxin ho gà: Theo

thường qui của TCYTTG

- Phương pháp tăng trọng chuột (MWG) xác định an toàn đặc hiệu của

vắcxin ho gà: Theo thường qui của TCYTTG

2.2.5 Xây dựng tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà

- Tương quan giữa chỉ số tăng trọng chuột và chỉ số tăng bạch cầu

- Tương quan giữa các kết quả xác định hàm lượng, hoạt tính của PT với

số lượng bạch cầu chuột

- Tương quan giữa số lượng vi khuẩn và nồng độ endotoxin với tăng trọng chuột

- Công hiệu của thành phần ho gà trước và sau hấp phụ AlPO4

- Ảnh hưởng của phương pháp bất hoạt và thời gian lưu trữ

™ Đề xuất tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà:

- Đậm độ vi khuẩn (OIU/ml)

- Nồng độ nội độc tố (EU/ml)

- Hàm lượng kháng nguyên PT tính bằng μg/ml (pp ELISA)

- Hoạt tính kháng nguyên PT tính bằng μg/ml (ppCHO-K1)

- Chỉ số tăng bạch cầu (LPU)

- Chỉ số tăng trọng chuột (%)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1 Xây dựng các phương pháp xác định độc tố ho gà PT và nội độc tố trong vắcxin ho gà toàn tế bào

3.1.1 Xây dựng và chuẩn hoá phản ứng ELISA định lượng nồng độ PT

3.1.1.1 Tối ưu các điều kiện của phản ứng ELISA

- Nồng độ fetuin tối ưu: 25μg/ml

- Nồng độ kháng thể thỏ kháng PT: 1/500

- Cộ ng hợp phù hợp cho hệ ELISA -fetuin: Cộng hợp kháng thỏ gắn

Biotin và SBC 1/5000

3.1.1.2 Xây dựng đường chuẩn

Khoảng tuyến tính có OD từ 0,1-1,4 tương đương nồng độ PT trong mẫu thử từ 0,03μg/ml đến 0,25 μg/ml (hình 3-3)

Hình 3 -3 Đồ thị đường chuẩn của phản ứng

3.1.1.2 Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng:

LOD của phản ứng có OD là 0,090255 và LOQ có OD tương đương 0,1416 Dựa theo đường chuẩn độ nhạy của phản ứng là 0,025 μg/ml

3.1.1.3 Kết quả xác định tính đặc hiệu:

Mật độ quang của mẫu thử không có PT tương đương với mật độ quang

nền (mẫu trắng) Nếu mẫu thử có PT có mật độ quang cao gấp trên 20 lần mật độ quang nền

-1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4

3.1.1.4 Độ chính xác và độ đúng của phương pháp ELISA

™ Độ chính xác: Hệ số biến thiên trung bình:

- Trong cùng phản ứng : CV= 12,74%

- Giữa các lần thực hiện phản ứng: CV= 7,67%

™ Độ đúng: Tỷ lệ phục hồi: trung bình 98,11%

3.1.1.5 Xử lý mẫu và ảnh hưởng của mẫu khơng tinh khiết đến tính ổn định của phương pháp

- Xử lý mẫu bằng đồng hố, sau đĩ ly tâm 10000 rpm Hàm lượng PT trong mẫu được đồng hĩa luơn cao hơn mẫu khơng được đồng hố

- Trong điều kiện bình thường với các mẫu thử không tinh khiết (PM 46

Ỉ 48) và canh khuẩn ho gà (BP134: 1306, BP 134: 3306 và BP509: 1406) Phương pháp cĩ tính ổn định đạt yêu cầu độ chính xác và độ đúng (CV=3,17 % , tỷ lệ phục hồi của tất cả các mẫu đạt > 90% trung bình đạt 94,55%.)

3.1.2 Kết quả xây dựng và chuẩn hố phương pháp chuẩn độ độc tố ho

gà PT hoạt động trên tế bào CHO –K1

3.1.2.1 Tối ưu hố các điều kiện cho phản ứng CHO –K1

- Mơi trường nuơi tế bào: Mơi trường EMEM cĩ 10% huyết thanh bào

thai bê hay cĩ 5% huyết thanh bào thai bê và 10% Glutamin thuận lợi cho

tế bào CHO-K1 phát triển

- Số lượng tế bào trong phản ứng chuẩn độ: 106 tế bào/ml

- Thời gian gây nhiễm: thời gian gây nhiễm 72h cho thấy tế bào cĩ hình

thái đặc hiệu nhất Cho tế bào cùng lúc chuẩn độ hay cho trước khi chuẩn

độ 24h đều cĩ kết quả như nhau

3.1.2.2.Tính đặc hiệu của độc tố ho gà tác động trên tế bào CHO–K1

Tính đặc hiệu thể hiện bằng sự biến đổi đặc hiệu hình thái của tế bào khi được tiếp xúc với độc tố ho gà hoạt động hoặc vi khuẩn ho gà độc Hiệu quả này khơng xảy ra khi tế bào tiếp xúc với các vi khuẩn khác hay các

