Nghiên cứu biểu hiện gen xbx mã hóa xylanase trong e coli sử dụng vector biểu hiện pet 22b(+)

Do enzyme cellulase, hemicellulase hiện nay chưa đáp ứng được yêu cầu công nghiệp về hoạt tính và tốc độ thủy phân, do đó nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đi tìm các enzyme mới có hoạt

BIÉU HIỆN PET-22B(+)

Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực hiện : Chu Thị Khánh Ly

Hà Nội- 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sac tới GS TS Trương Nam Hải, Viện trường Viện công nghệ sinh học và TS Đỗ Thị Huyền, Trường phòng Kỹ thuật di truyền dã tận tình hướng dan, chi hảo và truyền đạt cho

em nhũng kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài Trong quá trình làm việc, các thầy, cô van thường xuyên trao đôi, góp ỷ, đem đến cho em nhũng lời khuyên, những nhận xét, khích lệ quý báu để giúp em hoàn thành công việc.

Với những tình cảm chân thành, em cũng xin được câm ơn sự hướng dan và giúp dỡ cùa toàn thê cán bộ phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt là NCS Nguyễn Thị Thào, NCS Phan Thị Thanh Huyền những người đã hướng dan, ho trợ và chi bào nhiệt tình về chuyên môn và kỹ năng trong suốt quá trình em hoàn thành khỏa luận.

Em cũng xin được bày tỏ sự biết ơn đôi với các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiên thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt bon năm học tập tại trường Lời cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, người thân trong gia đình, bạn bè thân thiết đã giúp đỡ, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và làm việc vừa qua.

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Chu Thị Khánh Ly

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHÀN I: TÔNG QUAN 2

1.1 Xylan 2

1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan 3

1.3 Tổng quan về enzyme xylanase 4

1.3.1 Khái niệm và phân loại xylansac 4

1.3.1.1 Khái niệm 4

1.1.1.1 Phân loại xylanase 5

1.3.2 Cấu trúc của xylanasc 6

1.3.3 Cơ chế xúc tác của xylanase 7

1.3.4 Nguồn xylanase 8

ỉ.3.4.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuân 8

1.3.4.2 Sinh tông họp xylanase từ nấm mốc 9

1.3.5 ứng dụng của xylanase 9

1.3.5.1 Trong công nghiệp sán xuất thức ăn chăn nuôi 10

1.3.5.2 Trong sản xuất bánh 10

1.3.5.3 Trong sản xuất rượu vang 11

1.3.5.4 Trong sàn xuất cồn nhiên liệu 11

1.3.5.5 Trong chất hoạt động bề mặt 11

1.3.5.6 Trong tay trang giày và bột giấy 12

1.4 Tách dòng và biểu hiện gen 12

1.4.1 Vector biếu hiện pET-22b(+) 12

1.4.2 Chủng biểu hiện E coll BL21 13

1.4.3 Các nghiên cứu đã được công bố về biếu hiện xylanase 14

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15

2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid 15

2.1.2 Các loại môi trường nuôi cấy 15

2.1.3 Hóa chất và dung dịch sừdụng 15

2.1.2 ỉ Hóa chất 15

2.1.2.2 Enzyme 16

2.1.2.3 Dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế hào E coli 16 2.1.2.4 Các dung dịch dùng trong điện di DNA trên gel agarose 16

2.1.2.5 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide- SDS 17

2.1.3 Máy móc và thiết bị 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp PCR 17

2.2.2 Biển nạp DNA plasmid vào tế báo E coli bằng phương pháp sốc nhiệt 18 2.2.3 Tách chiết DNA lasmid từ tế bào E coli 19

2.2.4 Điện di DNA trên gel agarose 21

2.2.5 Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế 22

2.2.6 Biếu hiện gen 23

2.2.7 Điện di protein trên gel polyacrylamid - SDS 23

2.2.8 Phá tế bào bằng siêu âm tách pha protein tan và không tan 24

PHẦN III: KẾT QUÀ THÁO LUẬN 25

3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET22xbx 26

3.1.1 Nhân dòng gen xbx mã hóa enzyme xylanase bang kỹ thuật PCR 26

3.1.2 Cắt sản phẩm PCR và vector pET22b(+) bằng Ncoỉ+Xhoỉ 27

3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu hiện pET-22b(+) 27

3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-xbx từ tế bào E coli DH10B 29

