Báo cáo thực tập vi sinh thí nghiệm 1 phát hiện vi sinh vật dựa trên môi trường chọn lọc

Giới thiệu: Về nguyên tắc có thể chia thành ba nhóm là:  Phát hiện dựa trên kiểu hình: trên môi trường dinh dưỡng đặc hoặc lỏng và trong điều kiện nuôi cấy phù hợp có thể phát hiện vi s

BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH

Giảng viên: TS.Lê Mai Hương Xuân

Thành viên:

1 Doãn Ngọc Yến Nhi_21180080

2 Âu Ngọc Yến Nhi_21180079

3 Nguyễn Vu Kim Ngân_21180068

THÍ NGHIỆM 1:

PHÁT HIỆN VI SINH VẬT DỰA TRÊN MÔI TRƯỜNG CHỌN LỌC

1 Giới thiệu:

Về nguyên tắc có thể chia thành ba nhóm là:

 Phát hiện dựa trên kiểu hình: trên môi trường dinh dưỡng đặc hoặc lỏng và trong điều kiện nuôi cấy phù hợp có thể phát hiện vi sinh vật cần tìm qua sự tăng trưởng

ưu thế của chúng so với những loài khác hoặc dựa vào những đặc tính dễ thấy như tạo sắc tố, khả năng sử dụng cơ chất đặc biệt, khả năng đề kháng với vài kháng sinh hay kim loại nặng

 Phát hiện dựa trên tính miễn dịch: phương pháp miễn dịch với chất phát huỳnh quang có thể phát hiện ngay vi sinh vật có trong mẫu tự nhiên (nước, bề mặt rễ, nốt sần, đất) Cho phép phát hiện vi khuẩn không thông qua nuôi cấy

 Phát hiện dựa trên DNA: dùng mẫu dò và lai phân tử để phát hiện vi sinh vật

2 Cách thực hành:

Trải 0,1ml dịch hỗn hợp vi sinh vật bằng que gạt thủy tinh lên các hộp petri chứa môi trường cao thịt pepton, môi trường czapek dox, môi trường Hansen, môi trường Gause Gói hộp lại Ủ ở nhiệt độ 37 trong một ngày đối với môi trường cao thịt pepton, nhiệt ℃

độ thường đối với môi trường czapek dox và môi trường Hansen, 40 trong 7 ngày đối ℃ với môi trường Gause

3 Kết quả:

 Môi trường PGA: khuẩn lạc to, có sợi khuẩn ty lớn, xù lông

 Môi trường Hansen: khuẩn lạc có kích thước bình thường, màu vàng nhạt hơi ngà, khô mọc trên bề mặt của lớp thạch

 Môi trường LB: Khuẩn lạc trong bóng, ướt, trắng vàng ngà, mọc trên bề mặt lớp thạch

 Môi trường Gause: Khuẩn lạc kích thước nhỏ, khuẩn ty nhỏ, màu trắng đục

4 Nhận xét, đánh giá:

Dựa vào những đặc điểm quan sát được trên môi trường xác định:

Trên môi trường PGA có sự hiện diện của khuẩn lạc đặc trưng cho nấm mốc

Trên môi trường Hasen có sự hiện diện của khuẩn lạc đặc trưng cho nấm men

Trên môi trường LB có sự hiện diện của khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn E.coli

Trên môi trường Gause có sự hiện diện của khuẩn lạc đặc trưng cho xạ khuẩn

Các đĩa petri môi trường này không có sự hiện diện của các khuẩn lạc lạ → thực hiện đúng thao tác vô trùng

5 Kết luận:

Khuẩn lạc trên môi trường PGA là nấm mốc

Khuẩn lạc trên môi trường Hasen là nấm men

Khuẩn lạc trên môi trường LB là vi khuẩn E.coli

Khuẩn lạc trên môi trường Gause là xạ khuẩn

THÍ NGHIỆM 2:

PHÁT HIỆN VI SINH VẬT DỰA VÀO TIÊU BẢN

1 Giới thiệu:

_ Tùy theo kích thước, vi sinh vật có thể được quan sát bằng mắt thường (quan sát thô đại) hoặc phải cần đến những thiết bị đặt biệt như kính lúp, kính hiển vi,… (quan sát hiển vi)

