Phân lập một số chủng nấm đảm có khả năng sinh laccase và nghiên cứu tiềm năng ứng dụng laccase trong oxy hóa các hợp chất s phenolic và một số hợp chất ô nhiễm vòng thơm

VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌCĐÈ TÀI : Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NÁM ĐẢM CÓ KHẢ NĂNG SINH LACCASE VÀ NGHIÊN cúv TIÊM NÀNG ÚNG DỤNG LACCASE TR

VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐÈ TÀI :

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NÁM ĐẢM CÓ KHẢ NĂNG SINH

LACCASE VÀ NGHIÊN cúv TIÊM NÀNG ÚNG DỤNG LACCASE

TRONG OXY HÓA CÁC HỢP CHÁT S-PHENOLIC VÀ MỘT SÓ HỢP

CHÁT Ô NHIỄM VÒNG THOM

Người hưÓTĩg dẫn: ThS Đào Thị Ngọc Ánh

Sinh viên thực tập: Bùi Thế Son

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới ThS Đào Thị Ngọc Ánh, PGS TS Đặng Thị cẩm Hà, TS Đinh Thị Thu Hằng ThS Phùng Khắc Huy Chú, đã chì bào, quan tâm hướng dần và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Đồng thời, tôi cũng xin lời càm ơn tới KS Nguyễn Duy Trung, NCS Nguyễn Thị Lan Anh KS Trằn Thị Thu Hiền, KS Nguyền Hải Vân cùng các anh chị cán bộ cùa nhóm nghiên cứu các nghiên cứu sinh và các bạn sinh viên đang công tác và học tập tại phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường đã tận tình giúp dữ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mớ

Hà Nội, những người thầy đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ bản, quý báu trong ' / Tiiu Viện Vỉẹn Đại nọc MOTTa iNoi

quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn bố mẹ, anh chị, những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên, giúp đờ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần trong thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2015Sinh viên

Bùi Thế Sơn

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 10

1.1 Laccase 10

I I I Tống quan về laccase 10

1.1.2 Cơ chế xúc tác cùa laccase 13

1.1.3 Một so tính chất hóa sinh của laccase 16

1.1.4 ú’ng dụng của laccase 16

1.2 Oxy hóa họp chất S-phenolic hỏi laccase 17

1.3 Nghiên cứu sử dụng laccase loại màu thuốc nhuộm 19

1.3.1 Thuốc nhuộm 19

1.3.2 Nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm bời laccase từ vi sinh vật 21

1.4 Nghiên cún phân huy các chất diệt cỏ , 23

inir vien Vìẹn Đặĩ nọc Mỡ Hà NỘI 1.4.2 Chất diệt có 2.4.5-T 23

1.4.2 Sử dụng vi sinh vật sinh laccase và laccase đê phân hủy chất diệt có 24

CHUÔNG 2: VẶT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP 27

2.1 Vật liệu 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Thiết bị máy móc 27

2.2 Phuong pháp phân lập nấm đăm có khả năng sinh laccase 27

2.3 Phuong pháp xác định hoạt tính laccase 28

2.4 Xác định khả năng sinh laccase của các chủng thuần khiết 29

2.5 Đánh giá khả năng oxy hóa CO' chất S-phenolic bằng dịch enzyme thô 30

2.6 Đánh giá khả năng loại màu bằng dịch enzyme thô 30

2.7 Đánh giá khả năng phân hủy 2,4,5 - T băng dịch enzyme thô 31

CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập các chủng nấm 32

3.2 Khảo sát khả năng sinh tống họp laccase của các chủng nấm 34

3.3 Khả năng oxy hóa CO’ chất S-phenolic bằng dịch enzyme thô 37

3.4 Khả năng loại màu thuốc nhuộm bang dịch enzyme thô 40

3.6 Khả năng phân hủy 2,4,5-T bằng dịch enzyme thô của FAL1 46

KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

Tài liệu tham khảo 50

Phụ lục 53

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Danh mục các ký hiệu và thuật ngữ viết tắt

dl-PCBs các polychlorinated biphenyl đồng phang

DRCs Dioxins and Related Compounds

PCDDs polychlorinated dibenzo-p-dioxin , gọi tắt là dioxin PCDFs polychlorinated dibenzofuran , gọi tat là furan

ppm parts per million (là đơn vị đo các mật độ tương đối thấp) RBBR Rcmazol Brilliant Blue

TCDD Tetra-chloro Dibenzo-dioxin

TNT Trinitrotoluene

VLA Violuric Acid

Danh mục các băng và hình minh họa

Bảng 1 Một số vi sinh vật có khá năng sinh laccase/ laccase-like 11

Băng 3.1 Hình thái khuẩn lạc 10 chúng thuần khiết 32

Thư viên Vjện Đạị hoc Mở Hà Nôi Bảng 3.2 Hoạt tính laccase cùa hai mâu M và mâu c sau 5 ngày theo dõi 47