3.1.5 Kiểm tra gen xhx trong vector pET-22xbx bằng enzyme hạn chế 30

3.2 Biếu hiện gen xbx trong chủng E coll BL21 31

3.3 Lựa chọn điều kiện biểu hiện 33

3.3.1 Nhiệt độ nuôi cấy chủng trong môi trường có chất cảm úng 33

3.3.2 Lựa chọn nồng độ IPTG 34

KÉT LUẬN 37

KIẾN NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHÁO 39

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẢT

EDTA Ethylene diamine tetra acid acetic

SDS-PAGE SDS-PolyAcrylamid Gel Electrophoresis

E coli Escherichia coll

IPTG Isopropyl p-D-1 -thiogalactopyranosidc

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KỈ8.CNSH 11-02

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần phản ứng PCR 18

Bảng 2 Thành phần phân ứng cắt 22

Bàng 3 Thành phần các chất trong phản ứng nối ghép gen 22

Bảng 4 Bàng giá trị OD600 thu mẫu 34

DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cấu trúc cùa arabinoxylan của cỏ Graminiae 2 Hình 2 Vị trí tấn công cùa các enzym vào xylan của cở [2] 4 Hình 3 Cấu trúc không gian 3 chiều cúa Xylanase họ 10 từ Bacillus halodurans 6 Hình 4 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 7 Hình 5 Sơ đồ vector pET-22b(+) 13 Hình 6 Sơ đồ thí nghiệm thiết kc vector biểu hiện mang gcn xbx 25 Hình 7 Phân tích sản phấm nhân gen xbx bằng kỹ thuật PCR trên gel agarose 0,8% 26 Hình 8 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR và vector pET-22b(+) 27 Hình 9 Đĩa biến nạp pET22-xbx vào tế bào E coli DH10B 28 Hình 10 Phân tích sản phấm tách DNA plasmid pET22-xbx 29 Hình 11 Ket quá điện di sán phẩm cắt kiểm tra gen xbx trong plasmid pET-22b(+)

bang enzyme hạn chế 30

Hình 12 Ket quả biếu hiện protein XBX hr dòng E coli BL2I tái tố hợp 31 Hình 13 Kết quà kiểm tra khả năng tan của protein XBX 32 Hình 14 Phân tích sàn phẩm biếu hiện protein trong E coli BL21 mang gcn xbx ở

MỞ ĐẦU

Hiện nay trên trái đất, mồi nãm thực vật sản sinh ra một lượng sinh khối khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tý tan Tất cả mọi hoạt động cùa con người cũng như các loài động vật đều cần đen thực vật Chúng là nguồn lương thực để nuôi sống con người và động vật đồng thời là nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho các ngành công nghiệp Ngày nay, phế phụ phẩm cúa các ngành nông, lâm nghiệp còn được tận dụng đe chuyến hóa ra nhiều chất có giá trị, điền hình là nhiên liệu sinh học

đề thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày càng cạn kiệt Thành tế bào thực vật có cấu tạo khá vững chắc bời cellulose, hemicellulose và lignin cho nên đế phá hủy một phần hoặc toàn bộ chúng thì người ta thường sử dụng các hóa chất mạnh như axit mạnh hay kiềm mạnh đế loại bở lignin, giải phóng cellulose, hemicellulose Bước tiếp theo, nguồn cellulose, hemicelluloses này can được chuyển hóa thành đường bằng phức hệ enzyme cellulase Đường được tạo thành có thế được dùng để lên men tạo ra các sản phấm như cồn sinh học và các chất khác Do enzyme cellulase, hemicellulase hiện nay chưa đáp ứng được yêu cầu công nghiệp về hoạt tính và tốc

độ thủy phân, do đó nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đi tìm các enzyme mới có hoạt tính sinh học tốt đế làm giảm giá thành sản phấm cuối cùng

Một loại enzym hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm là xylanase Enzym này có khả năng thủy phân hiệu quà các xylan - là thành phần chủ yếu cùa hemicellulose trong thành tế bào thực vật Xylanasc có rất nhiều ứng dụng trong công nghệ che biến giấy và bột giấy, công nghệ thực phấm, công nghiệp sàn xuất thức ăn chăn nuôi, hay ứng dụng trong sàn xuất nhiên liệu sinh hoc (ethanol sinh học) từ phế thải nông nghiệp