_ Kính hiển vi là công cụ quan trọng trong nghiên cứu hình thái và nhận diện vi sinh vật Một số kính hiển vi thường gặp:

 Kính hiển vi soi nổi: là dạng kính lúp có độ phóng đại thay đổi từ 10 lần đến 60 lần, thường dùng trong quan sát và thao tác trên những vật có kích thước tương đối lớn

 Kính hiển vi quang học: là hệ thống dùng để phóng đại vi sinh vật kích thước nhỏ

Độ phóng đại của kính có thể từ vài chục lần đến 2000 lần

 Kính hiển vi đối pha: sử dụng để quan sát vi sinh vật sống không nhuộm màu

 Kính hiển vi huỳnh quang: kính được trang bị bộ nguồn các ánh sáng kích thích có

độ dài sóng khác nhau để kích thích tạo huỳnh quang Phần lớn vi sinh vật không

có khả năng phát huỳnh quang hoặc có nhưng rất yếu

2 Cách thực hiện :

Cho một giọt nước lên lam

Dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi sinh vật hòa vào giọt nước

Đậy lamen

Đặt tiêu bản lên kính hiển vi sau đó quan sát

Đậy lamen Dùng que cấy lấy 1 ít

sinh khối vi sinh vật

3 Kết quả:

Tiêu bản nấm men: tế bào dạng hình cầu, bên trong tế bào có màu hơi vàng, một số tế bào

có nảy chồi

Tiêu bản nấm mốc: quan sát được các sợi khuẩn ty lớn, hình ống trụ dài, trên đầu khuẩn

ty có các bào tử li ti tạo thành chùm màu xanh lá.

Tiêu bản vi khuẩn E.coli: tế bào hình que, màu trắng đục, có di chuyển

Tiêu bản xạ khuản: có các sợi khuẩn ty nhỏ đan xen nhau thành chùm

4 Nhận xét, đánh giá:

Các tiêu bản dễ quan sát, hình ảnh quan sát rõ ràng, nền tiêu bản sạch

Ở tiêu bản nấm men các tế bào nằm riêng lẽ dễ dàng tìm thấy Tế bào nấm men có kích thước lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn E.coli

Ở tiêu bản vi khuẩn E.coli thấy rõ các tế bào vi khuẩn có mật độ vi khuẩn nhiều trải đều trên bề mặt quan sát

Ở hai tiêu bản xạ khuẩn và nấm mốc chỉ quan sát được các sợi khuẩn ty thành chùm

5 Kết luận

Vi sinh vật có hình dạng và kích thước đa dạng

THÍ NGHIỆM 3:

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT -XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

1 Nguyên tắc thí nghiệm

Định lượng các tế bào vi sinh vật sống hiện diện trong mẫu, định lượng chọn lọc

vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy

2 Cách thực hiện

a Pha loãng liên tiếp bậc 10 các huyền phù có độ đục khác nhau

- Chuẩn bị các ống eppendorf vô trùng chứa 0.9ml NaCl 0.85% vô trùng được đánh số từ -1 đến -7

- Hút 0.1ml huyền phù tế bào vào ống -1, đậy nắp, lắc kỹ

- Hút 0.1ml huyền phù tế bào của ống -1 cho vào ống -2, thực hiện tương tự để

có các huyền phù tế bào với các độ pha loãng 10-3 đến 10-7

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

E.coli

0.1 0.1

0.1 0.1

0.1 0.1

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

b Tạo hộp trải

- Hút 0.1ml các huyền phù có độ pha loãng 10-5 vào đĩa petri (OD610nm 0.5) Tuần

tự với 10-6 và 10-7

- Dùng que gạt thủy tinh trải đều dịch chứa tế bào lên bề mặt môi trường, để khô

và ủ ở 37oC trong 24 giờ

c Tính mật độ tế bào

- Đếm số khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi đĩa petri

Khuẩn lạc

- Tính số tế bào (N) có trong một ml huyền phù ở mỗi độ đục từ số liệu của mỗi

độ pha loãng như sau:

N = (hỏi lại)