Hình 1.1 Hình ánh chung về không gian 3 chiều của laccase 12

Hình 1.2 Trung tâm hoạt động của laccase 13

Hình 1.3 Cơ chế xúc tác cùa laccase 14

Hình 1.4 Các kiếu xúc tác cùa laccase 15

Hình 1.5 Cấu trúc một số chất thuộc nhóm S-phenolic 19

Hình 1.6 Cấu trúc một số loại thuốc nhuộm 20

Hình 1.7 Cấu trúc chất diệt cỏ 2,4,5-T 23

Hình 3.1 Hoạt tính laccase cùa các chủng nấm nuôi cay trên môi trường PDB 35

Hình 3.1 Hoạt tính laccase của các chùng nấm nuôi cấy trên môi trường TSH1 35

Hình 3.3 Ket quà oxy hóa cơ chất sinapic acid cúa 6 chủng nấm nghiên cứu 39

Hình 3.4 Kết quà oxy hóa cơ chất acetonsyringone cứa 6 chúng nấm nghiên cứu 39

Hình 3.5 Kct qua oxy hóa cơ chất syringaldehyde của 6 chung nam nghiên cứu 40

Hình 3.6 Ket quả loại màu Methyl Orange cùa 6 chung nam nghiên cứu 41

Hình 3.7 Khá năng loại màu Methyl Orange của 6 chúng nấm nghiên cứu 41

Hình 3.8 Ket quã loại màu RBBR cúa 6 chùng nấm nghiên cứu 42

Hình 3.9 Khả năng loại màu RBBR cùa 6 chúng nấm nghiên cứu 42

Hình 3.10 Ket quà loại màu Evans Blue cùa 6 chủng nấm nghiên cứu 43

Hình 3.11 Khâ năng loại màu Evans Blue cùa 6 chùng nấm nghiên cứu 43

Hình 3.14 Sự thay đối màu giữa mẫu c và mầu chứa dịch laccase thô cùa FAL11 sau 24h thí nghiệm 45

Hình 3.15 Kct quả quét pho UV-VIS cùa mẫu M và mẫu đối chứng 46

xrí lệp Dd hpCjMi? Ha Nội Hình 3.16 Kêt quà quét phô UV-VIS cúa mâu M và mâu đôi chứng c 47

MỞ ĐẦU

Sự ô nhiễm môi trường hiện nay ngày càng nghiêm trọng do các hoạt động sàn xuất công nghiệp của con người Đặc biệt có những hợp chất hữu cơ rất bền vững, độc hại và khó phân hủy sinh ra từ các hoạt động công nghiệp (như nước thài màu thuốc nhuộm) hoặc là hệ quả từ chiến tranh (như chất diệt cỏ/ dioxin) v.v Việc xử lý những chất ô nhiễm này bằng các phương pháp hóa học, lý học hay hóa-lý đều cho thấy những hạn chế như chi phí cao, tốn kém, hiệu quá chưa cao, chưa phân húy triệt để, dễ tạo ra các sàn phẩm phụ còn độ độc cao, khó phân hủy gây nguy cơ ô nhiễm thứ cấp.Gần đây, với sự phát triên không ngừng của công nghệ sinh học, phương pháp phân húy sinh học sứ dụng các loại enzyme đang trở thành công cụ xứ lý hiệu quá cao, chi phí thấp và đặc biệt rất thân thiện với môi trường Trong các enzyme hiện đang nghiên cứu và ứng dụng vào xứ lý ô nhiễm môi trường hiện nay, hướng nghiên cứu enzyme ngoại bào như laccase, manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP)

từ các chủng vi sinl^-p^ dã dựợc qụạn tâựỊ ^0 ttn^ jXijc tạc l^iqng đặc hiệu của các enzyme này, đặc biệt là laccase bới phô cơ chât rât rộng cùa nó Laccase cùng MnP và LiP đã được chứng minh có khả năng phân hủy dioxin, PAH, các thuốc nhuộm màu v.v [3] Ngoài ra, laccase còn được sừ dụng trong nhiều lình vực khác nhau, một trong

số đó là tham gia quá trình chuyến hóa sinh khối thực vật nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho sàn xuất các cụm hóa chất kiến tạo Do đó phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh ra các loại enzyme trên đã được nhiều nhà nghiên cứu thực hiện,

các hợp chất S-phenolic và một số hợp chất ô nhiễm vòng thơm” đã được tiến hành với nội dung như sau:

- Phân lập các chủng nam sinh tống hợp laccase từ một số địa phương

- Đánh giá khả năng oxy hóa các hợp chất S-phcnolic của laccase từ các chủng nấm phân lập được

- Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của laccase thô từ các chủng nam trên

- Đánh giá khã năng phân hùy chất diệt cỏ 2.4.5-T cùa laccase thô sinh tồng hợp từ chùng đại diện

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

CHƯƠNG 1: TÓNG QUAN TÀI LIỆU

Trong phân tử laccase có chứa 4 nguyên tứ đồng có khă năng oxy hóa cơ chất

sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn các enzyme khác, laccase có phô cơ chất rất đa dạng bao gồm diphenol, polyphenol, các dần xuất phenol, diamine, amin thơm, benzenthiol, dioxin và thậm chí cà các hợp chất vô cơ như iot [3]

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Laccase là một enzyme phổ biến trong tự nhiên, được tìm thấy ớ rất nhiều các loại cây, nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn, đóng nhiều vai trò trong quá trình sống của sinh vật [11] Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tứ tính chất glycosyl hóa và tính chất động học [2],