Xuất phát từ vấn đề trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

biếu hiện gen xhxs mã hóa xỵlanase trong E coli sử dụng vector biếu hiện pET-22b(+)”

Đồ tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02

PHẦN I: TÓNG QUAN

1.1 Xylan

Xylan, một trong những thành phần cơ bán cùa hemicellulose được tìm thấy trong thành tế bào thực vật, là polysaccharide cơ bán thứ hai sau cellulose [1], Trong thực tế, thành tế bào thực vật là một vật liệu phức tạp trong đó cellulose (35- 50%), hemicellulose (20-30%) - một nhóm cacbonhydrat trong đó dạng xylan là loại chù yếu - và lignin (20-30%) liên kết chặt chẽ với nhau

Xylan là một polysaccharide hồn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc acetyl, 4-O-methyl-D-glucuronosyl và a-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc xylopyranose Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiếu p-l,4-glycozit Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bàng các gốc cùa axit 4-O-methyl-D-glucuronic [2], [3],

Hình 1 Cấu trúc cúa arabinoxylan cúa cở Graminiae

Xylan chiếm khoảng 30% vật liệu cúa thành tế bào cùa thực vật sống lâu năm, từ 15-30% đối với gồ cứng và 7-10% đối với gồ mềm

Với các cây gỗ mềm, các nhóm phụ của xylan chủ yếu là axit 4-O-methyl glucuronic và arabinose Chúng liên kết với bộ khung xylan bang liên kết a-1,3- glycozit Hiếm khi thấy các nhóm acetyl trong xylan của gỗ mềm Tỷ lệ arabinose

so với xylose thường là 0,6 [4],

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02

Hemicellulose trong gỗ cứng có nhóm phụ là axit 4- O-methyl glucuronic, axit acetic và axit uronic Bộ khung cùa xylan gỗ cứng này gồm các gốc 0-1,4-D- xylopyranose, trung bình cứ 10-20 gốc xylose thì có một axit 4- O-methyl glucuronic liên kết với nó theo kiểu a-l,2-glycozit xấp xi 60-70% các đơn vị xylose được este hóa với axit acetic ở nhóm hydroxyl của carbon thứ 2 hoặc thứ 3

và trung binh thì cứ mười đơn vị xylose thì có một nhóm axit uronic liên kết với gốc xylose theo kiểu a-1,2-glycozit [2], [4], [5]

1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan

Phân huý sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động cùa nhiều loại enzym trong

đó endo-p-1,4-xylanase (p-l,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thùy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các oligosaccharide Sau đó exo-P-l,4-D-xylosidase (P-l,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bời a-L-arabinofuranosidase, a-D- glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase

Exo-P-1,4-D-xylosidasc (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân p-l,4-D-xylo- oligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử Có nhiều công bố về

Bacillus sp [6] và một số nam [7] sinh tổng hợp p-xylosidase nội bào

Enzym a-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thủy phân nhóm cuối cùng không khứ a-L-arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan và arabinogalactan Một lượng lớn các vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và các loài vi khuấn được công bố là có khả năng sinh tống hợp rx-arabinosidase Rhodothermus marinus là loài chịu nhiệt có sinh enzym lớn nhất với hoạt độ 6,6 u/ml [8]

Enzym a-D-glucuronidasc (EC 3.2.1.1) thúy phân liên kết a-l,2-glycosidic giữa xylose và D-glucuronic axit hoặc liên kết ete với 4-O-methyI Sự thủy phân liên kết a-1,2 bền vừng đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan Tương tự như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-mcthyl-glucuronidase với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp a-glucuronidase [9]

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KI 8.CNSH 11-02

Hình 2 Vị trí tấn công của các cnzym vào xylan của cỏ [2]

Đe thúy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase loại bỏ liên kết cùa các axit acetic và axit phenolic với xylose Esterase phá vỡ liên kết cùa xylose với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6)), các gốc chuỗi bên arabinose với axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bẽn arabinose với axit p-coumaric (p- coumaroyl esterase) Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho sự loại bó lignin Chúng có thố góp phần làm hòa tan lignin bởi sự phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose Neu sử dụng cùng với xylanase và các enzym phân hủy xylan khác trong tấy trắng bột giấy, các esterase

có thể phá vỡ và làm lòng lẻo một phần cấu trúc của thành tể bào [2]

1.3 Tổng quan về enzyme xylanase

1.3.1 Khái niệm và phân loại xylansae

- Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết p-l,4-D-xylosidic trong xylan.