khỏng nguyờn khỏc của ho gà hoặc khi độc tố PT hoạt động bị trung hoà bới khỏng huyết thanh ho gà toàn phần ( bảng 3-11 và 3-12)

Bảng 3-11 Tỏc động của một số chủng vi khuẩn trờn tế bào CHO-K1

Mẫu thử Biến đổi hỡnh thỏi tế bào

(+): tế bào bị tác động đặc hiệu (-) tế bào bình thường

Bảng 3-12 Ảnh hưởng đặc hiệu của độc tố ho gà trờn tế bào CHO –K1

Mẫu thử Biến đổi hỡnh thỏi tế bào

Anti pertussis serum 89/530

AGG-2 serum 89/598

3.1.2.4 Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp

™ Độ chính xác: Hệ số biến thiên trung bình:

- Trong cùng phản ứng : CV= 2,8 %

- Giữa các lần thực hiện phản ứng: CV= 15,03%

™ Độ đúng: Tỷ lệ phục hồi: trung bình 114,,9%

™ Phương pháp đạt tính ổn định với các mẫu thử ho gà (PM) khác nhau (CV%= 7,8 , tỷ lệ phục hồi = 94,23%)

3.1.3 Kết quả xây dựng và chuẩn hố phương pháp xác định yếu tố kích hoạt tăng lympho bào (LPF) trên chuột nhắt trắng

3.1.3.1.Chuẩn hố qui trình thử nghiệm

™ Tiêu chuẩn của chuột thí nghiệm

Số lượng bạch cầu máu ngọai vi trung bình của chuột nhắt trưởng thành, giống đực, 15-17g/con, 4-5 tuần tuổi, cùng lứa, khoẻ mạnh là 4651,94 ± 1330,66 BC/mm3 (hình 3-10)

™ Chọn đường tiêm và thời gian lấy máu

Số lượng bạch cầu tăng cao nhất vào ngày thứ 5 và 6 tuỳ theo đường tiêm Duy trì ổn định 4-5 ngày sau đĩ và giảm từ từ đến ngày thứ 21 thì bình thường Đường tiêm tĩnh mạch cho thấy bach cầu tăng cao nhất nhưng kém ổn định hơn 2 đường tiêm dưới da và phúc mạc (hình 3-11)

Hỡnh 3-11 Thời gian gõy tăng bạch cầu - ảnh hưởng của đường tiờm

3.1.3.2.Tớnh ổn định của qui trỡnh thử nghiệm

Qui trỡnh cú tớnh ổn định cao khi lặp lại thử nghiệm 11 lần với mẫu thử là vắcxin PU 585 (CV=10,13%) và nước muối sinh lý (CV=13,91%)

3.1.3.3.Tiờu chuẩn của mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn được chọn là RP5 Độ pha loóng tương thớch là 1/17

(5,1 OIU/ml)

Bảng 3-21 So sỏnh 2 mẫu chuẩn PU 585 và RP5

Mẫu chuẩn

PU 585 RP5

Đậm độ 1/10 (5 OIU/ml) 1/17 (5,1 OIU/ml)

SL bạch cầu /mm3

46 158,51± 4 677,95

47061,44 ± 4899,34

3.2 Xây dựng tiêu chuẩn pha vắcxin ho gà

3.2.1 Tương quan giữa chỉ số tăng trọng chuột và chỉ số tăng BC

Khảo sát chỉ số tăng bạch cầu của 3 nhóm vắcxin ho gà chưa hấp phụ dựa vào kết quả tăng trọng chuột cho thấy có sự liên quan giữa 2 chỉ số trên Ở nhóm vắcxin có kết quả tăng trọng chuột đạt trên 80% (trung bình 87,44%

± 4,26%) có chỉ số tăng bạch cầu trung bình 3,39 ± 0,56 Ở nhóm vắcxin

có kết quả tăng trong từ 70 -79% (trung bình 75,71% ± 2,52%) có chỉ số