Đại học y dược Hồ Chí Minh Khoa Y học cổ truyền BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔ HÌNH DƯỢC LÝ KHÁNG VIÊM GIẢM ĐAU MEN GAN Học viên Hoàng Thị Hồng Nhung Chuyên khoa I YHCT21 Tp Hồ Chí Minh, tháng 5/2022 MỤC LỤC MỤ[.]
Trang 1Đại học y dược Hồ Chí Minh
Khoa Y học cổ truyền
BÁO CÁO THỰC HÀNH
MÔ HÌNH DƯỢC LÝ KHÁNG VIÊM-GIẢM ĐAU-MEN GAN
Học viên: Hoàng Thị Hồng Nhung
Chuyên khoa I YHCT21
Tp Hồ Chí Minh, tháng 5/2022
Trang 2MỤC LỤC
MỤC LỤC 1
Chương I TỔNG QUAN 1
1 Dược liệu nghiên cứu: Hà thủ ô đỏ 1
2 Phản ứng viêm 4
3 Giới thiệu mô hình gây viêm bằng Carrageenan 4
Chương II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7
1 Đối tượng nghiên cứu 7
2 Phương pháp nghiên cứu 7
2.1 Chiết xuất cao hà thủ ô 7
2.2 Tiêu chuẩn cao 7
2.3 Mô hình thực nghiệm 9
2.4 Cách tiến hành 10
Chương III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 12
1 Cao thuốc 12
1.1 Độ ẩm 12
1.2 Hiệu suất chiết 12
2 Định tính hoạt chất có trong dược liệu và cao thuốc 13
3 Kết quả mô hình giảm đau – chống viêm – men gan 15
3.1 Tình trạng sức khỏe chuột trong thời gian thí nghiệm 15
3.2 Đánh giá tác dụng giảm đau 15
3.3 Đánh giá tác dụng chống viêm 16
3.4 Đánh giá ảnh hưởng đến men gan 16
Chương IV KẾT LUẬN 18
TÀI LIỆU THAM KHẢO 19
Trang 4Chương I TỔNG QUAN
1 Dược liệu nghiên cứu: Hà thủ ô đỏ
Tên khoa học của vị thuốc[1]: Radix Fallopiae multiflorae
Tên gọi khác: dạ giao đằng, địa tinh
Bộ phận dùng:
Rễ củ phơi hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.), thuộc
họ Rau răm Polygonaceae
Phương pháp bào chế[2]
Sơ chế: Đỗ đen, Hà thủ ô với tỉ lệ 50:50
Đỗ đen: chọn đỗ đen xanh lòng, ngâm nước, loại bỏ những hạt lép, kém chất lượng ngâm trong khoảng thời gian 30 phút
Hà thủ ô: rửa sạch, cạo vỏ, ngâm nước vo gạo cho mềm ra rồi thái thành miếng Các miếng lát hà thủ ô này lại tiếp tục ngâm nước vo gạo 1 ngày 1 đêm
Bào chế: Cửu chưng cửu sái
Đâu đen ninh nhừ lấy nước
Hà thủ ô ninh nhỏ lửa với nước đậu đen (chưng), đun đến cạn thì mang đi phơi cho khô (sái) Lập lại như thế 9 lần, gọi là cửu chưng cửu sái
Thành phần hóa học[7],[8],[4]
Lecithin là thành phần chính, chiếm 3.7%, Lecithin là một phosphatid, là sự kết hợp của acid glycerophosphoric với một phân tử cholin và hai phân tử acid béo
Nhóm antraquinon (1.1%) chủ yếu là emodin, physcion trong đó chrysophanol
và emodin là nhiều nhất Các hoạt chất khác: physcion, chrysophanol, citreorosein, chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside, physcion-8-O-β-D-glucopyranoside, emodin-8-O-β-Dglucopyranoside, emodin-1,6-dimethylether, questin, questinol, 2-acetylemodin, 2-methoxy-6-acetyl-7-methyljuglone, emodin-8-O-(6’- O-malonyl)-glucoside
Trang 5Nhóm glycosid (1.2%) chủ yếu là stilben glycoside, ngoài ra còn có (2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside, 2,3,5,4’- tetrahydroxystilbene-2,3-O-β-D-glucopyranoside
Nhóm Flavonoids gồm tricin, galactoside, quercetin-3-O-arabinoside
Ngoài ra còn có gallic acid, catechin, torachrysone-8-O-β-Dglucopyranoside, N-transferuloyl tyramine, N-transferuloyl-3- methyldopamine and 1,3-dihydroxy-6,7-dimethylxanthone-1-O-βD-glucopyranoside
Anthraquinones và stilben glycoside là các nhóm hoạt chất có tác dụng dược lý chính
Sau khi bào chế, hai anthraquinon, cụ thể là emodin8O (6'Omalonyl) -glucoside và Physcion-8-O- (6'-O-malonyl) glucoside biến mất hoặc giảm đáng kể và 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside, emodin-8-O-β-D-glucopyranoside và Physcion-8-O-β-D-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside giảm sau khi chế biến dược liệu Mặt khác, hàm lượng của emodin và physcion thường tăng lên sau bào chế
Tác dụng theo dược lý cổ truyền[3]
[Tính vị] Vị đắng, ngọt, chát Tính ấm.