- Các tên khác gồm có: endo-P-l,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanasc; xylanasc; p-1,4-xylanase; endo-l,4-xylanasc; cndo-p-1.4- xylanase; endo-l,4-p-D-xylanase; 1,4-p-xylan xylanohydrolase; p- xylanase; P-l,4-xylan xylanohydrolase; endo-l,4-P-xylanase; p-D- xylanasc

- Tên hệ thống: 4-p-D-xylan xylanohydrolase

1.1.1.1 Phân loại xylanase

Wong và các cộng sự [10] phân loại xylanasc thành hai nhóm dựa vào đặc tính lý hóa cùa chúng như là khối lượng phân tử, điếm đăng điện và trên các đặc tính xúc tác khác nhau cùa chúng Endo-xylanase có khối lượng phân tử cao với giá trị pl thấp thuộc về glycanasc họ 10 (trước đây gọi là họ ‘F’)» trong khi đó các endoxylanse khối lượng phân từ thấp với giá trị pl cao được phân loại thành glycanase họ 11 (trước đây là họ G) [11], [12]

Biely và các cộng sự [13] nghiên cứu trên sự khác biệt trong các đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase kết luận rằng cndo-xylanasc cùa họ 10 khác với các thành viên của họ 11 là khả năng có thế tan công các liên kết glycozit cạnh các điềm nhánh và hướng về đầu không khứ [14] Trong khi endo-xylanase của họ 10 can hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh, cndo-xylanasc cũa họ I 1 cần có

ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế Theo đó các endo-xylanase của họ

10 có nhiều các hoạt động xúc tác tương tự như P-xylosidase Các endo-xylanase cùa họ 10 giải phóng các xylopyranosyl ở đầu tận cùng gắn với một gốc xylopyranosyl thay thế, nhưng chúng cũng thể hiện hoạt độ aryl-p-D-xylosidase.Sapag và các cộng sự [11] đã ứng dụng một phương pháp mới mà không liên quan tới phân tích trình tự trước đó cho việc phân loại xylanase họ II, để chia xylanase thành 6 nhóm chính Nhóm I, II và III chứa chù yếu các enzym của nấm Các enzym nhóm I và II thường là các enzym có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tồng hợp tìr các họ Ascomyceta và Basidiomyceta Các enzym nhóm I có giá trị

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02

pl bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị pl ở phía axit Các enzym cũa nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và c Nhóm A là các xylanase được sinh tồng hợp bới

họ Actinomycetaceae và AciUaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương Nhóm B và c thi chứa các enzym chủ yếu từ các vi khuấn yếm khí gram dương, nhũng loài thường sống trong dạ cò [11]

1.3.2 Cấu trúc cua xylanase

Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các enzym, từ cả vi khuấn và nấm mốc Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans

có nét đặc trưng của họ II [15] Vùng xúc tác là do phiến p tạo thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt p đối song và một chuồi xoắn a ngắn và tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [11], Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác cùa các endo-xylanase cùa họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng, cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chù yếu được sắp xếp từ các mảnh p [16], [17] Cấu trúc toàn thể cùa vùng xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mãnh p [18] VỊ trí liên kết cơ chất của cndo- xylanase họ 10 ờ khe xúc tác không sâu như với endo-xylanase họ 11 Điều này cùng với tính linh động hình thể lớn hơn cùa các enzym lớn hơn so với của những enzym nhò hơn có thế giái thích nguyên nhân của tính đặc trưng cơ chất thấp hơn cùa endo-xylanse họ 10 [15]

Hỉnh 3 Cấu trúc không gian 3 chiều cùa Xylanase họ 10 từ Bacillus halodurans

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KI 8.CNSH 11-02

Các thành viên cùa họ 11 có vùng xúc tác được tạo thành từ các phiến p hỉnh thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác Vũng lõm này được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái cùa tay phải Vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân tử isoleusin [15].