Laccase của từng loại vi sinh vật thì có một số đặc tính riêng biệt khác nhau Cho đến nay laccase ở vi khuân rất ít được tìm thay nhưng trong những nghiên cứu gần đây về bộ gene của vi khuân đã cho thấy laccase có thê được phân bố rộng rãi trong vi khuẩn [4], Ngoài ra một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces cũng có khá năng sinh tông hợp laccase đã được phân lập trong những năm gần đây như s coelicolor, s

psamoticus [25],

Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng như ứng dụng của laccase chủ yếu trên đối tượng nấm lớn, các đối tượng như nấm sợi, xạ khuấn và vi khuẩn chưa được nghiên cứu nhiều Một số vi sinh vật có khá năng sinh laccase và laccase-like (thuộc nhóm

enzyme oxy hóa đa nhân đồng có phổ cơ chất đa dạng và bản chất tương tự laccase) được miêu tả ở bảng 1.

Bảng 1 Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase/ laccase-like

Nấm đảm Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuấn

Phanerochaete

chryosponrium

Melanocarpus albomyces

Streptomyces lavendulae

Bacillus licheniformis Pycnoporus

cinnabarinus

Fusarium oxysporum

Streptomyces pasmmoticus

Bacillus halodurans

Rhizotononia solani Aspergillus

nidulans

Streptomyces viridosporus

Thermus thermophilus Trametes vesicolor Trichoderma

harzianum

Streptomyces coelicolor

Bacillus subtilis

Trametes solani Aspergillus niger

Lentinula edodes 'Ị Aỹpergiệịu\r^iệ)i,i học Mở Hà Ni i

Tuy nhiên, ớ nấm thì laccase được nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ nhiều đại diện thuộc 3 ngành nấm là: Ascomycetes, Deuteromycetes và

Basidiomycetes Cho đến nay, có hơn 100 đoạn gene mã hóa cho laccase được phân

lập, nhưng chi có khoáng gần 20 gene mã hóa cho các protein cụ thể được xác định, chủ yếu trong số này là của nấm đàm [27] Phân tử laccase thường gồm một chuỗi peptide, chi một số loại laccase có nhiều chuồi peptide, khối lượng phân tứ dao động ưong khoảng 60 đến 100 kDa Phần lớn laccase của nấm có bán chất glucoprotein với hàm lượng cacbonhydrat chiếm khoáng 10 - 25% [5]

Tuy vậy, tất cà laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: Loại 1 (Tl), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện

tử Các nguyên tứ đồng TI và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phố điện tử

mạnh, trong khi cặp nguyên tứ đồng T3 không tạo phố điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh |2][3).

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, ccó khối lượng tương đối bàng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác cùa laccase (hình 1.1) Bốn nguyên từ đồng trong laccase cũng khác nhau về các tính chất

về cộng hường từ tùy vị trí của chúng trong enzyme Vị trí liên kết với cơ chất nam ở khe giữa vùng B và vùng c trung tâm của một nguyên tứ đồng nằm ở vùng c và trung tâm ba nguyên tử đồng nam ở bề mặt chung của vùng A và vùng c Trung tâm đồng một nguyên tử chi chứa một nguyên tứ đồng TI, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein Liên kết giữa nguyên tử đồng TI với nguyên tư lưu huỳnh cùa cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ớ bước sóng 600 nm tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng Trung tâm đồng ba nguyên tứ có nguyên

tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3 Nguyên tứ đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bão thú trong khi các nguyên tứ đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bão thủ [3] (hình 12) Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 1.1 Hình ảnh chung về không gian 3 chiều của laccase Tiếu phần A, B c được kí hiệu

đó, xanh lá cây và xanh nước biến

Thư viên Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 1.2 Trung tâm hoạt động cúa laccase

1.1.2 Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là enzyme oxy hóa khử có khá năng oxy hóa diphenol và các hợp chất

có liên quan, sử dụng oxy phân từ làm chất nhận điện tứ Khác với phần lớn các loại enzyme khác, laccase có phố đặc hiệu cơ chất khá rộng Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất

và nguyên tử đồng TI thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh lệch giữa the oxy-hóa khứ giữa cơ chất và enzyme Các đại lượng này phụ thuộc cấu trúc hóa học cùa cơ chất Thế oxy hóa khử cùa laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V Cơ chất khử bị mất một điện từ nhờ xúc tác laccase thường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bới chính laccase đó hoặc tiếp tục các phán ứng không cần xúc tác enzyme như hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa |2|

Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tứ (Tl) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa

cơ chất Cơ chất chuyên một diện tứ cho nguyên tử đồng TI biến nguyên tử đồng TI (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tứ laccase có cá 4 nguyên tử đồng đều ớ trạng thái khử (Cu+) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tứ đồng TI sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bào thú His-Cys-His Phân tứ oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khứ thành nước

Hình 1.3 Cơ chế xúc.tác-cúa laccase Ọ1

Ngoài ra cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bời trung tâm hoạt động do

4 nguyên từ đồng đám nhiệm Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phán ứng cũa phân tứ laccase Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian (mediator) Hợp chất hóa học này có thê tiếp xúc với trung tâm phán ứng của laccase

và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do Sau đó mediator ở dạng oxy hoá nhận một điện tử của cơ chất và trờ thành khứ, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xác tác Ngược lại, laccase sau khi cho mediator một điện tứ thì trở thành dạng khử, và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình 1.4) Các mediator thường phù hợp cho laccase là 3-Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino- bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), N-hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-

hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid ( VLA) v.v Sự tham gia của mediator đã làm tăng phố cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase.