[Quy kinh] Can, Thận, Tâm
[Công năng]
Hà thủ ô sống: giải độc tiêu thũng, nhuận tràng thông tiện
Hà thủ ô chế: ích tinh huyết, bổ huyết tư âm, bổ Can Thận, làm đen tóc, nhuận tràng thông tiện
[Chủ trị]
Huyết hư: điều trị huyết hư thiếu máu, cơ thể mệt nhọc, vô lực, hơi thở ngắn, da xanh, gầy, khô sáp, chóng mặt, nhức đầu, râu tóc bạc sớm, ra mồ hôi trộm, tim loạn nhịp, mất ngủ
Can thận âm hư: điều trị thận âm hư dẫn đến lưng đau, di tinh, liệt dương, phụ
nữ bạch đới, kinh nguyệt không đều, tóc bạc sớm
Trang 6Nhuận tràng thông tiện: đại tiện táo do huyết hư, ngoài ra còn điều trị trĩ, đại tiện ra máu,
Giải độc, chống viêm: trị mụn nhọt, thấp chẩn, lở ngứa, tràng nhạc, viêm gan mạn
An thần: dây dạ giao đằng có tác dụng an thần, gây ngủ
Tác dụng theo dược lý hiện đại[4]
Chống lão hóa: hà thủ ô có thể kéo dài tuổi thọ chim cút già, kéo dài thời gian
sinh truwognr của ruồi giấm hà thủ ô cải thiện rõ rệt chức năng TKTW ở chuột, làm tăng hoạt tính SOD, giảm MDA trong não và gan vật thí nghiệm, tăng hàm lượng monoamine dẫn truyền thần kinh, giảm hoạt tính MAO-B trong não Thúc đẩy quá trình trao đổi chất, dịch chiết hà thủ ô làm tăng hàm lượng protein trong não chuột, tăng khả năng sửa chữa DNA, cắn chiết ethanol và dịch chiết nước hà thủ ô có tác dụng tăng cường hàm lượng protein và acid nucleic trong bào tương chuột nhắt già
Tăng cường khả năng miễn dịch: tăng trong lượng tuyến ức chuột, đối kháng
các thuốc ức chế miễn dịch prednisolone và cyclophosphamide gây teo tuyến ức và lá lách ở chuột nhắt già, tăng tỷ lệ thực bào của đại thực bào, tăng chức năng tế bào lympho T và lympho B
Hạ lipid máu, chống xơ vữa động mạch: làm giảm cholesterol toàn phần và
triglyceride trong huyết thanh chuột cống mỡ máu cao thực nghiệm, làm giảm rõ rệt hàm lượng TC, tăng tỷ lệ HDL-C/TC ở chim cút mowxmaus cao thực nghiệm, làm giảm sự hình thành các mảng xơ vữa trên mô hình thỏ lipid máu cao Hoạt chất có tác dụng hạ lipid máu trong hà thủ ô bao gồm: anthraquinone, diphenylene và lecithin Cơ chế hạ mỡ máu của hà thủ ô: (1) anthraquinone nhuận tràng, làm giảm hấp thu chất béo, tăng thải trừ acid mật qua đường ruột (2) ảnh hưởng đến hoạt tính của coenzyme 3-hydroxy–3 methyl amylase (HMG-CoA) và 7α-hdroxylase, ức chế tổng hợp cholesterol nội sinh và tăng chuyển hóa cholesterol thành acid mật
Kích thích khả năng tạo máu của tủy xương: dịch chiết nước hà thủ ô làm
tăng số lượng tế bào gốc tạo máu tủy xương, tăng số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu hạt trong máu ngoại vi trên chuột nhắt trắng
Trang 7Tác dụng đến hệ tiêu hóa: (1) nhuận tràng: hà thủ ô sống có tác dụng nhuận
tràng thông tiện mạnh, hoạt chất gây ra tác dụng này là anthraquinone, sau khi chế biến, anthraquinone dạng kết hợp được chuyển hóa thành dạng tự do, tác dụng tả hạ, nhuận tẩy giảm đi, tác dụng bổ tăng lên (2) bảo vệ gan: stilbene glucoside trong hà thủ
ô ức chế dầu ngô peroxy hóa gây gan nhiễm mỡ và tổn thương gan trên chuột, giảm hàm lượng AST, ALT, acid béo tự do và nồng độ lipoperoxid trong gan Trong hà thủ
ô có chứa hàm lượng lecithin cao có tác dụng bảo vệ gan
Tác dụng đến chức năng nội tiết: hà thủ ô kích thích vỏ thượng thận, cải thiện
tình trạng suy thận trên chuột nhắt trắng cắt bỏ hai tuyến thượng thận dùng dịch chiết