Hình 4 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11

Xylanase có thề liên kết với ba đến năm vònng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác Meagher và các cộng sự [19] nhận thấy rang Xyn 2 của T reesei có thế liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thi Xyn 1 chi có the liên kết với 3 vòng xylopyranosc ớ gần vị trí xúc tác Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [17], [20]

1.3.3 Cơ chế xúc tác của xylanase

Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động cùa xylanase Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thùy phân xylan là kết quả của sự duy trì hay dịch chuyến của trung tâm anomer cùa các monomer đường khứ của cacbonhydratc Chúng gồm một hoặc hai trạng thái chuyển tiếp hóa học Sự dịch chuyền glycosyl thường dẫn đen sự thay thế tính ái nhân ờ cacbon bão hòa trong trung tâm anomer và diễn ra với sự duy trì hoặc thay đôi cùa cấu hình anomer Hầu hết các cnzym thúy phân polysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết đến với sự thủy phân các cơ chất cùa chúng với sự duy tri của cấu hình anomer của

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02

Cl Có sự liên quan cùa cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy tri anomer của sản phẩm [2] Cơ chế dịch chuyến kép bao gồm các đặc điểm:

- Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất

- Một nhóm carboxyl cùa enzym ở trạng thái hoạt động

- Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzym với cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric cúa đường tham gia liên kết này đối lập với đường của cơ chất

- Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỳ lệ tăng lên [2].Leggio và các cộng sự [18] đề xuất rang Cơ chế xúc tác của xylanase là:

- Xylanase nhận biết và liên kết với xylan

- Gốc xylosyl ở vị trí 1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía gốc xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vờ để tạo thành dạng liên kết cộng hóa trị enzym-cơ chất trung gian

- Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó

cơ chế thủy phân glycosyl cố điền tiếp tục diễn ra và sản phàm được giải phóng [18]

1.3.4 Nguồn xylanasc

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bời các vi sinh vật; nhiều loại vi khuấn

và nấm được công bố là có khả năng sán xuất xylanase [10],[21] Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp endo-xylanase trong quả lê Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả Cleemput

và các cộng sự [22] đã tinh chế được một loại endo-xylanase với khối lượng phân tữ

là 55 kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu Một số loài động vật thân mềm dưới nước cũng có khá năng sinh tồng hợp xylanase [23]

ỉ.3.4.1 Sinh tổng họp xylanase từ vi khuẩn

Vi khuẩn có khà năng sinh tổng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các quá trình công nghiệp trong đó có xylanase vi đặc tính bền nhiệt của nó Một số loài

sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ cao ờ pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp.

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02

Bacillus SSP-34 có khá năng sinh tống hợp xylanase với hoạt độ 506 u/ml trong môi trường tối tru Trước đó thì Ratto và các cộng sự đã công bo Bacillus cừculans tống họp lên xylanase có hoạt độ 400 u/ml Enzyme này hoạt động tối ưu ở pH 7 và 40% hoạt độ được duy tri ở pH 9,2 Streptomyces cuspidosporus sinh tổng hợp được xylanase có hoạt độ 49 u/ml trong môi trường xylan Bacillus sp NCL 87-6-

10 tổng hợp được xylanase với hoạt độ 93 u/ml trong môi trường có cám ứng zeolit

và có hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80 Một chúng khác là B circulans AB16 tống hợp xylanase có hoạt độ 19,28 u/ml khi sinh trường trên môi trường rơm gạo

Streptomyces sp QG-11-3 có khà năng sinh enzym xylanase có hoạt độ 96 u/ml

1.3.4.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc

Các enzym xylanase được sinh tồng hợp từ nam mốc thường có pH tối ưu thấp hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn Giá trị pH tối ưu cùa xylanasc từ nấm mốc thủy phân xylan thi thường dao động từ pH 3 đến 8 và ốn định

ở pH 5 Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuấn nhìn chung cao hơn so với pH tối

ưu cùa xylanase từ nấm Trong công nghệ sàn xuất giấy và bột giấy, để sừ dụng xylanasc từ nấm mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ít được dùng hơn so với vi khuấn Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác, như công nghiệp sán xuất đồ uống, công nghiệp sàn xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại

là một ưu thế rất lớn cùa xylanasc nấm mốc vi môi trường cho cnzym hoạt động là môi trường axit Nấm sinh tồng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản xuất enzym trên môi trường lòng ở quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được thường thấp hơn thực tế Điều này là do khi tiến hành lên men trong môi trường lỏng các sợi nấm kết lại thành các pellet làm cản trở quả trinh tiếp xúc với chất dinh dường và đặc biệt là các ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men làm sinh khối của nấm dề bị phá vỡ dần đen việc làm giâm lượng enzym thu được [23]