Hình 1.4 Các kiêu xúc tác của laccase

(a) Chu kỳ xúc tác không có sự tham gia của các mediator

(b) Chu kỳ xúc tác với sự tham gia cùa các mediatorCác chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azide, cyanide, fluoride Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), acid béo tropolone acid kojic và acid coumaric, nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn Các hợp chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng được coi là các chất ức chế laccase [21131

1.1.3 Một số tính chất hóa sinh của laccase

Hang so Michaelis-Mesten (Km) của laccase dao động trong giới hạn khá rộng, trong khoáng 2 -500 pM phụ thuộc vào nguồn enzyme và cơ chất Hằng số này chính

là đặc trưng cho hoạt tính xúc tác cúa enzyme |3|

Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4-6 đối với cơ chất phenolic Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính cùa laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là hydroxyt đã ức chế laccase Mặt khác tăng pH còn làm giám thế oxy hóa - khử của các cơ chat phenolic nên phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn Do vậy hoạt tính laccase ớ các pH khác nhau là kết quá cùa hai tác dụng đối lập của pH là

sự tăng chênh lệch thế oxy hóa - khứ laccase - cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxyt Đối với các cơ chất không phải phenolic như ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyến ion, do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2-3 Ngược lại, tính bền cúa laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nam trong khoáng 8-9 [3]

Tnu viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Độ bền nhiệt của laccase phụ thuộc vào vi sinh vật mà nó sinh ra Thông thường laccase bền nhiệt ớ nhiệt độ từ 30-50°C và mất hoạt tính rất nhanh khi nhiệt độ lên tới trên 50°C[2][3] Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chú yếu từ các loài thuộc sinh vật nhân sơ Laccase có nguồn gốc từ nấm thì thời gian bán húy cùa nó thường nhó hơn

đề phân giãi chất độc trong nước thái các ngành công nghiệp kể trên, như là sản xuất giấy, dệt may, hóa dầu, tống hợp polymer, sán xuất rượu và nước giái khát v.v Ngoài

ra, laccase cũng đã được nghiên cứu để ứng dụng đề sản xuất thuốc chổng ung thư, và

là một thành phần trong inỹ phẩm [3JL27J

Laccase cũng có tiềm năng cao trong công nghệ nano sinh học để tạo các biosensor có độ nhạy cao Laccase còn được sử dụng đế tham gia phân hủy các hợp chất lignocellulose, các hợp chất phenol phát thãi từ hoạt động hóa dầu, sàn xuất các hợp chất hữu cơ, và các chất ô nhiễm khó phân hùy thông qua quá trình oxy hóa khứ Laccase được cố định trên các vật liệu mang và hệ thống laccase - chất gắn kết tở ra hiệu quà trong việc chuyến hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợp chất dẫn xuất

do phenol khác như hợp chat PAH, PCB, thuốc nố TNT trong khai khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu DDT HCH v.v, thuốc diệt có (2,4-D, 2,4,5-T) dùng trong nông nghiệp[3][21][27J

1.2 Oxy hóa họp chất S-phenolic bởi laccase

Laccase xúc tác cho quá trình oxy hóa nhiều cơ chat phenol và các hợp chất 4;ảTblỉ vien Vien Dai,hoc Mo'HJJNqi _ , , thơm khác dưới điêu kiện có oxy không khí Laccase tư nâm, đặc biệt từ các chủng

nấm đàm Basidiomycetes tỏ ra có nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học dựa trên

phố rộng các cơ chất có thể bị oxy hóa tại vùng tiểu phần cùa nguyên từ Cu T| Nó oxy hóa mạnh một số thành phần phenolic có nguồn gốc từ lignocellulose, góp phần tham gia chuyển hóa phế phầm từ thực vật, hoặc có thể được dùng đề loại màu nước thải từ công nghiệp dệt nhuộm 112]

Sự phân húy sinh học lignin là 1 quá trình oxy hóa bởi nấm đảm, bẻ gãy liên kết Aryl-ete (0-0-4) và oxy hóa phân hủy chuồi cạnh bên của p-hydroxyphenyl (H) guaiacyl (G) and syringyl (S) các tiểu phần lignin, tạo ra các sản phẩm phenolic (acids, ketones and aldehydes) Một vài chất trong số chúng (như acetosyringone, syringaldehyde, p-hydroxy-cinnamic acids, v.v) có thẻ đóng vai trò như chất gắn kết tự nhiên của laccase Trong quá trình oxy hóa, các cơ chất phenolic này thúc đẩy hoạt động oxy hóa polymer lignin của chính chúng, và nhiều hợp chất vòng thơm khó phân húy Trong những phát hiện gần đây, các nhà khoa học đã nhấn mạnh về tiềm năng

công nghệ sinh học cao của laccase nấm và những mediator tự nhiên của chúng để cải thiện khả năng chuyển hóa phế phẩm của thực vật trong công nghệ hiện dại xứ lí lignin Hơn nữa, sinapic acid, acetosyringone và các thành phần khác có hoạt tính sinh học với các đặc tính kháng khuẩn và chống oxy hóa, có thể được dùng để bố sung các đặc tính mới cho cellulose và sợi gồ, xúc tác bởi laccase Các thành phần phenolic khác

có thể được chiết xuất từ lignin gỗ như syringaldehyde hoặc vanillin cung cấp mùi thơm, vị hoặc dùng là một hóa chất chuấn đoán trong y học [ 121-