hà thủ ô lâu dài làm tặng trọng lượng tuyến thượng thận chuột nhắt trắng, đồng thời làm tăng hàm lượng T4 trong máu chuột đực già
2 Phản ứng viêm
Viêm là phản ứng bảo vệ bình thường của cơ thể trước các tổn thương do các tác nhân gây bệnh Viêm xảy ra khi các tế bào bạch cầu trong cơ thể tăng cường hoạt động để bảo vệ cơ thể khỏi bị đả kích bởi tác nhân gây bệnh Phản ứng viêm của cơ thể có thể là cấp tính (kéo dài trong vài ngày) còn gọi là phản ứng viêm cấp, hoặc có thể là mãn tính (phản ứng lại sự xúc phạm liên tục và không được giải quyết) Tình trạng viêm có thể phát triển thành tổn thương mô vĩnh viễn hoặc xơ hóa
3 Giới thiệu mô hình gây viêm bằng Carrageenan
Carrageenan là tên chung của một họ polysaccharid tạo gel và làm nhớt, thu được bằng cách chiết xuất từ một số loài tảo biển đỏ Carrageenan có nguồn gốc từ một số loài rong biển thuộc lớp Rhodophyceae Loại rong biển đặc biệt này phổ biến ở Đại Tây Dương gần Anh, Châu Âu và Bắc Mỹ Hàm lượng carrageenan của rong biển thương mại thường là 30-60% trọng lượng khô nhưng có thể lên tới 70–80% Carrageenan nằm trong thành tế bào và chất nền gian bào của mô thực vật Sự tổng hợp carrageenan thay đổi trong một số họ tảo đỏ quan trọng tùy theo giai đoạn sinh sản của cây Carrageenan không có giá trị dinh dưỡng và được sử dụng trong chế biến thực phẩm vì đặc tính tạo bọt, làm đặc và tạo nhũ tương (Van de Velde et al 2002) và trong các ứng dụng dược phẩm (Takamatsu và Tosa 1993, trích dẫn Van de Velde et al 2002) và thử nghiệm thuốc chất này thường được sử dụng để thử nghiệm chống viêm
Trang 8Mô hình gây phù chân chuột do carrageenan gây ra là một thử nghiệm để xác định hoạt động chống viêm và tạo thành một mô hình động vật đơn giản và thường quy để đánh giá cơn đau tại vị trí viêm mà không có bất kỳ tổn thương hoặc tổn thương nào đối với bàn chân bị viêm Phù chân chuột ngày càng được sử dụng nhiều hơn để thử nghiệm các loại thuốc chống viêm mới cũng như nghiên cứu các cơ chế liên quan đến chứng viêm
Quá trình phù nề ở chân sau của chuột sau khi tiêm carrageenan xảy ra trong 2 giai đoạn, phụ thuộc vào 2 đại lượng là trọng lượng và tuổi, trong đó các chất trung gian khác nhau hoạt động theo trình tự để tạo ra phản ứng viêm
Histamine, serotonine và bradykinin là những chất trung gian có thể phát hiện đầu tiên trong giai đoạn đầu của quá trình viêm do carrageenan; prostaglandin (PGs) tham gia vào quá trình tăng tính thấm thành mạch và có thể phát hiện được ở giai đoạn muộn của quá trình viêm Viêm tại chỗ và / hoặc toàn thân có liên quan đến mức độ tăng cường của các cytokine tiền viêm TNF-α, IL-1 và IL-6 (Cuzzocrea et al 1999) Giai đoạn ban đầu của phù nề, không bị ức chế bởi thuốc chống viêm không steroid (NSAID) như indomethacin hoặc aspirin, được cho là do giải phóng histamine, 5-hydroxytryptamine (5-HT) và bradykinin Giai đoạn tăng tốc thứ hai của sự sưng tấy không chỉ liên quan đến việc sản xuất tăng cao các prostaglandin, mà còn được cho là
do sự cảm ứng của cyclooxygenase (COX-2) ở chân sau (Nantel và cộng sự 1999) Nó
có thể bị chặn bởi NSAID (Handy và Moore 1998) Sự xâm nhập và hoạt hóa của bạch cầu trung tính tại chỗ cũng góp phần vào phản ứng viêm này bằng cách tạo ra, trong số các chất trung gian khác, các gốc tự do có nguồn gốc oxy như anion superoxide (O2 -)