1.3.5 ủ ng dụng ciia xylanase

Trong vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ cùa công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme nói chung và xylanase nói riêng được sàn xuất ngày càng nhiều trên quy mô công nghiệp Trong đó, xylanase đã từng bước mang lại lợi ích cực kỳ to lớn cho nền công nghiệp nói riêng và kinh tế nói chung Do vậy,

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KI 8.CNSH 11-02

chúng ta không ngừng tim kiếm và ứng dụng xylanase vào những lĩnh vực khác nhau hỗ trợ quá trinh tấy tráng trong công nghiệp sàn xuất giấy thay vì phái sử dụng các hóa chất độc hại; xylanase tham gia quá trình xử lý rác thài nông, lâm nghiệp, trong công nghiệp sán xuất bánh xylanase được dùng làm tăng độ phồng và giám độ dính của bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sán xuất đồ uống, sản xuất nhiên liệu Xylanase còn được ứng dụng làm nhiên liệu sinh học; ứng dụng trong ngành dược phẩm và được dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.

1.3.5.1 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Việc sử dụng enzym xylanase cho thức ăn cùa động vật đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học Sự kểt hợp của xylanase với thức ăn của gà con làm giảm độ nhớt trong ruột, tăng hiệu quả hấp thu thức ãn Ket quả là cái thiện đáng kề trọng lượng cùa chúng Theo Feoli và các cộng sự thi việc bố xung xylanase vào bột

mỉ gia súc và bột đậu tương với một tý lệ nhất định cũng cải thiện được năng suất

và hiệu suất tiêu thụ thức ăn của lợn [24] Các nghiên cứu khác cũng chì ra rang việc bố sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cở ling lăng, ngũ cốc ) đã làm tăng hiệu quá tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất trong chăn nuôi [25],

1.3.5.2 Trong sản xuất bánh

Các xylanase cũng được cho ràng có the cải thiện chất lượng của bánh mì với việc làm tăng thề tích đặc trưng của bánh Điều này càng được nâng cao khi sử dụng chung với amylase Xylanase có tính axit từ Aspergillus oryzae được sữ dụng

để sản xuất thực phẩm thương mại truyền thống của Nhật như là sake (một loại rượu từ gạo) và shoyu koji (từ đậu nành và hạt lúa mì) Người ta chi ra ràng hiệu quả phân giải thành tế bào đậu tương và lúa mì cãi thiện giá trị sử dụng các vật liệu thô và làm giám lượng bã ép lọc đậu tương Multifcct và Enzcko là tên thương mại của một số các xylanase thương mại cũ được sử dụng trong công nghệ làm bánh Novozyme đưa ra một số các enzym xylanase mới, có thế là kết hợp với các enzym khác, đổ cãi thiện bột nhào, đặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ Một số các enzym xylanase thương mại như Celluclast BG, Fungamyl Super AX [25]

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KI 8.CNSH 11-02

1.3.5.3 Trong sản xuất rượu vang

a-L-arabinofuranosidase và P-D-glucopyranosidase được sử dụng trong quá trinh sán xuất thực phẩm cho các chất thơm, rượu vang và nước hoa quà Vi sinh vật bám trên quá nho với mật độ vừa phài sẽ làm tăng các chất hóa học phức tạp và tăng chất lượng cảm quan của rượu vang Điều này do các vi sinh vật này sinh xylanase, enzym này được cho rằng có khà năng giúp đỡ sự phá huy thành tế bào cùa nho và

vì thế làm tăng lượng monotcrpenyldiglycosidc, chất mà tạo mùi thơm Hiện nay, chưa có một enzym thương mại nào có tiềm năng để sử dụng trong sản xuất rượu vang và nó vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu và phát triên [25],

1.3.5.4 Trong sản xuất cồn nhiên liệu

Sự tiêu thụ nhanh chóng nguồn năng lượng hóa thạch đang cần sự thay thế từng bước một với các nguồn thay the, nguồn này phài thân thiện với môi trường và phái góp phần báo vệ trái đất thoát khỏi sự khùng hoáng Đổ thu được biocthanol cần biến đối nguyên liệu từ thực vật qua các bước như: tiền xử lý bàng hóa chất, sau