Các thí nghiệm đo màu dựa trên sự oxy hóa các thành phan phenolic có liên quan tới các tiểu phần S-lignin đã được Isabel Pardo và cộng sự nghiên cứu Các thành phần này, vốn là cơ chất tự nhiên cùa laccase, có thế là mấu chốt trong sự phân hủy lignocellulose dựa vào mối liên kết giữa carbonhydrats và lignin ờ thành tế bào thứ cấp

ở cỏ; hoặc được sứ dụng làm chất gắn kết hiệu quá nâng cao khả năng phân húy các chất gây ô nhiễm và polymer phức hợp Khả năng chuyển hóa các cơ chất S-phenolic này càng tốt, thì càng chứng tỏ đặc tính oxy hóa sinh học càng cao của laccase sinh tổng hợp từ vi sinh Nọi

Các hợp chất S-phenolic được sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc các dòng laccase đột biến theo hướng ứng dụng trong phân húy lignocellulose đã được tiến hành Phương pháp này giúp giảm thiều thời gian cũng như tập trung khư trú thắng vào mục đích nhằm sàng lọc nhanh chủng vi sinh vật sinh laccase có khả năng tham gia vào quá trình phân hủy lignocellulose L12] Ba chất thuộc nhóm S-phenolic được sử dụng là sinapic acid, acetosyringone, syringaldehydc, cấu trúc cùa ba chất này được thế hiện tại hình 1.5

Sinapic acid Acetosyringone Syringaldehyde

Hình 1.5 Cấu trúc một số chất thuộc nhóm S-phenolic

1.3 Nghiên cứu sử dụng laccase loại niàu thuốc nhuộm

1.3.1 Thuốc nhuộm

Thuốc nhuộm là những chất hữu cơ có màu hấp thụ mạnh một phần nhất định cùa quang phô ánh sáng nhìn thấy và có khá năng gắn kết vào các vật liệu dệt Thuốc nhuộm có thế có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tồng hợp Hiện nay, con người hầu như chi sư dụng thuôc nhuộm tông hợp Đặc diêm nôi bật cua các loại thuôc nhuộm là độ bền màu - tính chất không bị phân hùy bởi điều kiện, tác động khác nhau cùa môi trường, đây vừa là yêu cầu với thuốc nhuộm lại vừa là vấn đề với xử lí nước thài dệt nhuộm Màu sắc cùa thuốc nhuộm có được là do cấu trúc hóa học cùa nó Một cách chung nhất, phân tứ thuốc nhuộm bao gồm các nhóm mang màu và nhóm trợ màu.Nhóm mang màu là những nhóm có các nối đôi liên hợp với hệ điện tử TT linh động như

>c=c<, >C=N-, -COOH -OH, -N=N-, v.v Nhóm trợ màu là nhóm thế cho hoặc nhận

điện tử như -SOH, -COOH, -OH, -NH2, v.v đóng vai trò tăng cường màu cùa nhóm mang màu bàng cách dịch chuyển năng lượng của hệ điện tử [ 11(31- Một số thuốc nhuộm màu được sử dụng như chất màu tiêu chuân cho nghiên cứu khã năng loại màu bởi vi sinh vật nói chung và laccase nói riêng như Methyl Orange (470 nin), Evans Blue (605 nm) and Remazol Brilliant Blue (640 nm) [I2| (Hình 1.3)

Methyl Orange Remazol Brilliant Blue

Evans Blue

Hình 1.6 Can trúc một so loại thuốc nhuộm

Nước thải màu sinh ra chủ yếu từ các ngành công nghiệp như sàn xuất thuốc nhuộm, dệt nhuộm, in ấn Nước thải màu từ công nghiệp dệt là hỗn hợp cúa các công đoạn hồ sợi, nấu tay, tay trang, làm bóng sợi, nhuộm in và hoàn tất Hai phần trăm màu được tạo ra bị thất thoát trực tiếp vào nguồn nước và hơn 10% sau đó bị mất mát trong quá trình nhuộm màu vãi Những hợp chất nêu trên đã thành vấn đề quan tâm trong hoạt động bảo vệ môi trường [30] Ước tính có hơn 10.000 thuốc nhuộm và chất màu khác nhau thường được sử dụng Tổng sản lượng màu hữu cơ của thế giới lên tới hơn 100.000 tấn/năm số lượng lớn thuốc nhuộm trong công nghiệp dệt thải vào môi trường do khá năng hấp thụ kém của chúng vào sợi vái [16]