và gốc hydroxyl (Salvemini et al 1996; Posadas et al 2004)
Một chất trung gian quan trọng khác trong viêm cấp tính là nitric oxide (NO) được tạo ra trong các tình trạng bệnh lý bởi ba dạng đồng dạng riêng biệt của nitric oxide synthase (NOS): NOS nội mô (eNOS), NOS tế bào thần kinh (nNOS) và NOS cảm ứng (iNOS) Carrageenan tạo ra và giải phóng NO tại vị trí bị thương Việc truyền chất ức chế NOS không chọn lọc, NG monomethyl-larginine acetate (L-NMMA), thể hiện một số tính chọn lọc để ức chế các đồng dạng tế bào thần kinh và nội mô, ngăn chặn sự giải phóng NO sau khi tiêm carrageenan trong nghiên cứu này Truyền chất ức chế NOS cảm ứng, aminoguanidine hemisulfate (AG), ngăn chặn sự giải phóng NO
Trang 92,5–8 giờ sau khi tiêm carrageenan Cắt dây thần kinh ức chế hoàn toàn giải phóng NO trong tối đa 3 giờ và ức chế một phần giải phóng NO 4,5–8 giờ sau khi tiêm carrageenan Những phát hiện này chỉ ra rằng nNOS góp phần tạo ra NO ở cả giai đoạn đầu và giai đoạn cuối, và iNOS chỉ góp phần vào giai đoạn muộn Việc sản xuất
và giải phóng NO bởi những NOS này góp phần gây tổn thương mô và phù nề do viêm
và tăng nhạy cảm đau[5],[6]
Mô hình gây viêm bằng Carrageenan được thực hiện như sau:
Gây phù bàn chân sau của chuột bằng cách tiêm dưới da ở bề mặt gan bàn chân sau của chuột 0,1ml dịch treo 1% carragenin, pha trong nước cất hay dung dịch NaCl đẳng trương Chỉ pha trước khi dùng, vì nếu để lâu carragenin sẽ lắng xuống
Trong quá trình viêm gây bởi carragenin, mức độ viêm tối đa ở trong khoảng thời gian 3 – 4h Độ phù chân chuột được tính theo công thức:
Vx = | Vx – V0 |
Trong đó: Vx : độ phù chân chuột đo sau x giờ V0 : thể tích chân chuột bình thường Vx: thể tích chân chuột đo sau x giờ
Trang 10Chương II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
- Cao thuốc hà thủ ô
- Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, khỏe mạnh, được cung cấp bởi viện
Pasteur Tp Hồ Chí Minh và được nuôi đầy đủ với thực phẩm viên dành cho loài, ổn định ít nhất 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Chiết xuất cao hà thủ ô
Phương pháp chiết xuất: chiết nóng với dung môi là nước
Tiến hành:
Cân 250 gram hà thủ ô, cho vào 2,5 lít nước (tỷ lệ 1:10) Đun đến sôi, duy trì ở nhiệt độ khoảng 80°c trong 60 phút Thu được dung dịch (1)
Đun lần 2, vẫn pha dược liệu với dung môi nước theo tỷ lệ 1:10 như trên, đun đến sôi, duy trì ở 80°c trong 45 phút, thu được dung dịch (2)
Trộn dung dịch (1) và (2) với nhau, tiếp tục cô dịch chiết đến khi thu được dung dịch hơi sệt thì mang đi đun cách thủy đến khi đạt được độ
ẩm mong muốn
Xác định khối lượng cao thu được: đo khối lượng cốc đựng cao thu được, trừ đi khối lượng riêng của cốc khi chưa đựng cao thuốc, thu được khối lượng riêng của cao chiết được
2.2 Tiêu chuẩn cao
a Độ ẩm
Tiến hành đo độ ẩm dược liệu khô và cao thuốc bằng cân sấy ẩm Metler Toledo HB43 Halogen trong 3 lần, lấy số liệu trung bình
b Phương pháp định tính hoạt chất có trong dược liệu và cao thuốc
Định tính Flavonoid
Lấy 5g dược liệu pha với 30ml cồn 96°, đun nóng trong 5 phút, lọc qua giấy lọc, thu được dịch lọc A Chia vào 3 ống nghiệm
Trang 11Ống 1: pha 2ml dịch lọc với 2 giọt thuốc thử FeCl3.
Ống 2: pha 2ml dịch lọc với 2 giọt thuốc thử PbCl2
Ống 3: pha 2ml dịch lọc với 2 giọt thuốc thử NaOH
Đối với cao thuốc: cho 0,1 gam cao vào cốc có mỏ, thêm 30ml cồn có chưa 5% acid, thu được hỗn hợp D => Đun cách thủy 5 phút, lọc qua giấy thu được dịch lọc D1. => Cô cắn => hòa cắn với 10ml nước nóng => lọc qua giấy => thu được
D2. Chia D2 vào 3 ống nghiệm và làm thí nghiệm tương tự như trên
Quan sát và ghi nhận kết quả
Định tính Tanin
Lấy 5g dược liệu pha với 20ml nước cất, đun nóng 5 phút, lọc qua giấy lọc, thu được dịch lọc A
o Ống 1: pha 2ml dịch lọc với 2 giọt thuốc thử FeCl3
o Ống 2: pha 2ml dịch lọc với 2 giọt thuốc thử PbCl2
Đối với cao thuốc: cho 0,1 gam cao vào cốc có mỏ, thêm 30ml cồn có chưa 5% acid, thu được hỗn hợp D => Đun cách thủy 5 phút, lọc qua giấy thu được dịch lọc D1. => Cô cắn => hòa cắn với 10ml nước nóng => lọc qua giấy => thu được
D2. Chia D2 vào 2 ống nghiệm và làm thí nghiệm tương tự như trên
Quan sát và ghi nhận kết quả
Định tính Saponin
Thử nghiệm tạo bọt
Lấy 5g dược liệu pha với 30ml cồn 70°, đun nóng trong 5 phút, lọc qua giấy lọc thu được dịch lọc
Cô cắn dịch lọc đến khi còn 2ml + 10ml nước cất => lắc mạnh trong 5 phút để tạo bọt
Đối với cao thuốc: cho 0,1 gam cao vào cốc có mỏ, thêm 30ml cồn có chưa 5% acid, thu được hỗn hợp D => Đun cách thủy 5 phút, lọc qua giấy thu được dịch lọc D1. => Cô cắn => hòa cắn với 10ml nước nóng => lọc qua giấy => thu được D2. Chia D2 vào ống nghiệm và làm thí nghiệm tương tự như trên
Quan sát và ghi nhận kết quả: Để yên quan sát, nếu bọt bền vững trong 15p thì kết luận có saponin
Trang 12 Định tính Alcaloid
Lấy 5g dược liệu pha với 30ml cồn acid, đun nóng trong 5 phút, lọc qua giấy lọc, thu được dịch lọc B
Cô cắn dịch lọc B đến khi còn 2ml + 10ml nước nóng => lọc qua giấy, thu được dịch lọc C Chia làm 3 ống:
Ống 1: pha 2ml dịch lọc với 2 giọt thuốc thử Bouchardat
Ống 2: pha 2ml dịch lọc với 2 giọt thuốc thử Valmayer
Ống 3: pha 2ml dịch lọc với 2 giọt thuốc thử Dragendroff
Đối với cao thuốc: cho 0,1 gam cao vào cốc có mỏ, thêm 30ml cồn có chưa 5% acid, thu được hỗn hợp D => Đun cách thủy 5 phút, lọc qua giấy thu được dịch lọc D1. => Cô cắn => hòa cắn với 10ml nước nóng => lọc qua giấy => thu được D2. Chia D2 vào 3 ống nghiệm và làm thí nghiệm tương tự như trên
Quan sát và ghi nhận kết quả
2.3 Mô hình thực nghiệm
Mô hình kháng viêm – giảm đau – men gan
a Mô hình giảm đau
Đánh giá khả năng chịu đau của chuột bằng thí nghiệm trên mâm nhiệt
Thiết bị: mâm nóng Ugo – Basile, Italia, model 35100-001
Tính thời gian từ lúc chuột bắt đầu tiếp xúc với mân nhiệt cho đến khi chuột nhảy lên do vượt ngưỡng chịu đau
So sánh kết quả giữa các lô chuột
b Mô hình kháng viêm
Tiêm trong da, dưới gan bàn chân chuột dung dịch Carrageenan 1% (pha với nước muối sinh lý, thể tích 0,05ml/con)
Sau 30 phút tiêm, cho chuột uống thuốc theo lô, theo liều đã định
Sau 2 giờ tiêm, đo thể tích chân chuột V2.
So sánh kết quả giữa các lô chuột