đó thủy phân lignocellulose biopolymer thành các đường khử (sử dụng enzym hoặc hóa chất), rồi lên men các đường khử thành rượu, và cuối cùng là chưng cất và tinh chế bioethanol [26] Tuy nhiên, tiền xử lý và sừ dụng hóa chất đề thủy phân làm giá thành sàn xuất cồn còn cao và gây ảnh hưởng lớn tới môi trường Do đó mà các nhà nghiên cứu đang co gắng sử dụng công nghệ enzym đế thực hiện quá trinh này, việc nghiên cứu tạo ra các loại enzym có hoạt lực cao, và phối hợp sử dụng các enzym như xylanase, cellulase, laccase đang được đẩy mạnh nghiên cứu

1.3.5.5 Trong chất hoạt động bề mặt

Alkyl glycoside là một trong những chất quan trọng nhất của các chất hoạt động

bề mặt về phương diện thương mại, chúng được sàn xuất từ các đường đơn như là glucose và một rượu béo Nhưng sự glycosyl hóa sứ dụng polysaccharide thì dễ dàng thực hiện hơn trong sản xuất công nghiệp, bởi vi sự thủy phân của polysaccharide và các bước tiếp theo có thế được bò qua Xylanase từ Aureobasidium pulluỉans được sử dụng cho sự glycosyl hóa của xylan, 1 -octanol and 2-cthyl hexanol thành octyl-P-D- xylobioside, xyloside and 2-ethylhexyl-p-D-xylobioside tương ứng [25]

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02

1.3.5.6 Trong tẩy trắng giấy và bột giấy

Sự tiến bộ trong ứng dụng của công nghệ sinh học tới công nghệ sản xuất giấy và bột giấy đã có những phát triển có ý nghĩa qua những năm gần đây Một trong những ứng dụng thành công nhất là việc sứ dụng cndo-l,4-p-D-xylanasc cho bước tiền xử lý quá trình tấy trắng bằng Clo và Clo dioxit Dựa trên nghiên cứu của một lượng lớn các phòng thí nghiệm và nhà máy, nó đang được thiết lập đê tiền xử

lý cho bột giấy kraft với xylanasc đã nâng cao một cách có ý nghĩa khá năng tay trắng cùa bột giấy bằng cách sử dụng các tác nhân tấy trắng bằng Clo tiếp theo Lợi ích có ý nghĩa nhất của việc tẩy trắng tìm thấy từ việc tiền xử lý bàng xylanase là làm

nó sáng hon, giảm lượng hóa chất tẩy trắng cần thiết mà vẫn cho độ sáng cao, và giảm lượng hợp chất Clo hữu cơ trong nước thải tấy trắng Hiệu quá của tiền xử lý bàng xylanase dựa trên các tác nhân tấy trắng có chứa oxy được nghiên cửu với một bột giấy kraft gỗ mềm Bột giấy được tiền xử lý với một dung dịch chứa xylanasc 12% Xử lý enzym cũng làm loại bở một lượng nhỏ của lignin làm giảm giá trị kappa của bột giấy đi 3% Sự tăng tính nhớt có thế là do các phân tứ polysaccharide khối lượng phân tir cao được làm giàu, diễn ra khi xylan được loại bỏ [27]

1.4 Tách dòng và biếu hiện gen

Sự biểu hiện của các protein ngoại lai vào trong hệ thông prokaryote được sừ dụng một cách rộng rãi nhất bới khá năng biếu hiện ờ mức cao, cá trong những nghiên cứu cơ bản và trong sàn xuất thương mại Thêm vào đó, tốc độ sinh trưởng nhanh và sự

dễ dàng trong việc nuôi cấy của E coli khiến nó rất được quan tâm và trở thành loài được sử dụng đồ biến nạp gcn chú yếu dùng để sàn xuất các sản phẩm chuyến gcn hiện nay Ngoài E coli nấm men cũng được sử dụng khá nhiều để biểu hiện gen

1.4.1 Vector biểu hiện pET-22b(+)

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET-22b(+) làm vector biếu hiện Vector pET-22b(+) có chiều dài 5493 bp (hỉnh 5) là vector được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biếu hiện gen tái tổ họp trong E coli về cấu tạo, vector này bao gồm:

- Trình tự khởi đầu sao chép (ori) là vị trí gắn cùa DNA polymcraza, quyết định số lượng bản sao trong vật chú

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02

- Các trinh tự mà hóa gen chi thị chọn lọc (AmpR) để đám bảo duy tri sự tồn tại của vector trong tế bào vi khuấn đồng thời giúp chọn lọc các dòng

tế bào mang plasmid

- Vùng đa nối (multiple cloning site) có chứa điểm cắt cúa một số enzyme hạn chế đề thuận tiện cho việc đưa gen ngoại lai vào vector

- Promoter T7 kiếm soát phiên mã đế nhận biết tín hiệu khới đầu phiên mã,

từ đó cho phép sản xuất một lượng lớn mARN từ các gcn được nhân dòng sau khi được cảm ứng

Hình 5 So’ đồ vector pET-22b(+)

1.4.2 Chủng biểu hiện E coli BL21

Trong quá trình biếu hiện protein ngoại lai, thường xảy ra các hiện tượng các protein sau khi được biểu hiện bị các protease nội bào phân giãi Đế băo vệ các protein ngoại lai, người ta đà tạo ra các chùng biếu hiện mang gcn đột biến làm mất khả năng tống hợp các protease Chủng biếu hiện E coll BL21 là một chủng như vậy

Te bào E coli BL21 chứa đột biến lon protease ( một protease nội bào) và ompT

protease ( một protease ngoại bào) nèn khả năng protein bị phân hủy giảm đáng ke

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KÌ8.CNSH 11-02

1.4.3 Các nghiên cứu đã đưọc công bố về biếu hiện xylanase

Một loạt các nghiên cứu gần đây đã tách dòng và biếu hiện xylanase trong các vật chú vi khuẩn và nam men khác nhau Một số ví dụ, xylanase được tách dòng vào trong E coli bao gồm A oryzae (Kimura cs., 2002), A pullulans var melanigenum (Ohta cs., 2001), Bacillus lyticus (Srivastava and Mukherjee, 2001), Clostridium thermoceìlum (Fernandes cs., 1999) and Caldocellum

saccharolyticum (Lủthi cs., 1990) Một số xylanasc từ A pullulans var

melanigenum (Tanaka cs., 2004), T lanuginosus IOC-4145 (Damaso cs., 2003) và

A niger (Berrin cs., 2000) được biếu hiện trong Pichia pastoris [2]

SVTH: Chu Thị Khánh Ly KI 8.CNSH 11-02

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu

2.1 Vật liệu

2.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid

Chủng E coli DH10B được sử dụng cho mục đích tách dòng gen Chủng E

coli BL21 (DE3) được sử dụng làm chúng biểu hiện gen Plasmid pBluc-script SK (+) mang gcn xhx (được đặt tên là pBluc-xbxs) do phòng

Kỹ thuật di truyền - viện Công nghệ sinh học thiết kế được sử dụng làm nguồn gen Plasmid pET-22b(+) được sứ dụng làm vector biếu hiện gen

Cặp mồi sử dụng trong phân úng PCR:

Mồi xuôi (forward primer):

TCCATGGATAACCCTTACTTACCTGCTTATG

Moi ngược (reverse primer):

TCTCGAGTCCTTTTGTTGCAATTCAAAGGAT

2.1.2 Các loại môi trường nuôi cấy

- Môi trường Luria Bertani (LB) lòng: Cao nấm men (0, 5%), Bacto trypton (1%), NaCl (1%)

- Môi trường LB-Amp lỏng: Môi trường LB lỏng bo sung ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 pg/ml

- Môi trường LB đặc: Môi trường LB lõng có bồ sung thêm 1,5% agar

- Môi trường chọn lọc LB-Amp đặc: Môi trường LB đặc bổ sung ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 Jig/ml

2.1.3 Hóa chất và dung dịch sử dụng

2.1.2.1 Hóa chất

Các hóa chất thông dụng như EDTA, ethanol, ethidium bromide, acetic acid, isoamyl-alcohol, ammonium persulfate (APS), methanol, SDS, acryamide, bis­acrylamide, Tris-HCl, glycine, glucose, glycerol, cloroform, phenol, agarose, agar, ampicillin, 1PTG, cao nấm men đạt tiêu chuấn phân tích có xuất xứ từ các hẵng Merck và Sigma

2.1.2.2 Enzyme

Các enzyme hạn chế Ncoỉ và ATíơI; T4-DNA ligase; Taq-DNA polymerase được mua của Fcrmentas; các loại đệm phù hợp và nước deion

2.1.2.3 Dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli

Môi trường: môi trường chọn lọc LBA lỏng