Các nhóm màu khác nhau như azo, triphenylmethan và phthalocyanine đã làm cho màu của thuốc nhuộm có cấu trúc đa dạng Ngoài ành hường đến thị giác và tác động bất lợi do nhu cầu oxy hóa học cùa màu thuốc nhuộm, nhiều loại màu tổng hợp còn thể hiện tính độc, gây ung thư và đột biến gene Đặc biệt là các màu tồng hợp có lưu huỳnh và các sản phâm phân húy liên quan đen chúng có chứa các nguyên tố cấu trúc, đặc tính chưa được biết rõ hay rất hiếm trong tự nhiên; chúng không chi có ánh hướng xấu đến thấm mỹ mà còn kháng lại sự tấn công của vi sinh vật và tăng tính độc của nước và đất [29] Khi đi vào nguồn nước nhận như sông, hồ v.v với một nồng độ rất nhó thuốc nhuộm đã cho câm nhận về màu sắc Thuốc nhuộm thải ra càng nhiều thì màu nước càng đậm Màu cùa nước thài càn trở sự hô hấp, sinh trưởng của các loài thúy sinh vật Nó tác động xấu đến khá năng phân giãi của vi sinh đối với các chất hữu

cơ trong nước thải

1.3.2 Nghiên cún loại màu thuốc nhuộm bởi laccase từ vi sinh vật

Trong số nhiều cơ chế sinh học loại bò màu đã được đăng tải trong các tạp chí

< Thư vien Viẹn Daj 11OC Mợ ỊĨỌiọi * , ,khoa học thì hâp phụ sinh học kêt hợp với phân húy sinh học dường như có tiêm năng lớn cho áp dụng quy mô công nghiệp Vi khuẩn phân húy những màu này cần có sự tham gia của enzyme nội bào trong khi nấm phân húy chúng bàng các enzyme ngoại bào [30] Ngày nay, hầu hết nghiên cứu liên quan đến phân hủy đều tập trung vào loài nấm đăm Phanerochaete chrysosporiuin nó được biết đến với khá năng khoáng hóa một phạm vi lớn các hợp chất khó phân húy

Một số loài nấm sợi khác nhau thuộc chi Aspergillus đã được chứng minh khá năng loại được nhiều màu khác nhau Chúng Aspergillus sojae B10 có khả năng loại màu azo amaranth, Congo red và sudan III trong môi trường nghèo nitơ sau 3-5 ngày nuôi cấy [1] Nghiên cứu cũng chứng minh được khã năng loại màu của chúng

Aspergillus alliaceus 121C với hai màu indigo và Congo đỏ cho hiệu quả rất tốt sau 9

ngày nuôi cấy Nấm sợi Aspergillus ochraceus NCIM-1146 thể hiện hiệu quà loại màu thuốc nhuộm màu xanh lục và xanh cotton khi sừ dụng hệ sợi của nấm sau khi nuôi cấy

96 h [1] A ochraceus NCIM-1146 cũng có khá năng phân húy màu thuốc nhuộm xanh

hòa bình đậm 25 khá tốt Chúng Pinicillium ochorochloron MTCC 517 trong quá trình phân hùy màu sinh học màu xanh triphenylmethan ngoài sinh LiP loài nấm này còn sinh laccase, mà không thay sự xuất hiện của enzyme ngoại bào MnP [ 1 ].

Rất ít nghiên cứu thực hiện xử lý loại màu bới nấm men Chi tìm thấy một vài đại diện nấm men Ascomycetous như Candida zeylanoides, c tropicalis,

Debaryomyces polymorphus và Issatchenkia occidentalis thực hiện phân hủy màu bang

hệ enzyme và loại màu các thuốc nhuộm azo khác nhau [1], Loài nấm men

Debaryomyces polymorphus có khà năng loại được 4 màu Reactive Red M-3BE,

Procion Scharlach H-E3G, Procion Marine H-EXL và Reactive Brillant Red K-2BP với hiệu suất loại màu đạt 69-94% [1]

Trên thế giới hiện nay đã có các quy trình xứ lý thuốc nhuộm trong nước thái bang vi sinh vật Laccase từ chủng nấm Polyporus sp SI33 có khả năng phân hủy màu RBBR thành hai sản phẩm nhò là sodium l-amino-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene- 2-sulfonate và sodium 2j((3-aminophenyl)sulfonyl) ethyl sulfate Tuy khối lượng phân

tử cùa những sàn phẩm phân húy nhó hon nhưng độc tính không ít hơn so với hợp chất ban đầu Vì vậy vần cần được tiếp tục nghiên cứu cho đến khi loại bở được hoàn toàn các sản phẩm trung gian nguy hại với sức khỏe con người |9]

Selvam và cộng sự đã công bố hai chủng là Schizophyllum commune và Lenzites eximia có khá năng loại màu từ nước thãi trong công nghiệp nhuộm [22], Trong đó,

chủng Schizophyllum commune loại được 76,15% xử lý theo mé và ở điều kiện xử lý liên tục loại được 55,92%; còn chủng Lenziles eximia loại được lần lượt là 75,23% và 54,60% sau 5 ngày xử lý Một nghiên cứu khác cùa Rani và cộng sự cũng đã sừ dụng chủng nấm Daedalea flavida đã loại bó được 80% màu metani yellow sau 10 ngày với nồng độ ban đầu 50 ppm [20]

ơ nước ta hiện nay các nhà máy dệt nhuộm sứ dụng trên 70% thuốc nhuộm hoạt tính so với các loại thuốc nhuộm khác như phân tán, hoàn nguyên v.v Cho đến thời điềm này vần chưa có công trình xừ lý nước thải nhuộm nào sử dụng vi sinh vật sinh

tổng hợp enzyme hay enzyme thô cố định để xứ lý thuốc nhuộm ở quy mô công nghiệp Nước ta là nước nhiệt đới, có đa dạng vi sinh vật cao và đặc biệt là nam có khả năng sinh tống hợp hệ enzyme oxidorcductase như Lac, LiP và MnP Do đó việc tìm kiếm, phát hiện và khai thác enzyme ngoại bào ở Việt Nam đề xử lý các chất đa vòng thơm trong đó có chất diệt cở/dioxin và thuốc nhuộm sẽ mờ ra triển vọng lớn trong việc làm sạch các chất ô nhiễm giảm bớt tác hại mà chúng gây ra đối với môi trường sống và sức khóe của con người.

1.4 Nghiên cún phân hủy các chất diệt cỏ

1.4.2 Chất diệt cỏ 2,4,5-T

2,4,5- T là tên gọi tat của 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid Công thức hóa học

là C8H5O3C13, khối lượng phân tứ 255,49 g/mol Công thức cấu tạo được thể hiện ớ hình 1.5 2,4,5-T tinh khiết có dạng tinh the rắn, không mùi, từ không màu đen màu vàng nâu nhạt, tan Ỳ|tronạnước^dộh<Ỵi)tan|trong^rỴjrớCjý 3Q"Clà 238 mg/1, tan tốt trong dung môi hữu cơ Tỳ trọng là 1,8 g/cm ờ 20”C Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 154-158°c Thời gian bán hủy trong đất là 15-59 ngày [3]

1.4.2 Sử dụng vi sinh vật sinh laccase và laccase để phân hủy chất diệt cỏ

Trong thập ký qua, các chủng vi sinh vật có khá năng phân hùy chat diệt cỏ/dioxin và các chất tương tự dioxin đã được phân lập và nghiên cứu ngày càng sâu về tính đa dạng, sinh thái và sinh học phân từ của các loài vi sinh vật này Các nghiên cứu chi ra có 4 cơ che phân hủy và chuyến hóa dioxin khác nhau [26]:

(1) Các enzyme hydrocarbon oxygenase oxy hóa cat vòng thơm nhờ các vi sinh vật hiếu khí

(2) Loại halogen cùa các sản pham cắt vòng bởi các vi sinh vật hiếu khí

(3) Phân húy bởi các enzyme ngoại bào như laccase, laccase-like, manganese, peroxidase, lignin peroxidase do vi sinh vật tạo ra

(4) Loại khứ halogen bới các vi sinh vật kỵ khí

Trong 10 năm trớ lại đây, các nghiên cứu về các con đường phân húy dioxin và các chất tương tự dióxin rất đlrợc các nhà khóa học'trên lhế gìớP quan tâm Trong đó quá trình phân hủy bởi các vi sinh vật hiếu khí được nghiên cứu kĩ nhất ở chủng

Spingomonas sp RW1 Hiện nay các con đường phân hùy theo con đường đong trao

đôi chất đã được nghiên cứu ở các chùng vi sinh vật thuộc các chi khác như:

Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Sphingomonas, Terrabacter, Beịịerinkia, Alcaligenees, Klebsiella, Burkholderia,v.v [26].

Nấm sợi, xạ khuấn vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí đã chứng tỏ khã năng phân hủy dịch chiết đất và 2,3,7,8-TCDD Kết quà từ các mẫu đất có bồ sung vi sinh vật đã cho thấy khà năng chúng không chi phân hủy 2,3,7,8-TCDĐ mà còn cả furan Nghiên cứu cũng đã chứng minh khá năng phân húy cùa chúng XKDN1 XKDN19 có the phân húy 85,97% của 333,3 ppt đồng phân 2,3,7,8-TCDD sau 2 tuần nuôi cấy đồng thời, chúng này cũng có khà năng phân hùy 78,7% anthracen và 22,4% fluoranthen sau 3 tuần nuôi cấy [10],

Ngoài cơ chế phân hủy chất diệt có/dioxin và các chất tương tự dioxin bởi các enzyme nội bào tức là phải chuyến các chất độc qua màng tế bào thì cơ thế xúc tác phân hùy các hợp chất đó bàng các enzyme ngoại bào cũng đã được quan tâm, trong đó

có laccase và laccase-like (thuộc nhóm enzyme oxy hóa đa nhân đồng có phố cơ chất

đa dạng và bàn chất tương tự laccase) [26]