3 Kết quả, hiện tượng

Nhóm 5 là ống 0.5

Đối với dung dịch có nồng độ 10-5: số khuẩn lạc đếm được là N = 140

Đối với dung dịch có nồng độ 10-6: số khuẩn lạc đếm được là N = 154

Đối với dung dịch có nồng độ 10-7: số khuẩn lạc đếm được là N = 155

Chỉ lấy số khuẩn lạc ở nồng độ 10-5: N = 140

Mật độ vi sinh vật ống 0.5 là (tự chú thích các giá trị n d V nhé)

thế N = 140 vào công thức C= n×d ×V N , được

1×10−5× 0.1 =140 ×10

6CFU /ml

4 Biện luận

5 Kết luận thí nghiệm

THÍ NGHIỆM 4:

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC

1 Nguyên tắc thí nghiệm

Độ đục huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỉ lệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ

tế bào và độ đục Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy đo OD ở các bước sóng từ 550 – 610nm

2 Cách thực hiện

a Xây dựng đường tương quan log(N/ml) theo OD 610nm

Mật độ 52.7 76 140

b Xác định mật độ tế bào theo độ đục

- Đo OD dung dịch nền: ĐỂ?

- Đo độ đục của một huyền phù tế bào E.coli (2ml) có mật độ chưa biết

Dung dịch nền

Đo OD

Đo OD

E.coli

- Nếu trị số OD610nm của huyền phù tế bào E.coli đo được nằm ngoài đường tương quan giữa log(N/ml) và độ đục OD610nm  Pha loãng với số lần tương ứng (3 lần)

- Từ trị số OD610nm đo được nằm trong đường chuẩn, suy ra số log(N/ml) dựa vào log(N/ml) và độ đục OD610nm

Công thức:

3 Kết quả, hiện tượng

OD của mẫu ĐL trước khi pha loãng: 1.077

OD của mẫu ĐL sau khi pha loãng 3 lần: 0.340

Dựa vào phương trình đường chuẩn y=181.93x + 23.527 với y là mật độ vi sinh vật (CFU/ml), x là OD; thay x= 0.340 vào phương trình đường chuẩn:

y=181.93 × 0.340+23.527=85.3832≈ 85.38×106CFU /ml

Mật độ vi sinh vật trong mẫu đã pha loãng là 85.38 ×106 CFU/ml

Suy ra mật độ vi sinh vật trong 1ml mẫu trước khi pha loãng 3 lần là

85.38 ×106×3=256.14 × 106 CFU/ml

4 Biện luận

5 Kết luận thí nghiệm

Thêm vào dưới cái đường chuẩn cái này nè

Phương trình đường chuẩn y = 181.93x + 23.527 có R2 =0.9979

Trong đó:

y ×106 là mật độ vi sinh vật trong 1ml mẫu (CFU/ml)

x là OD

THÍ NGHIỆM 5:

KIỂM SOÁT TĂNG TRƯỞNG VI SINH VẬT BỞI KHÁNG SINH

1 Nguyên tắc

 Kháng sinh:

 Nhóm các sản phẩm chuyển hóa tạo bởi vi sinh vật có tác dụng ức chế sự tăng trưởng hoặc tiêu diệt vi sinh vật khác

 Có độc tính chọn lọc và chuyên biệt

 Mức độc tính khác nhau lên các vi sinh vật khác nhau

 Nhiều vi sinh vật có tính mẫn cảm với kháng sinh nên có thể kiểm soát bằng kháng sinh  Ngày nay kháng sinh được sử dụng để kiểm soát và tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm, điều trị các bệnh gây ra bởi sinh vật này

 Tính mẫn cảm của một vi sinh vật đối với kháng sinh được quan sát bằng thực nghiệm dựa trên kỹ thuật đĩa kháng sinh và vòng vô khuẩn

 Ở thí nghiệm này, sử dụng môi trường dinh dưỡng là môt trường LB, dịch vi khuẩn được bôi lên môi trường sau đố đi ủ để phát triển sinh khối Một đĩa giấy vô trùng được tẩm kháng sinh ở một liều lượng nhất định được đặt lên một hộp petri môi trường rắn chứa các vi sinh vật mục tiêu

 Kháng sinh sẽ khuếch tán trong môi trường và nồng độ sẽ giảm dần theo bình phương cự ly khuếch tán Và ở một cự ly nhất định, nồng độ kháng sinh không đủ

để ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật được nữa  tạo vòng vô khuẩn

 Kỹ thuật này dùng để sàng lọc và xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn hay hoạt tính kháng khuẩn của các loại kháng sinh và hợp chất kháng khuẩn

2 Cách thực hiện

Kiểm soát tăng trưởng của vi khuẩn E.coli bằng kháng sinh Ampicillin (Amp) và

Kanamycin (Kan)

Kan Amp

Ủ 37 o C trong 24 giờ.