Laccase đã được chứng minh là hiệu quâ trong việc loại bỏ các chất độc hại thông qua quá trình oxy hóa, giúp chuyển hóa các chất gây ô nhiễm môi trường, như là dioxin, từ dạng cấu trúc phức tạp về dạng đơn giản hơn và ít độc hơn, thậm chí là hết độc Laccase cố định đang được nghiên cứu và cho thấy có tiềm năng để xử lí các hợp chất phenolic và clo phenolic gây ô nhiễm môi trường Laccase cũng được phát hiện là khá năng chuyển đồi của 2,4,6-trichlorophenol về 2,6-dichloro-l,4-hydroquinol và 2,6- dichloro-1,4-benzoquinone Ngoài ra, các nghiên cứu đã chi ra rằng laccase từ một số chủng nấm đâm có thể được sứ dụng để oxy hóa các anken, carbazole, N- ethylcarbazole, fluorene, và dibenzothiophene trong sự hiện diện của ABTS là chất gắn

k Ật u Ị] Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Isoxaílutole là một loại thuốc diệt cỏ được kích hoạt trong đất và thực vật bởi

sự phát sinh diketonitrile, dạng hoạt động và gây độc của thuốc diệt cò Laccase có thể chuyền hóa diketonilrile thành acid Các báo cáo và nghiên cứu đã chi ra hệ laccase - chất gắn kết tỏ ra hiệu quá trong công nghệ phục hồi sinh học đối với nhóm chất polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) Laccase cũng được sử dụng để giảm thiểu

sự hình thành các hợp chất dị vòng như các thuốc trừ sâu hữu cơ có gốc halogen ở trong đất [3][27]

Các nghiên cứu quốc tế về vi sinh vật sinh laccase ứng dụng trong phân hùy chất diệt cõ/dioxin đã và đang có những bước tiến triến

Các vi sinh vật phân húy 2,4-D đã được tìm thấy trong một số loại đất, bùn, vùng nước hiếu khí gần bề mặt, phân ù, bùn hoạt tính, các hồ, và các sông 2,4-D được chuyến hóa thành 2,4-DCP và sau đó được oxy hóa đến 3,5-dichlocatechol Ryan và Rumbus

thông báo về khoáng hóa 2,4,5-T bới nấm đảm Phanerochaete chtysosporium BKM-F-

1767 trong điều kiện nuôi cấy lõng và trong đất [22], Tuy nhiên, một so nghiên cứu về phân húy 2,4-D và 2,4-DCP bời các vi nấm đã được công bố Đen năm 2005 Vroumsia

và đồng sự mới công bố chi tiết về khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4-DCP bởi

Aspergillus penicilloides, Mortierella isabellina, Chrysosporíum pannorum và Mucor geneevensi [28].

Laccase từ các chúng nấm đám cũng được nghiên cứu khả năng phân hủy các hợp chất có trong thuốc diệt cỏ/dioxin như: 2,4,5-T, 2,3,7,8-TCDD, PCDDs và có được những hiệu quà cao Nấm p Chrysosporium có khà năng khoáng hóa 2,2% 2,3,7,8- TCDD thành co? sau 30 ngày [8]

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

CHƯƠNG 2: VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Dối tượng nghiên cứu

Mau nấm đảm thu thập từ các khu vực khác nhau như rừng Quốc gia Ba Vì, rừng Mã Đà (Đồng Nai), Đồi Thịt Băm - A Lưới (Thừa Thiên Huế), rừng Quốc gia Xuân Sơn - Phú Thọ và Tuyên Quang Mầu được bão quàn và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong 24 giờ, sứ dụng làm nguồn nguyên liệu cho phân lập

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất được sừ dụng để nghiên cứu là các hóa chất tinh khiết, đâm báo chất lượng như: sinapic acid; acetosyringone và syringaldehyde; Methyl Orange; Evans Blue; Remazol Brilliant Blue (RBBR); ABTS; 2,4,5-T v.v được sừ dụng của các hãng như Sigma, Merk v.v Hóa chất sứ dụng trong nuôi cấy vi sinh vật được sán xuất tại Việt Nam và Trung viện Viện Đại học Mở Hà Nội

2.1.3 Thiết bị, máy móc

Các thiết bị, máy móc được sử dụng là cùa Viện Công nghệ sinh học và cùa phòng Công nghệ sinh học Tái tạo môi trường Các thiết bị bao gồm; Box cấy vô trùng Laminar cùa Pháp, Cân kỹ thuật cùa hãng Ohaus, máy đo quang phố hấp thụ Novaspec

II, cân điện tứ, nồi khứ trùng ướt, nồi khử trùng khô, tủ sấy, máy nuôi lắc nhiệt ốn định, tủ nuôi on nhiệt, máy ly tâm, máy chu trình nhiệt, thiết bị phân tích PAH là UV- VIS; GBC-CINTRA4, tủ lạnh các loại 4°c, -20°C, -80°C, lò vi sóng Panasonic và các dụng cụ thí nghiệm khác như: bình tam giác, bình trụ, đầu typ, ống ly tâm micropipet của hãng Eppendorf, v.v

2.2 Phương pháp phân lập nấm đảm có khả năng sinh laccase

Sử dụng môi trường PDA có bổ sung Guaiacol 0.01 % để phân lập Guaiacol dóng vai trò chất chi thị cho sự có mặt của nhóm enzyme ligninolytic (laccase, MnP