Bôi dịch

vi khuẩn

Đặt đĩa giấy

vô trùng

5µl 5µl

Kan Amp

Kan Amp

LB rắn

3 Kết quả

 Đĩa petri đã bôi sinh khối E.coli sau khi ủ có xuất hiện một lớp trắng ngà, hơi trong và bóng, nhưng ở tại đĩa giấy có tẩm kháng sinh lại xuất hiện vùng tròn không có hiện trượng bì xảy ra (không xuất hiện lớp sinh khối vi khuẩn):

 Đĩa giấy tẩm kháng sinh Amp: có vùng tròn lớn, rõ ràng

 Đĩa giấy tẩm kháng sinh Kan: có vùng tròn rất nhỏ và mờ nhạt

4 Giải thích:

 Xung quanh đĩa giấy có tẩm kháng sinh có vùng tròn không có sinh khối vi khuẩn, vùng đó gọi là vòng vô khuẩn Do kháng sinh có độc tính ức chế sự tăng trưởng, làm tiêu diệt vi sinh vật nên ngay tại vùng quanh đĩa giấy, ở một cự ly nhất định nơi có đủ nồng độ kháng sinh khuếch tán thì vi khuẩn E.coli không thể tăng trưởng hoặc đã bị tiêu diệt

 Tùy vào độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh mà vi khuẩn khác nhau thì độc tính của kháng sinh đối với vi khuẩn cũng khác nhau Vì vậy:

 Đĩa kháng sinh Amp thì vòng vô khuẩn lớn hơn, rõ hơn: bởi E.coli nhạy cảm với Amp hơn, nên mức độ thể hiện độc tính của Amp ở E.coli cao, E.coli dễ bị

ức chế

 Đĩa kháng sinh Kan thì vòng vô khuẩn rất nhỏ, mờ: bởi E.coli không quá nhạy cảm với Kan nên mức độ thể hiện độc tính của Kan ở E.coli thấp, E.coli ít bị

ức chế và bị ức chế ở nồng độ cao hơn nhiều so với Amp

5 Kết luận

 Kháng sinh có thể ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật nhưng tùy vào mỗi loại vi sinh vật khác nhau mà mức độ ức chế của kháng sinh cũng khác nhau  kháng sinh có độc tính chọn lọc và chuyên chuyên biệt cho từng loại vi sinh vật

 Đối với E.coli kháng sinh Amp thể hiện độc tính mạnh hơn và ức chế vi khuẩn tốt hơn so với kháng sinh Kan

THÍ NGHIỆM 6:

PHÁT HIỆN HOẠT TÍNH ENZYME CATALASE Ở VI SINH VẬT

1 Giới thiệu

 Catalase: enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và phải phóng oxi phân tử

 H2O2:

 Được tạo ra trong các phản ứng oxy hóa khử bắt cặp với oxi phân tử trong chuỗi hô hấp

 Có độc tính đối với tế bào làm phá hủy thành phần trong tế bào

 Hầu hết vi sinh vật cần có Catalase để phân giải H2O2 tránh tụ trong tế bào.

 Sử dụng môi trường thạch rắn LB để cấy vi sinh vật để cho phát triển sinh khối Hoạt tính enzyme catalase được phát hiện ở vi sinh vật bằng cách bổ sung vài giọt hydrogen peroxide lên sinh khối của vi sinh vật và theo dõi sự sủi bọt do O2 được phóng thích

2 Cách thực hiện

Phát hiện hoạt tính catalase ở 3 chủng vi sinh vật là “E”, ”B”, ”L”

3 Kết quả

 Tại vùng sinh khối của chủng “B” có nhỏ H2O2: có hiện tượng sủi bọt mạnh, bọt khí to

 Tại vùng sinh khối của chủng “E” có nhỏ H2O2: có hiện tượng sủi bọt nhẹ, bọt khí

li ti

 Tại vùng sinh khối của chủng “L” có nhỏ H2O2: không có hiện tượng sủi bọt

4 Nhận xét

 Tại vùng sinh khối của chủng “B” và “E” có nhỏ H2O2: do có sự hoạt động của enzyme catalase nên đã thủy phân H2O2 tạo thành H2O và O2 từ đó mà có hiện tượng sủi bọt khí

H 2 O 2

E.col E.col

L

B E

 Tại cùng sinh khối của chủng “L” có nhỏ H2O2: không có enzyme catalase nên không thể thực hiện quá trình phân hủy H2O2 để tạo ra O2 từ đó không có hiện tượng sủi bọt khí

5 Kết luận

 Các chủng vi khuẩn “B”, “E” đều có enzyme catalase hoạt động để phân giải H2O2 tránh gây tổn thương cho tế bào

 Chủng vi khuẩn “L” không có enzyme catalase nên không phân giải được H2O2

THÍ NGHIỆM 7:

PHÁT HIỆN HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE Ở VI SINH VẬT

1 Giới thiệu

 Enzyme amylase: xúc tác cho phản ứng phân hủy tinh bột thành đường maltose

 Maltose: có tính tan tốt hơn tinh bột, có thể đi vào tế bào và được dùng làm nguồn năng lượng, carbon

 Cần amylase để phân cắt tinh bột

 Tinh bột là polysaccharide có cấu trúc không gian khá phức tạp và có thể hấp phụ iod cho màu xanh đen Trong thí nghiệm này sẽ sử dụng LB – tinh bột làm môt trường dinh dưỡng và vi sinh vật sẽ được cấy lên đĩa petri, đem đi ủ cho đến khi thấy sự phát triển Sau đó sẽ được nhỏ dung dịch lugol vào

 Khi môi trường chứa tinh bột được nhuộm bằng dung dịch lugol, có chứa iod, thì iod bị giữ lại trong cấu trúc không gian của tinh bột làm cho môi trường xuất hiện màu xanh đen

 Nếu vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột thì cấu trúc này sẽ bị phá vỡ, do vậy quanh sinh khối của vi sinh vật sẽ không có màu xanh đậm

2 Cách thực hiện

Phát hiện hoạt tính amylase ở 3 chủng vi sinh vật là “E”, ”B”, ”L”

Iod

E.c E.c

L

B E

3 Kết quả

 Tại vùng sinh khối của chủng “B” có nhỏ lugol: vùng quanh sinh khối của vi sinh vật có màu vàng nâu của lugol

 Tại vùng sinh khối của chủng “E” có nhỏ lugol: dung dịch lugol chuyển sang màu xanh đen trong môi trường và ngay mép sinh khối của vi sinh vật cũng chuyển sang màu xanh đen

 Tại vùng sinh khối của chủng “L” có nhỏ lugol:

4 Nhận xét

 Tại vùng sinh khối của chủng “B” có nhỏ dung dịch lugol: nhờ sự có mặt của enzyme amylase mà những phân tử tinh bột xung quanh sinh khối vi sinh vật được phân giải, tinh bột không còn cấu trúc không gian ban đầu nên tại vùng xung quanh gần sinh khối của chủng “B” chỉ có màu vàng nâu của dung dịch lugol

 Tại vùng sinh khối của chủng “E” có nhỏ dung dịch lugol: do không có enzyme amylase nên tinh bột ngay tại vùng sinh khối vi sinh vật không bị phân giải, tinh bột vẫn giữ được cấu trúc không gian nên khi cho dung dịch lugol vào thì chuyển sang màu xanh đậm

 Tại vùng sinh khối của chủng “L” có nhỏ dung dịch lugol:

5 Kết luận

 Chủng “B”: có enzyme ngoại bào amylase xúc tác thủy phân tinh bột thành

maltose nên lugol xung quanh sinh khối không chuyển màu vàng nâu sang xanh đen

 Chủng “E”: không có enzyme ngoại bào amylase nên tinh bột không bị thủy phân nên chỉ thấy màu xanh đen do tinh bột hấp phụ iod

 Chủng “L”: