Nghiên cứu tình hình và giá trị tầm soát ung thư cổ tử cung bằng phương pháp cyprep pap test phối hợp xét nghiệm hpv genotype realtime pcr ở phụ nữ khám phụ khoa tại bệnh viện quốc tế phương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠLÊ TRUNG TÍN NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH VÀ GIÁ TRỊ TẦM SOÁT UNG THƯ CỔ TỬ CUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CYPREP PAP TEST PHỐI HỢP XÉT NGHIỆM HPV GENOTYPE REALTIME PCR Ở PH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LÊ TRUNG TÍN

NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH VÀ GIÁ TRỊ TẦM SOÁT

UNG THƯ CỔ TỬ CUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CYPREP PAP TEST PHỐI HỢP XÉT NGHIỆM HPV GENOTYPE REALTIME PCR Ở PHỤ NỮ KHÁM PHỤ KHOA TẠI BỆNH VIỆN QUỐC TẾ PHƯƠNG CHÂU NĂM 2021-2022

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Cần Thơ – 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LÊ TRUNG TÍN

NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH VÀ GIÁ TRỊ TẦM SOÁT

UNG THƯ CỔ TỬ CUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

CYPREP PAP TEST PHỐI HỢP XÉT NGHIỆM HPV GENOTYPE REALTIME PCR Ở PHỤ NỮ KHÁM PHỤ KHOA TẠI BỆNH VIỆN QUỐC TẾ PHƯƠNG CHÂU NĂM 2021-2022

Chuyên ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y Học

Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS.BS NGUYỄN HỒNG PHONG

Cần Thơ – 2022

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào

Tác giả luận văn

Lê Trung Tín

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của nhà trường, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Khoa Điều dưỡng – Kỹ thuật Y học của Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho phép tôi học tập và nghiên cứu Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám đốc, Ban lãnh đạo và tập thể Khoa Xét nghiệm của Bệnh viện Quốc tế Phương Châu đã tạo điều kiện và động viên tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin được bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến TS.BS Nguyễn Hồng Phong

là người trực tiếp hướng dẫn đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm, góp ý sữa chữa và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Lê Trung Tín

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các sơ đồ, biểu đồ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giải phẫu, mô học cổ tử cung 3

1.2 Một số phương pháp tầm soát ung thư cổ tử cung và một số yếu tố liên quan đến tầm soát ung thư cổ tử cung 5

1.3 Giá trị của các phương pháp xét nghiệm tầm soát ung thư cổ tử cung 12

1.4 Tình hình nghiên cứu về tầm soát ung thư cổ tử cung 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3 Đạo đức trong nghiên cứu 33

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 35

3.2 Phân bố tỷ lệ dương tính của Cyprep Pap test, HPV genotype realtime PCR, Co-testing và một số yếu tố liên quan 37

3.3 Giá trị độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của Cyprep Pap test, HPV genotype realtime PCR, Co-testing 46

Chương 4 BÀN LUẬN 50

4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 50

4.3 Giá trị độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của Cyprep Pap test, HPV genotype realtime PCR, Co-testing 60

KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ASC-US Atypical Squamous Cells of Undertermined Significance

Tế bào gai không điển hình có ý nghĩa không xác định CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia

Tân sinh trong biểu mô cổ tử cung DNA Deoxyribonucleic Acide

HPV Human papillomavirus

HSIL High - grade Squamous Intraepithelial Lesion

Tổn thương trong biểu mô mức độ cao LSIL Low - grade Squamous Intraepithelial Lesion

Tổn thương trong biểu mô mức độ thấp NPV Negative Predicted Value

Giá trị tiên đoán âm Pap smear Phết tế bào cổ tử cung

PCR Polymerase Chain Reaction

Phản ứng khuyếch đại chuỗi PPV Positive Predicted Value

Giá trị tiên đoán dương

Độ nhạy

Độ đặc hiệu UTCTC Ung thư cổ tử cung

Bảng 2.1: Tương quan giữa kết quả xét nghiệm và tiêu chuẩn vàng 22

Bảng 2.2: Bộ xét nghiệm IVD NK PCR-PVI 25

Bảng 2.3: Bộ xét nghiệm IVD NK PCR-PVII 26

Bảng 2.4: Bộ IVD NK DNARNAprep-MAGBEAD 26

Bảng 2.5: Xác định kết quả của mẫu với master mix tương ứng 29

Bảng 3.1: Sự phân bố của đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi 35

Bảng 3.2: Sự phân bố của đối tượng nghiên cứu theo địa dư 35

Bảng 3.3: Sự phân bố của đối tượng nghiên cứu theo trình độ học vấn 36

Bảng 3.4: Sự phân bố của đối tượng nghiên cứu theo nghề nghiệp 36

Bảng 3.5: Phân bố kết quả tầm soát của xét nghiệm Cyprep Pap test 37

Bảng 3.6: Phân bố kết quả HPV dương tính 38

Bảng 3.7: Phân bố tỷ lệ týp HPV 39

Bảng 3.8: Phân bố tỷ lệ kết quả Co-testing 40

Bảng 3.9: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo tuổi 41

Bảng 3.10: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo nơi cư trú 41

Bảng 3.11: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo trình độ học vấn 42

Bảng 3.12: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo nghề nghiệp 42

Bảng 3.13: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo tuổi lập gia đình 43

Bảng 3.14: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo tình trạng hôn nhân 43

Bảng 3.15: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo số lần mang thai 44

Bảng 3.16: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo tình trạng kinh nguyệt 44

Bảng 3.17: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo biện pháp tránh thai 45

Bảng 3.18: Phân bố kết quả tầm soát UTCTC theo viêm cổ tử cung 45

Bảng 3.19: Phân bố tỷ lệ kết quả giải phẫu bệnh cổ tử cung 46

Bảng 3.20: Tương quan kết quả Cyprep Pap test so với giải phẫu bệnh 47

Bảng 3.23: Giá trị của HPV genotype realtime PCR so với giải phẫu bệnh 48 Bảng 3.24: Tương quan các kết quả Co-testing so với giải phẫu bệnh 49 Bảng 3.25: Giá trị của Co-testing so với giải phẫu bệnh 49 Bảng 4.1: Tỷ lệ tế bào học cổ tử cung bất thường trong một số nghiên cứu 52 Bảng 4.2: Tỷ lệ dương tính HPV-DNA của một số nghiên cứu 55

Hình 1.1: Tử cung: những thay đổi theo tuổi tác và mô hình cơ 3

Hình 1.2: Tế bào bề mặt và trung gian 4

Hình 1.3: Phương pháp xử lý tế bào học bằng màng lọc kép 5

Hình 1.4: ASC-US 7

Hình 1.5: LSIL 8

Hình 1.6: HSIL 9

Hình 1.7: Carcinôm 9

Hình 1.8: CIN I (a) và CIN III (b) 13

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 33

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ kết quả Cyprep Pap test 37

Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ kết quả của HPV genotype realtime PCR 38

Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ kết quả của Co-testing 40

MỞ ĐẦU

Ung thư cổ tử cung là bệnh lý ác tính của biểu mô cổ tử cung, là một trong những bệnh phổ biến trong các loại ung thư đối với phụ nữ trên toàn thế giới và đứng thứ hai sau ung thư vú [2], [3] Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính có khoảng 570.000 trường hợp ung thư cổ tử cung mới được báo cáo trên toàn thế giới trong năm 2018, với khoảng 311.000 trường hợp tử vong Khoảng 90% trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung xảy ra ở các khu vực đang phát triển trên thế giới Dự báo sẽ tăng 700.000 trường hợp mắc mới và khoảng 400.000 trường hợp tử vong do ung thư cổ tử cung vào năm 2030 [56] Tại Việt Nam, năm 2010 có 5.664 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung, tỷ lệ mắc mới ung thư cổ tử cung đã chuẩn hóa theo tuổi là 13,6/100.000 phụ nữ Tỷ lệ này đang

có xu hướng gia tăng, đặc biệt tại một số tỉnh như Cần Thơ, tỷ lệ mắc thô tăng

từ 15,7/100.000 vào năm 2000 lên tới 25,7/100.000 vào năm 2009 Một trong những lý do dẫn đến tình trạng này là phụ nữ chưa được sàng lọc định kỳ và có

hệ thống để phát hiện sớm ung thư qua các xét nghiệm thích hợp, dễ tiếp cận

và khi phát hiện tổn thương tiền ung thư thì cũng chưa được điều trị kịp thời và hiệu quả [2]

Nhu cầu sàng lọc sớm ung thư cổ tử cung ngày càng tăng, các phương pháp tầm soát đã được phát triển từ Pap smear truyền thống để đánh giá tế bào

cổ tử cung, đến sự cải tiến trong kỹ thuật tế bào học cổ tử cung bằng phương pháp nhúng dịch Liqui prep Từ đó nhiều công ty đã phát triển kỹ thuật đặc trưng cho riêng mình, trong đó có xét nghiệm Cyprep Pap test được cải tiến dựa trên Pap smear truyền thống để cải thiện hiệu quả đánh giá tế bào học Tiếp đến

là kỹ thuật sinh học phân tử dần dần được áp dụng nhiều trong các công cụ sàng lọc bệnh hiện đại, trong đó là kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện sớm tác nhân chính gây bệnh ung thư cổ tử cung là virus Human papillomavirus Nhưng

theo khuyến cáo của các tổ chức y tế uy tín thì việc thực hiện các xét nghiệm tầm soát đơn lẻ còn hạn chế khi bỏ sót các trường hợp bệnh, vì thế việc kết hợp giữa xét nghiệm tế bào học và HPV-DNA PCR được đề xuất thực hiện và được gọi là phương pháp Co-testing [38]

Bệnh viện Quốc tế Phương Châu hàng năm tiếp nhận thăm khám tầm soát ung thư cổ tử cung cho hơn 6000 bệnh nhân bằng Cyprep Pap test, xét nghiệm HPV genotype realtime PCR và Co-testing Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào so sánh giá trị tầm soát ung thử cổ tử cung của những phương pháp này Do đó xác định giá trị của các phương pháp là cần thiết để định hướng lựa chọn phương pháp tầm soát ung thư cổ tử cung phù hợp cho bệnh nhân Vì vậy

chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tình hình và giá trị tầm soát ung thư

cổ tử cung bằng phương pháp Cyprep Pap test phối hợp xét nghiệm HPV genotype realtime PCR ở phụ nữ khám phụ khoa tại Bệnh viện Quốc tế Phương Châu năm 2021-2022” với các mục tiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ dương tính của Cyprep Pap test, HPV genotype realtime PCR, Co-testing và một số yếu tố liên quan trong tầm soát ung thư cổ tử cung

ở phụ nữ khám phụ khoa tại Bệnh viện Quốc tế Phương Châu từ tháng 4/2021 đến tháng 2/2022

2 Xác định giá trị độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của Cyprep Pap test, HPV genotype realtime PCR, Co-testing so với tiêu chuẩn vàng mô bệnh học ở phụ nữ khám phụ khoa có kết quả soi cổ tử cung bất thường tại Bệnh viện Quốc tế Phương Châu từ tháng 4/2021 đến tháng 2/2022

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giải phẫu, mô học cổ tử cung

Cổ tử cung có hình nón cụt, là phần cuối của tử cung và nhô vào trong

âm đạo Cổ tử cung có màu hồng nhạt và trung tâm là lỗ cổ tử cung Lỗ cổ tử cung chia tử cung làm hai phần: phần trên âm đạo (tương ứng cổ trong về mặt

mô học) và phần nhô vào trong âm đạo (tương ứng cổ ngoài mô học) Vùng niêm mạc tiếp giáp giữa cổ ngoài và cổ trong gọi là vùng chuyển tiếp [20], [30]

Phụ nữ chưa sinh có cổ tử cung trơn láng, trong đều, mật độ chắc, lỗ ngoài tròn Sau sinh đẻ, cổ tử cung trở nên dẹp, mật độ mềm, lỗ ngoài rộng ra

và không tròn đều như trước lúc chưa đẻ [20], [30]

Hình 1.1: Tử cung: những thay đổi theo tuổi tác và mô hình cơ

(Nguồn: Atlas Giải phẫu người, 2007 [17]) Mặt ngoài cổ tử cung là biểu mô gai không sừng hóa, thay đổi phụ thuộc vào estrogen theo từng lứa tuổi của phụ nữ: thời kỳ sinh sản niêm mạc cổ tử cung dày, nhiều lớp, giàu glycogen, sau sinh lượng estrogen giảm dần đến cuối tháng thứ nhất với hình ảnh niêm mạc cổ tử cung còn lại từ 1-2 lớp tế bào mầm

và mất glycogen Tuổi dậy thì lượng estrogen tăng dần làm cho niêm mạc cổ

tử cung phát triển và gần giống như phụ nữ đang hoạt động sinh dục [30], [50]

Cổ ngoài cổ tử cung: bao phủ bởi biểu mô gai, lớp này có từ 15-20 lớp,

đi từ đáy tiến dần lên bề mặt theo thứ tự cao dần về độ trưởng thành Đối phụ

nữ đang hoạt động sinh dục, niêm mạc cổ tử cung gồm các lớp [30], [50]:

Lớp tế bào đáy: gồm một hàng tế bào hình tròn hay hình bầu dục nằm

sát màng đáy, che phủ màng đệm, tế bào nhỏ- nhân to ưa kiềm Trong nhân có nhiễm sắc thể rất mịn và tiểu nhân rõ

Lớp tế bào cạnh đáy: vài lớp tế bào trong hay đa diện, nhân tương đối

to ưa kiềm Nhân tròn, bầu dục, hạt nhiễm sắc mịn, tỷ lệ nhân-bào tương gần bằng nhau

Lớp tế bào trung gian: được phát triển từ lớp tế bào cận đáy, tế bào dẹt,

hình đa giác, bào tương lớn chứa nhiều glycogen, nhân nhỏ tròn ở trung tâm

Lớp bề mặt: gồm nhiều tế bào trưởng thành nhất của lớp biểu mô lát cổ

tử cung Tế bào dẹt, nguyên sinh chất trong suốt nhuộm màu kiềm, có mức độ sừng hóa nhẹ Tế bào bề mặt có nhân đông và nhỏ

Hình 1.2: Tế bào bề mặt và trung gian

(Nguồn: The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology, 2015 [50])

Cổ trong tử cung: được bao phủ bởi biểu mô trụ đơn, gồm: tế bào chế

tiết và tế bào trụ có lông chuyển Bên dưới là mô đệm chứa các ông tuyến chế nhầy hình ống đơn hay chia nhánh mở vào ống cổ tử cung [30], [50]

Vùng chuyển tiếp giữa cổ trong và cổ ngoài cổ tử cung: là vùng có vị

trí giải phẫu thay đổi theo tuổi Khi dậy thì, ở tuổi hoạt động tình dục mạnh thì vùng chuyển tiếp có thể thấy cổ ngoài, khi mãn kinh thì vùng chuyển tiếp thu vào trong ống cổ tử cung Trên mô học, vùng chuyển tiếp có thể thấy biểu mô gai dị sản, quá sản tế bào dự trữ Tuy nhiên, ở một số phụ nữ, vùng chuyển tiếp đột ngột chuyển từ biểu mô gai sang biểu mô trụ đơn Những biến đổi tiền ung thư và ung thư cổ tử cung (UTCTC) thường diễn ra đầu tiên ở vùng chuyển tiếp, đây là vùng có ý nghĩa quan trọng sinh bệnh học [30], [50]

1.2 Một số phương pháp tầm soát ung thư cổ tử cung và một số yếu tố liên quan đến tầm soát ung thư cổ tử cung

1.2.1 Cyprep Pap Test

Cyprep Pap Test được phát triển bởi công ty Fjord Diagnostics Sdn Bhd

là xét nghiệm tế bào học dựa trên phương pháp Pap smear để tầm soát ung thư

cổ tử cung, nhưng được cải tiến nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện bất thường

tế bào học cũng như khắc phục các hạn chế của các phương pháp trước đó [41]

Hình 1.3: Phương pháp xử lý tế bào học bằng màng lọc kép

(Nguồn: The CYPREP® Advantage, 2020 [41])

Phương pháp có khả năng lưu trữ mẫu lâu dài mà không gây biến dạng

tế bào Các tế bào được phân tán mang tính ngẫu nhiên cùng các chất không liên quan trong khi xử lý tiêu bản xét nghiệm Các tế bào được tập trung tại một vùng giữa lam kính nhưng không bị chồng chất lên nhau mà mỏng đơn lớp, giúp quang trường trên tiêu bản lam rõ nét giúp cho việc đọc kết quả dễ dàng Phương pháp xử lý mẫu tự động với hệ thống màng lọc kép gồm màng lọc trên

có kích thước lỗ lớn 9-10 m và màng lọc dưới có kích thước nhỏ hơn 7-8 m

sẽ thích hợp giữ lại các tế bào có kích thước với đường kính màng lọc tương đương 20mm, sau khi thu nhận các mẫu tế bào sẽ được áp chuyển lên trên lam kính và cho ra tiêu bản sàng lọc Kết quả tế bào học được phân loại theo các danh pháp Bethesda với khả năng tăng độ nhạy, độ đặc hiệu và giảm thiểu tỷ lệ

âm tính giả so với Pap smear truyền thống [41]

Các thay đổi tế bào không tân sinh: chuyển sản lát, các thay đổi sừng

hóa, chuyển sản vòi tử cung, thiểu dưỡng, thay đổi liên quan thai nghén [3]

Các thay đổi tế bào dạng phản ứng liên quan với: những biến đổi tế

bào phản ứng là những biến đổi mà bản chất lành tính, đi kèm với viêm (kể cả tái tạo điển hình), với teo kèm viêm (viêm teo âm đạo), với xạ trị, với dụng cụ

tử cung, tình trạng tế bào tuyến sau cắt tử cung và những nguyên nhân không đặc hiệu khác [3], [50]

Tế bào gai không điển hình có ý nghĩa không xác định (Atypical Squamous Cells of Undertermined Significance – ASC-US): bất thường tế bào

rõ rệt hơn những bất thường do biến đổi phản ứng nhưng về số lượng và chất lượng thì không đến mức chẩn đoán là tổn thương trong biểu mô gai (Squamous Intraepithelial Lesions – SIL) vì biến đổi tế bào trong loại ASC-US có thể hoặc

là một biến đổi rất lành tính, hoặc là tổn thương có tiềm năng ác tính, loại nào thì không thể phân loại chắc chắn, nên chúng được diễn giải là có ý nghĩa không xác định Phiến đồ tế bào học cho thấy hình ảnh nhân to gấp 2,5-3 lần nhân tế

bào gai trung gian bình thường kèm sự tăng nhẹ tỷ lệ nhân/bào tương Có thể thấy sự thay đổi về kích thước và hình dạng nhân và nhân đôi Có thể có sự tăng sắc nhẹ, nhưng chất nhiễm sắc vẫn phân bố đều mà không có dạng hạt Có thể thấy đường viền nhân trơn láng và đều đặn, rất ít méo mó [50]

Hình 1.4: ASC-US

(Nguồn: The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology, 2015 [50])

Tổn thương trong biểu mô gai (SIL): là tổn thương trong biểu mô gai

bao gồm một loạt những bất thường biểu mô cổ tử cung không có tính xâm lấn

mà được phân loại cổ điển là condylome phẳng, loạn sản/carcinôm tại chỗ, và tân sinh trong biểu mô cổ tử cung (Cervical Intraepithelial Neoplasm – CIN) Theo Bethesda, loại bất thường này được chia thành tổn thương grade thấp và

grade cao Tổn thương grade thấp bao gồm: những biến đổi tế bào do tác động của Human papillomavirus (HPV), loạn sản nhẹ/CIN 1 Tổn thương grade cao

bao gồm: loạn sản vừa, loạn sản nặng, và carcinôm tại chỗ hoặc CIN 2,3 [50]

Tổn thương trong biểu mô gai grade thấp (Low grade Squamous Intraepithelial Leision – LSIL): tế bào đứng riêng lẻ hoặc thành mảng Những

bất thường nhân chủ yếu có ở trong những tế bào có bào tương trưởng thành hoặc bào tương loại tế bào nông Nhân to ít nhất 3 lần diện tích nhân tế bào trung gian bình thường, làm cho tỷ lệ nhân/bào tương tăng Nhân có kích thước

và hình dạng khác nhau vừa phải Thường có hai hoặc nhiều nhân Có tăng sắc

và chất nhiễm sắc phân bố đồng đều, xen kẽ có chất nhiễm sắc dạng thoái hóa hoặc chất nhiễm sắc không đều đi kèm với những biến đổi tế bào do nhiễm Human papillomavirus Có thể thấy rõ màng nhân có méo mó ít hoặc có thể không thấy rõ màng nhân khi chất nhiễm sắc không đều Có bờ viền tế bào rõ ràng Tế bào nếu có khoảng quanh nhân sáng rõ và giới hạn rõ và một vành bào tương dầy đặc ở mép ngoài thì cũng phải có những bất thường nhân của, các

khoảng sáng quanh nhân không có bất thường nhân không được xếp vào chẩn

đoán này [50]

Hình 1.5: LSIL

(Nguồn: The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology, 2015 [50])

Tổn thương trong biểu mô gai grade cao (High grade Squamous Intraepithelial Leision – HSIL): các tế bào thường đứng riêng lẻ, thành mảng,

hoặc thành đám dạng hợp bào Bất thường nhân rõ rệt ở các tế bào gai có bào tương chuyển sản “non”, giống như ren, và mỏng mảnh hoặc dầy đặc, đôi khi bào tương “trưởng thành” và sừng hóa dầy đặc Nhân to ở mức độ như trong LSIL nhưng diện tích bào tương giảm, dẫn đến tăng đáng kể tỷ lệ nhân/bào tương; ở những tế bào có tỷ lệ nhân/bào tương cao, sự to nhân ít hơn sự to nhân trong LSIL Kích thước tế bào trong HSIL nhỏ hơn trong LSIL Tăng sắc rõ rệt,

chất nhiễm sắc có thể dạng hạt mịn hoặc thô và phân bố đồng đều Hạt nhân thường không có, đường viền nhân méo mó [50]

Hình 1.6: HSIL

(Nguồn: The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology, 2015 [50])

Carcinôm: là u xâm lấn ác tính, tế bào đứng riêng lẻ hoặc thành đám

dạng hợp bào Các tế bào có đặc điểm của HSIL nhưng thêm vào đó có hạt nhân to rõ rệt và sự phân bố chất nhiễm sắc không đều rõ rệt, gồm kết cục chất nhiễm sắc thô và tạo vùng sáng quanh chất nhiễm sắc Thường kèm nền của u gồm những mảnh vỡ hoại tử và máu cũ [50]

Hình 1.7: Carcinôm

(Nguồn: The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology, 2015 [50])

Một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ bất thường tế bào học cổ tử cung, trong

đó Huỳnh Văn Tú đánh giá bao gồm nơi cư trú, viêm sinh dục, và kết quả soi

sổ tử cung [25] Ngoài ra nhóm tuổi cũng là một yếu tố quan trọng theo sự nhận định của Nguyễn Duy Tài, cho thấy độ tuổi càng cao thì nguy cơ bất thường tế bào học cổ tử cung cũng càng tăng do sự biến đổi tế bào cổ tử cung theo độ tuổi

ở phụ nữ [22] Nghiên cứu của Nguyễn Kim Thanh Lan chỉ ra rằng các yếu tố liên quan đến bất thường tế bào cổ tử cung gồm: trình độ văn hóa, tuổi quan hệ tình dục, nguồn nước sinh hoạt, số lần khám phụ khoa, tiền căn viêm âm đạo [13] Ngoài ra, tác giả Lê Anh Tuấn có ghi nhận trình độ học vấn và tiền sử phụ khoa là hai yếu tố có ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm tế bào học cổ tử cung [26] Tác giả Eman Al Sekri có đánh giá các yếu tố liên quan đến tỷ lệ bất thường tế bào học trong đó chỉ ghi nhận tiền sử nhiễm HPV là có liên quan, còn các yếu tố nhóm tuổi, mang thai sớm, sử dụng biện pháp tránh thai, tiền sử gia đình mắc ung thư cổ tử cung thì không có mối liên quan [36]

1.2.2 HPV genotype realtime PCR

Human papillomavirus (HPV) là tác nhân gây tổn thương tiền ung thư

và ung thư cổ tử cung do tình trạng nhiễm các týp HPV nguy cơ cao kéo dài gây nên các biến đổi tế bào HPV týp 16, 18 chiếm khoảng 70% nguyên nhân gây ung thư cổ tử cung Do không thể nuôi cấy virus HPV theo kiểu kinh điển

và các test huyết thanh có độ nhạy thấp, chẩn đoán nhiễm HPV đòi hỏi phải phát hiện Deoxyribonucleic Acide (DNA) của nó trong mẫu bệnh phẩm tế bào

từ cổ tử cung

Xét nghiệm HPV DNA có độ nhạy cảm hơn xét nghiệm tế bào học Một xét nghiệm HPV DNA có thể phát hiện 90% tiền ung thư và ung thư Do đó, giá trị dự đoán âm tính của xét nghiệm HPV tốt hơn nhiều so với tế bào học và cho phép kéo dài khoảng thời gian sàng lọc một cách an toàn [40] Xét nghiệm

HPV DNA dễ dàng thực hiện, độ nhạy cảm cao nên đã được là lựa chọn ưu tiên trong nhiều chiến dịch tầm soát ung thư cổ tử cung trên toàn cầu [37]

Hiện nay, có rất nhiều xét nghiệm HPV nhằm xác định DNA của virus trong mẫu bệnh phẩm lấy từ cổ tử cung Trong đó kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp khuếch đại chuỗi gen từ các cặp mồi của HPV được chọn vùng gen bảo tồn cao giữa các týp HPV và có thể định lượng nồng

độ virus trong mẫu bệnh phẩm nhờ vào kỹ thuật realtime PCR Ngoài ra, kỹ thuật realtime PCR sử dụng mẫu dò Taqman để khuếch đại đoạn DNA đích thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong qua trình phản ứng

để phát hiện virus HPV và xác định týp HPV có mặt trong mẫu bệnh phẩm Quá trình ly trích DNA từ mẫu bệnh phẩm được dựa trên công nghệ tách chiết

và tinh sạch DNA bằng hạt từ tính giúp đạt hiệu suất cao [1], [8], [23], [56]

Một số yếu tố liên quan đến nhiễm Human Papilloma virus bao gồm độ tuổi, trình độ học vấn trên trung học phổ thông, nơi cư trú, số lần mang thai, số bạn tình của phụ nữ và người chồng [23] Ngoài ra còn có tác giả Bùi Thị Thu Hương và Hồ Thị Phương Thảo có kết luận có sự liên quan giữ tỷ lệ HPV dương tính và tuổi, trong đó các bệnh nhân dương tính HPV dưới 35 tuổi cao hơn nhóm tuổi trên 35 tuổi [11], [29] Tác giả Fabiola Hernández-Rosas cho rằng yếu tố liên quan đến nhiễm HPV là tuổi và nghề nghiệp, còn các yếu tố trình độ học vấn và tình trạng hôn nhân chưa ghi nhận liên quan [44]

1.2.3 Phương pháp Co-testing

Phương pháp Co-testing là phương pháp tầm soát ung thư cổ tử cung kết hợp đồng thời xét nghiệm tế bào học cổ tử cung và xét nghiệm HPV Có giá trị cao trong tầm soát do tăng phát hiện các bất thường sớm và được sử dụng tại các cơ sở y tế có đủ điều kiện [3] Xét nghiệm này chỉ lấy duy nhất một mẫu cho cả tế bào cổ tử cung và xét nghiệm HPV DNA trong cùng một lần khám và thu thập trong quá trình khám bằng mỏ vịt Việc tầm soát bằng phương pháp

này làm tăng nhẹ độ nhạy để phát hiện các tổn thương tiền ung thư cổ tử cung cấp độ cao và ung thư cổ tử cung xâm lấn so xét nghiệm riêng lẻ [40]

1.3 Giá trị của các phương pháp xét nghiệm tầm soát ung thư cổ tử cung 1.3.1 Tiêu chuẩn vàng chẩn đoán mô bệnh học cổ tử cung

Mô bệnh học có biểu hiện tiền ung thư là loạn sản hay tân sản nội biểu

mô cổ tử cung (Cervical Intraepithelial Neoplasm – CIN) Là những tổn thương biểu mô gai cổ tử cung với hình ảnh tăng sinh các tế bào biểu mô non không trưởng thành có thể kèm dị dạng nhân, các tế bào mất định hướng và mất sự sắp xếp lớp của chúng Về vi thể, CIN có các đặc điểm: tăng sinh biểu mô với các tế bào non, mất cực tính, các tế bào đáy, cận đáy chiếm đến 1/3 bề dày hoặc gần hết bề dày của biểu mô; nhân bất thường, to nhỏ không đều; tỷ lệ nhân trên bào tương tăng, nhiễm sắc chất tăng đậm, nhiễm sắc chất tăng đậm; nhiều hình ảnh nhân chia Tùy theo chiều cao của các lớp tế bào non chưa trưởng thành sẽ chia làm ba mức độ CIN [23], [30], [50]:

- CIN I: tăng sản tế bào dạng đáy, cận đáy ở các lớp sâu của biểu mô không quá 1/3 bề dày của biểu mô, tương ứng với loạn sản nhẹ

- CIN II: tăng sản tế bào đáy, cận đáy tối đa lên đến 2/3 bề dày biểu mô Tương ứng với loạn sản vừa

- CIN III: các tế bào đáy, cận đáy chiếm gần hết bề dày của biểu mô, trên bề mặt chỉ còn vài lớp tế bào trưởng thành Tổn thương bào hàm cả loạn sản nặng và ung thư biểu mô gai tại chỗ

Ung thư cổ tử cung thường gặp ở độ tuổi từ 40 đến 60 tuổi, biểu hiện lâm sàng không rõ ràng, thường là ra máu âm đạo bất thường hoặc khí hư lẫn máu, lẫn mủ hoặc có mùi hôi Khi đặt mỏ vịt, cổ tử cung có thể thấy dạng sùi, bở, dễ chảy máu tại vùng chuyển tiếp, có 90-95% ung thư biểu mô lát và 5-10% trường hợp ung thư biểu mô tuyến Ung thư cổ tử cung có hai dạng: ung thư tại chỗ và ung thư xâm nhập Ung thư tại chỗ là ung thư có sự hiện diện của tế bào không

biệt hóa, mất sự phân cực và dị dạng ở toàn bộ bề dày của biểu mô nhưng màng

đáy còn nguyên vẹn, tổ chức bên dưới chưa bị phá hủy, nguyên sinh chất kiềm

tính, nhân lớn, nhân quái dị, hạt nhân to Ung thư xâm lấn là ung thư khi có sự

xâm lấn của tế bào ung thư qua lớp màng đáy, tổ chức mô đệm bên dưới đã bị

xâm lấn vào, mất trật tự sắp xếp, đảo lộn hoàn toàn cấu trúc và gây rối loạn sinh

sản [23], [30]

Hình 1.8: CIN I (a) và CIN III (b)

(Nguồn: The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology, 2015 [50])

Ung thư cổ tử cung thường tiến triển từ CIN I qua CIN II rồi CIN III,

ung thư tại chỗ rồi ung thư xâm nhập Thời gian tiến triển của các tổn thương

nội biểu mô đủ dài để có thể áp dụng các biện pháp phòng ngừa, phát hiện sớm

bằng các phương pháp tầm soát ung thư cổ tử cung [30]

Theo y văn, bấm sinh thiết cổ tử cung để làm xét nghiệm giải phẫu bệnh

là tiêu chuẩn vàng để xác định ung thư cổ cung Ngoài ra sinh thiết cổ tử cung

cũng là tiêu chuẩn để xác định giá trị của các xét nghiệm sàng lọc ung thư cổ

tử cung [32]

1.3.2 Khái niệm một số giá trị của xét nghiệm

Độ nhạy (Sensitivity – Se) là tỷ lệ số trường hợp dương tính thật trên số trường hợp thực sự bị bệnh Trong đó, thực sự bị bệnh gồm dương tính thật và

âm tính giả [47], [51]

Độ đặc hiệu (Specificity – Sp) là tỷ lệ số trường hợp âm tính thật trên số trường hợp thực sự không bị bệnh Trong đó, thực sự không bị bệnh gồm âm tính thật và dương tính giả [47], [51]

Giá trị tiên đoán dương tính (Positive Predicted Value – PPV) là khả năng một người dương tính mà có bệnh (tỷ lệ xét nghiệm đúng ở người có kết quả dương) [47], [51]

Giá trị tiên đoán âm tính (Negative Predicted Value – NPV) là khả năng một người âm tính mà không có bệnh (tỷ lệ xét nghiệm đúng ở người có kết quả âm) [47], [51]

1.3.3 Tổng quát về giá trị của các xét nghiệm sàng lọc ung thư cổ tử cung

Xét nghiệm Pap smear là xét nghiệm căn bản và được áp dụng đầu tiên để sàng lọc ung thư cổ tử cung Tuy nhiên độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm còn hạn chế Ngày nay dựa trên xét nghiệm Pap smear cổ điển, người ta đã cải tiến nhiều phương pháp khác nhau, trong đó Cyprep Pap test nổi bật giúp đánh giá tế bào hiệu quả với nhiều ưu thế vượt trội Thao thác ngày càng đơn giản hóa, kỹ thuật hiện đại với chi phí hợp lý sẽ hứa hẹn cung cấp phết tế bào cổ tử cung một lớp với nền rõ ràng và hình thái tế bào tốt hơn so với Pap smear cổ điển [43] Có nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng các giá trị của xét nghiệm

đã được cải thiện đáng kể, tuy nhiên cũng có sự khác biệt giữa các phương pháp này [48]

Sự mất dần vị trí chủ lực trong trong tầm soát ung thư cổ tử cung của các xét nghiệm tế bào học, là sự xuất hiện của xét nghiệm tìm HPV-DNA trong phết tế bào cổ tử cung Hiện nay đã có rất nhiều loại xét nghiệm tầm soát nhiễm

HPV, từ loại chỉ đơn thuần phát hiện có nhiễm HVP đến những loại phát hiện được các týp nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung Độ nhạy của các xét nghiệm tìm DNA HPV lên tới 90-95%, và điểm đáng chú ý là nhờ có thể phát hiện nhiễm HPV trước khi có những biểu hiện bất thường trên tế bào, những đối tượng nhiễm HPV sẽ được theo dõi chặt chẽ nhờ đó sẽ được chẩn đoán và điều trị bệnh sớm hơn Các xét nghiệm phát hiện DNA HPV nguy cơ cao đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trên thế giới, được chứng minh có giá trị trong sàng lọc ung thư cổ tử cung cả với tư cách test đồng sàng lọc và test sàng lọc độc lập [8], [16]

1.4 Tình hình nghiên cứu về tầm soát ung thư cổ tử cung

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong nghiên cứu tại bệnh viện ở Muscat của tác giả Eman Al Sekri ghi nhận tỷ lệ bất thường tế bào học cổ tử cung là 3,7% trong đó ASC-US chiếm 1,8%, còn LSIL là 1,4% Tác giả đánh giá các yếu tố liên quan đến tỷ lệ bất thường tế bào học trong đó chỉ ghi nhận tiền sử nhiễm HPV là có liên quan, còn các yếu tố nhóm tuổi, mang thai sớm, sử dụng biện pháp tránh thai, tiền sử gia đình mắc ung thư cổ tử cung thì không có mối liên quan [36]

Nghiên cứu của tác giả Frhana Rahmat tại Malaysia năm 2021 báo cáo

tỷ lệ nhiễm HPV là 14%, týp HPV nguy cơ cao phổ biến nhất là HPV 52, 66,

33, 39 và 58 [53] Còn tác giả Fabiola Hernández-Rosas đánh giá tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ tại Mexico là 27,2%, với 18,5% là đơn nhiễm và 8,7% là đa nhiễm trong đó phổ biến là HPV 6, 31, 53 Tác giả cũng cho rằng yếu tố liên quan đến nhiễm HPV là tuổi và nghề nghiệp, còn các yếu tố trình độ học vấn

và tình trạng hôn nhân chưa ghi nhận liên quan [44]

Tác giả Philip E Castle có tiến hành nghiên cứu ghi nhận được tỷ lệ dương tính Co-testing là 7,97%, cao hơn so với thử nghiệm đơn lẻ và cho rằng chỉ xét nghiệm HPV genotype realtime PCR đã bỏ sót một số trường hợp CIN3

Do khả năng phát hiện các trường hợp CIN2+ đối với bệnh nhân có kết quả HPV âm tính nên Co-testing vẫn mang lại hiệu quả cao, cũng như sự yên tâm cho bệnh nhân trong sàng lọc bệnh [52] Tác giả Rosa Oncins Torres nghiên cứu ghi nhận được tỷ lệ dương tính của Co-testing là 15,5%, các trường hợp HSIL được phát hiện đã tăng lên đáng kể so với những năm trước đó, cho thấy

sự phù hợp trong các khuyến nghị của nhiều nghiên cứu khác cũng như hiệu quả trong việc chẩn đoán và theo dõi điều trị [54]

Nghiên cứu của tác giả Frhana Rahmat tại Malaysia năm 2021 đánh giá giá trị của xét nghiệm HPV dựa trên tiêu chuẩn tế bào học cổ tử cung thì có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 88,37%, giá trị tiên đoán dương là 18,87% và 100% cho giá trị tiên đoán âm [53] Tương tự trong nghiên cứu của Patti E Gravitt ở Andhra Pradesh, Ấn Độ nhận định rằng xét nghiệm HPV DNA nhạy và đặc hiệu hơn xét nghiệm tế bào học Pap smear trong chiến lược sàng lọc sơ cấp ít xâm lấn và thân thiện với bệnh nhân [42] Tác giả Myunghee Kang nghiên cứu tại một trung tâm y tế tại Hàn Quốc ghi nhận độ nhạy và độ đặc hiệu của việc phát hiện tổn thương đối với xét nghiệm Pap smear cao hơn đối với xét nghiệm HPV (độ nhạy là 97,14%, độ đặc hiệu là 85,58% đối với phết tế bào cổ tử cung,

độ nhạy là 88,32%, độ đặc hiệu là 54,92% đối với các xét nghiệm HPV) Khi đồng xét nghiệm thì có độ nhạy là 98,91% cao hơn nhưng độ đặc hiệu là 44,55% thấp hơn so với xét nghiệm đơn lẻ Điều này có thể dẫn đến tỷ lệ dương tính giả cao trong nhóm nghiên cứu này Nhiễm HPV thoáng qua được coi là một trong những lý do dẫn đến tỷ lệ dương tính giả cao [49] Tác giả Sulaiya Husaiyin nghiên cứu tại bệnh viện Tân Cương, Trung Quốc trên 1622 phụ nữ được thực hiện Thinprep, HPV DNA và sinh thiết giải phẫu bệnh Ghi nhận được độ nhạy của Co-testing đạt cao nhất là 89,8%, còn Thinprep là 79,9%, thấp nhất là HPV DNA là 49,2% Độ đặc hiệu của HPV cao nhất là 64,5%, còn Co-testing là 46,4%, thấp nhất là Thinprep là 40,1% [45] Tương tự Fengxiang

Xie cũng nghiên cứu tại một trung tâm y tế lớn ở Trung Quốc có đánh giá testing có độ nhạy là 87,0% cao hơn đáng kể so với tế bào học đơn thuần là 64,0% và xét nghiệm HPV-DNA đơn thuần là 66,0% [57]

Co-1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 2013, theo nghiên cứu của Nguyễn Vũ Quốc Huy trên 1139 phụ nữ thì xác định tỷ lệ Pap Smear bất thường là 5,44% tại Huế với độ nhạy là 72,7%,

độ đặc hiệu là 71,4%, giá trị tiên đoán dương là 80,0%, giá trị tiên đoán âm 62,5% [10]

Năm 2015, theo nghiên cứu của Lâm Đức Tâm trên 1490 phụ nữ tại Cần Thơ xác định được tỷ lệ Pap smear bất thường là 0,4% với độ nhạy là 33,33%,

độ đặc hiệu là 95,12%, giá trị tiên đoán dương là 33,33%, giá trị tiên đoán âm

là 95,12%; xác định được tỷ lệ dương của HPV realtime PCR là 6,64% với độ nhạy là 20%; độ đặc hiệu là 96,05%, giá trị tiên đoán dương là 76,67%, giá trị tiên đoán âm là 80,49% [24] Cùng năm thì Nguyễn Đức Hinh có nghiên cứu bệnh chứng tại Việt Nam xác định được người có nhiễm HPV nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung cao gấp 495,4 lần người không nhiễm HPV và các týp HPV xuất hiện ở người mắc ung thư cổ tử cung là 6,11,16, 18, 33, 35, 51, 52, 58, 68 [5]

Năm 2016, theo nghiên cứu của Huỳnh Văn Tú khảo sát đối với 1285 phụ nữ đến sàng lọc tại Viện Y tế công cộng tại thành phố Hồ Chí Minh thì xác định được tỷ lệ Pap smear bất thường là 0,93%, tỷ lệ HPV dương tính là 13,4% bao gồm các týp 16, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 68 [25]

Năm 2018, theo nghiên cứu của Đoàn Thị Phương Thảo tại Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh thì xác định được 56 trường hợp có HPV dương tính trong 87 mẫu mô tổn thương tiền ung thư và ung thư cổ tử cung, âm đạo với các týp HPV phát hiện là 16, 18, 52, 58 [28] Nguyễn Ngọc Lâm cũng nghiên cứu tại Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh cơ sở 2 xác định được

tỷ lệ nhiễm HPV chung là 62,3% trên những trường hợp có tế bào học cổ tử cung bất thường với týp HPV phát hiện chiếm tỷ lệ cao là 16, 52, 56, 58 [14]

Năm 2019, theo nghiên cứu Trương Thị Kim Hoàn trên 170 phụ nữ tại Bệnh viện Phụ Sản Nhi Bình Dương thì xác định tỷ lệ kết quả tế bào học bất thường 33,9%, kết quả HPV dương tính là 54,2%, kết quả Co-testing dương tính là 66,4%; xét nghiệm HPV-DNA có độ nhạy, giá trị tiên đoán âm lần lượt

là 88,1%, 90,7% cao hơn so với xét nghiệm Pap smear là 32,6%, 70,5% và gần tương đương với phương pháp Co-testing là 91,4%, 91,7% [6]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm và hồ sơ bệnh án của phụ nữ có tuổi từ 18-65 tuổi khám phụ khoa tại Bệnh viện Quốc tế Phương Châu từ tháng 4/2021 đến 2/2022

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Mục tiêu 1: mẫu bệnh phẩm và hồ sơ bệnh án của phụ nữ có tuổi từ

18-65 tuổi đã quan hệ tình dục đến khám và được chỉ định Cyprep Pap test và HPV genotype realtime PCR

Mục tiêu 2: đối tượng từ mục tiêu 1 có kết quả soi cổ tử cung bất thường

được chỉ định sinh thiết giải phẫu bệnh cổ tử cung

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Phụ nữ đang mang thai, phụ nữ đang được điều trị cắt tử cung, đặt thuốc

âm đạo hoặc thụt rửa âm đạo trong 24 giờ trước đó, mắc bệnh lý tâm thần

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Cỡ mẫu

Cỡ mẫu cho mục tiêu 1: công thức [15]

𝑛 =

Z1−𝛼2

2 𝑝(1 − 𝑝)

𝑑2Trong đó:

- n: là cỡ mẫu nhỏ nhất hợp lý

- Z: là trị số tùy thuộc vào mức tin cậy mong muốn của ước lượng

- p: là tỷ lệ bất thường theo nghiên cứu trước đó

- d: sai số cho phép của nghiên cứu

Theo nghiên cứu của Huỳnh Văn Tú (2016) tại bệnh viện thì có p là tỷ

lệ tế bào học bất thường và nhiễm HPV lần lượt là 0,93% và 13,4% [25]; với

độ tin cậy chọn là 99% và mức sai số chọn là 0,03 Từ công thức trên, thay các giá trị tương ứng chúng tôi có cỡ mẫu tính toán lần lượt là 622 và 856 mẫu Thực tế chúng tôi thu thập được 911 mẫu

Cỡ mẫu cho mục tiêu 2: đối tượng từ mục tiêu 1 chỉ định sinh thiết giải

phẫu bệnh cổ tử cung Thực tế chúng tôi thu thập được 91 mẫu

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu

Chọn mẫu thuận tiện theo thời gian, phù hợp với đối tượng nghiên cứu cho đến khi đủ số lượng bệnh nhân

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

2.2.4.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu

- Tuổi: tính bằng cách lấy năm hiện tại trừ năm sinh và chia thành nhóm

như nhóm tuổi từ 18-29 tuổi, nhóm từ 30 đến 39 tuổi, nhóm tuổi từ 40-49 tuổi, nhóm tuổi từ 50-59 tuổi và nhóm trên 60 tuổi

- Nơi cư trú: chia theo vùng địa lý và chia thành hai nhóm là nông thôn

(sinh sống tại xã, huyện) và thành thị (sinh sống tại thị xã, quận, thành phố)

- Trình độ học vấn: được chia thành các nhóm là đại học, sau đại học;

trung cấp, cao đẳng; trung học phổ thông; dưới trung học phổ thông

- Nghề nghiệp: là công việc đem lại thu nhập chính của đối tượng và

chia thành các nhóm là cán bộ-viên chức, công nhân, nông dân, nội trợ, buôn bán, các nghề khác

- Tuổi lập gia đình: thu thập bằng cách phỏng vấn qua bảng câu hỏi và chia làm các nhóm: < 20 tuổi, từ 20-30 tuổi, từ 30 trở lên

- Tình trạng hôn nhân: chia thành các nhóm là đang sống chung với chồng, đã ly dị hay ly thân, góa chồng hoặc độc thân có quan hệ tình dục

- Số lần mang thai: chia thành các nhóm là chưa từng mang thai, có thai

từ 1-2 lần, có thai từ 3-4 lần, có thai từ 5-6 lần, có thai trên 6 lần

- Tình trạng kinh nguyệt: được chia thành các nhóm là chu kỳ kinh đều,

chu kỳ kinh không đều, hoặc là mãn kinh

- Sử dụng biện pháp tránh thai: được chia thành hai nhóm là có hoặc

* Xét nghiệm Cyprep Pap test: tất cả phụ nữ tham gia nghiên cứu được

lấy mẫu làm xét nghiệm Cyprep Pap test, kết quả được đọc theo hệ thống Bethesda [50] và được chia thành hai nhóm:

- Âm tính (-): bình thường, biến đổi viêm

- Dương tính (+): ASC-US, LSIL, HSIL, carcinôm

* Xét nghiệm HPV genotype realtime PCR: tất cả phụ nữ tham gia

nghiên cứu được lấy mẫu làm xét nghiệm HPV genotype realtime PCR và được chia thành các nhóm:

- Âm tính (-): không phát hiện HPV-DNA

- Dương tính (+) týp nguy cơ cao: phát hiện HPV-DNA với týp 16, 18,

31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68

- Dương tính (+) týp nguy cơ thấp: phát hiện HPV-DNA với týp 6, 11

- Dương tính týp khác: phát hiện HPV-DNA nhưng không thuộc các týp

đã nêu trên

* Xét nghiệm Co-testing: tất cả phụ nữ tham gia nghiên cứu được chỉ

định làm hai xét nghiệm là Cyprep Pap test và HPV genotype realtime PCR và được chia thành hai nhóm:

- Âm tính: Cyprep Pap (-) và HPV-DNA (-)

- Dương tính: Cyprep Pap (+) và HPV-DNA (+); Cyprep Pap (+) và

HPV-DNA (-); Cyprep Pap (-) và HPV-DNA (+)

* Một số yếu tố liên quan của các phương pháp tầm soát UTCTC:

ghi nhận tỷ lệ dương tính của xét nghiệm với tuổi, nơi cư trú, trình độ học vấn, nghề nghiệp, tuổi lập gia đình, tình trạng hôn nhân, số lần mang thai, tình trạng

kinh nguyệt, sử dụng biện pháp tránh thai, viêm cổ tử cung

2.2.4.3 Giá trị độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán

âm của Cyprep Pap test, HPV genotype realtime PCR, Co-testing so với tiêu chuẩn vàng mô bệnh học

* Sinh thiết giải phẫu bệnh cổ tử cung: phụ nữ từ đối tượng mục tiêu

1 có kết quả soi cổ tử cung bất thường được chỉ định sinh thiết cổ tử cung làm giải phẫu bệnh và được chia thành hai nhóm:

- Âm tính (-): bình thường, tổn thương viêm, chuyển sản

- Dương tính (+): CIN I, CIN II, CIN III, carcinôm

* Giá trị của các phương pháp tầm soát:

Bảng 2.1: Tương quan giữa kết quả xét nghiệm và tiêu chuẩn vàng

A + BGiá trị tiên đoán âm: NPV = D

C + D

2.2.5 Phương pháp thu thập và đánh giá số liệu

2.2.5.1 Phỏng vấn và thu thập thông tin đối tượng

* Phỏng vấn: đối tượng tham gia nghiên cứu sẽ được hỏi câu hỏi đóng

và ghi chép vào phiếu thông tin theo mẫu phụ lục 2 về tuổi, nơi cư trú, trình độ học vấn, nghề nghiệp, tuổi lập gia đình, tình trạng hôn nhân, số lần mang thai, tình trạng kinh nguyệt, sử dụng các biện pháp tránh thai

* Thu thập thông tin trong hồ sơ bệnh án: xem trong bệnh án để ghi

chép lại chẩn đoán lâm sàng vào phiếu thông tin theo mẫu phụ lục 2

2.2.5.2 Xét nghiệm Cyprep Pap test

* Thiết bị, hóa chất: của hãng Fjord Diagnostics Snd Bhd-Malaysia đạt

tiêu chuẩn GMP & ISO 13485 gồm,

- Bộ lấy mẫu: lọ CyPrep solution GYN, Cervix-brum® (Que chổi),

spatula & cytobrush (Quệt bẹt và chải tế bào)

- Máy xử lý tiêu bản CY 100 professor

- Lam kính, lá kính mỏng, keo dán lam, bộ thuốc nhuộm Papinicolaou, cồn 960, cồn tuyệt đối, xylen

* Tiến hành lấy mẫu:

- Lấy mẫu thông thường: đặt que chổi vào cổ tử cung, phần trục giữa ở

cổ trong và phần lông ngắn của chổi ở ngoài, xoay mạnh que chổi 5 vòng theo chiều kim đồng hồ Nhúng đầu que chổi vào lọ CyPrep solution GYN Sau đó vặn chặt nắp lọ, ghi đầy đủ thông tin về bệnh nhân trên nhãn lọ, bảo quản ở nhiệt độ phòng (21-250C), cuối ngày vận chuyển mẫu đến Khoa Xét nghiệm

- Lấy mẫu với trường hợp cổ tử cung quá rộng-quá hẹp: lấy cổ ngoài bằng quệt bẹt bằng cách xoay 1 vòng 3600, sau đó khuấy mạnh quệt bẹt trong lọ CyPrep solution GYN khoảng 10 giây giải phóng tế bào hoàn toàn Lấy cổ trong bằng chải tế bào bằng cách xoay ¼ - ½ vòng và cọ sát chải vào thành lọ lên xuống để giải phóng tế bào Sau đó vặn chặt nắp lọ, ghi đầy đủ thông tin về

bệnh nhân trên nhãn lọ, bảo quản ở nhiệt độ phòng (21-250C), cuối ngày vận

chuyển mẫu đến Khoa Xét nghiệm

* Tiến hành làm tiêu bản lam tế bào học

- Vortex mẫu và để yên 15 phút

- Khởi động máy CY 100 professor Nhấn nút “POWER” trên màn hình, khất lam kính sẽ xoay ra ngoài Đặt lam kính vào đúng khất

- Đặt lọc vào đúng vị trị lỗ, xoay nhẹ theo chiều kim đồng hồ Đổ khoảng 2-3 mL mẫu vào

- Nhấn “MODE” để tuỳ chỉnh thông số Nhấn “START” thực hiện mẫu

- Sau khi xử lý xong, máy sẽ đưa lam kính ra Lấy slide và cố định lam kính đã làm bằng cồn tuyệt đối ít nhất 15 phút mới tiến hành nhuộm

- Tháo lọc bằng cách xoay nhẹ ngược chiều kim đồng hồ

- Nhấn “MODE” để trở về màn hình chính Nhấn “POWER” để khất lam kính quay vào trong kết thúc quy trình

* Tiến hành nhuộm tiêu bản lam bằng phương pháp Papinicolaou:

Nước (1-2 phút) →Hematoxylin (4-5 phút) →Nước cất (15-20 giây)

→Rinse 2 phút) →Cồn axít (5 giây) →Nước sạch (15-20 giây) →Bluing

(1-2 phút) →Nước (15-(1-20 giây) →Cồn 960 (1 phút) →Orange G (3-4 phút) →Cồn

960 (1 phút) →EA (4-5 phút) →Cồn 960 (1 phút) →Cồn tuyệt đối (1 phút)

→Xylen I (15-20 giây) →Xylen II (15-20 giây) →Xylen III (15-20 giây)

Sau khi kết thúc quá trình nhuộm tiêu bản lam kính, gắn lá kính mỏng lên lam kính bằng keo để giữ cho các tế bào được cố định không bị thay đổi

hình thái, màu sắc và lưu trữ lâu hơn, có thể di chuyển dễ dàng hơn

* Đọc kết quả:

Kết quả được đọc theo hệ thống Bethesda [50], kết luận gồm: bình thường, biến đổi viêm, ASC-US, LSIL, HSIL, carcinôm

2.2.5.3 Xét nghiệm HPV genotype real-time PCR

* Thiết bị, hóa chất

- Thiết bị: máy ly tâm, máy ủ nhiệt khô, tủ an toàn sinh học, máy vortex,

máy tách chiết tự động Kingfisher Duo 706, máy realtime PCR Rotor Gene

Q-Qiagen, micropipette 1000µL, micropipette 100µL, micropipette 10µL

- Vật tư: đầu típ vô trùng 10-20µL, đầu típ vô trùng 100-200µL, đầu típ

vô trùng 1000µL, eppendoft, ống ly tâm 0,1 mL, ống Falcon

- Hóa chất: bộ sinh phẩm được sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001-2015, ISO 13485, GMP-GLP bởi công ty Nam Khoa Biotek tại Việt Nam, gồm:

+ Bộ xét nghiệm IVD NK PCR-PVI: phát hiện HPV-DNA và xác định nhóm týp nguy cơ cao, nguy cơ thấp, týp 6,11,16,18

+ Bộ xét nghiệm IVD NK PCR-PVII: phát hiện HPV-DNA với týp 6,11,

16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68

+ Bộ IVD NK DNARNAprep-MAGBEAD: ly trích DNA

Bảng 2.2: Bộ xét nghiệm IVD NK PCR-PVI

3 NKHPVDNA-C(+) DNA đích chứa trình tự đặc hiệu HPV

4 Chứng (-) Huyết tương người bình thường

Bảng 2.3: Bộ xét nghiệm IVD NK PCR-PVII

5 NKHBG-TqPCR mix Mồi đặc hiệu và Taqman probe cho gen beta

globulin người (HEX)

6 NKHPVDNA-C(+) DNA đích chứa trình tự đặc hiệu HPV

7 Chứng (-) Huyết tương người bình thường

Bảng 2.4: Bộ IVD NK DNARNAprep-MAGBEAD

1 MAGBEAD Hạt nano từ bọc silica

* Xử lý mẫu: dịch lấy bằng lọ CyPrep solution GYN

- Cho 5mL mẫu vào ống Falcon

- Thực hiện ly tâm 4.000 vòng trong 5 phút

- Lấy 540µL cặn cho vào ống eppendorf và thêm 60µL Proteinase K

- Vortex 15 giây cho thật đều

- Ủ 560C trên máy ủ nhiệt 2 giờ

có 100µL dung dịch Elution buffer

- Đặt Tip-Comb vào plate D

- Đặt các Deep well plate và Elution strip vào máy KingFisher Duo

- Chọn chương trình trình tách chiết DNARNA-bodyfluid_2016

- Máy KingFisher Duo thực hiện ly trích tự động và khi đã kết thúc chương trình ly trích thì lấy Elution strip ra khỏi máy

- Rút dịch ly trích chứa DNA từ Elution strip vào các eppendoft đã đánh

mã tương ứng

* Phân tích mẫu

- Bước 1: xác định mẫu dương tính với HPV

+ Tính toán số phản ứng cần thực hiện để chuẩn bị số lượng master mix cần sử dụng Sử dụng bộ xét nghiệm IVD NK PCR-PVI để phát hiện HPV

Rã đông hoàn toàn các các ống TQPCR master mix Sau khi rã đông hoàn toàn, lắc nhẹ để trộn, không được vortex

+ Sau đó ly tâm nhẹ để lắng Dùng micropipette phân phối mix TQPCR vào các ống PCR với tỷ lệ: 15µL TQPCR mix + 5 µL dịch ly trích chứa DNA của mẫu/DNA chứng (-)/HPVDNA-C (+)

+ Đặt các ống vào máy realtime PCR đã cài đặt chương trình luân nhiệt + Nhập mã các mẫu vào phần mềm đã được thiết lập trên máy tính + Kiểm tra vị trí mẫu và vị trí đặt trên phần mềm phải trùng khớp

+ Chương trình luân nhiệt realtime PCR: chọn kênh 4 kênh màu FAM, HEX, TexasRED, và CY5 cho các giếng NKHPVLo/Hi/16/18TqPCR mix và kênh màu FAM, HEX và CY5 cho các giếng NKHPV6/11/HBGTqPCR mix Chạy chương trình chu kỳ nhiệt như sau: 1 chu kỳ 950C trong 15 phút, sau đó 40 chu

kỳ gồm 2 bước nhiệt độ: 950C trong 15 giây, 600C trong 1 phút với chụp hình realtime ở giai đoạn này

- Bước 2: xác định genotype của các mẫu dương tính HPV

+ Các mẫu HPV dương tính ở bước 1 sẽ tiếp tục chạy realtime PCR với

bộ thuốc thử IVD NK PCR-PVII để xác định genotype của mẫu

+ Rã đông hoàn toàn các các ống TQPCR master mix Sau khi rã đông hoàn toàn, lắc nhẹ để trộn, không được vortex

+ Sau đó ly tâm nhẹ để lắng Dùng micropipette phân phối TQPCR master mix vào các ống PCR với tỉ lệ: 8µL TQPCR master mix + 5µL dịch tách chiết DNA mẫu/DNA chứng (-)/HPVDNA-C (+)

+ Đặt các ống vào máy realtime-PCR đã cài đặt chương trình luân nhiệt + Chương trình luân nhiệt realtime PCR: chọn kênh 4 kênh màu FAM, HEX, TexasRED, CY5 cho các giếng NKHPVMPL1,2,3,4-TqPCR mix và kênh màu HEX cho giếng NKHBG-TqPCR mix Chạy chương trình chu kỳ nhiệt như sau:

1 chu kỳ 950C trong 15 phút, sau đó 40 chu kỳ gồm 2 bước nhiệt độ: 950C trong

15 giây, 600C trong 1 phút với chụp hình real-time ở giai đoạn này

* Đọc và phân tích kết quả

Bảng 2.5: Xác định kết quả của mẫu với master mix tương ứng

STT Tên master mix

Kênh màu FAM HEX Texas

RED CY5

HPV nhóm nguy cơ cao

HPV nhóm nguy cơ thấp

- Bước 1: xác định mẫu dương tính với HPV

+ Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm: chứng (-) không có tín hiệu dương

trên các kênh màu khi phân tích trên giếng NKHPVLo/Hi/16/18TqPCR mix, nhưng chỉ có tín hiệu dương trên kênh màu CY5 trên giếng NKHPV6/11/HBGTqPCR mix

+ Kiểm tra độ nhạy PCR mix: HPVDNA-C(+) sẽ tín hiệu dương trên

tất cả kênh màu khi phân tích trên giếng NKHPVLo/Hi/16/18TqPCR mix, và có tín hiệu dương trên kênh màu FAM và HEX trên giếng NKHPV6/11/HBGTqPCR mix

+ Xác định kết quả mẫu: đọc từng kênh màu tương ứng với các master

mix theo bảng 2.5 Lưu ý: giếng NKHPV6/11/HBGTqPCR mix phải có tín hiệu khuếch đại (+) ở kênh màu CY5 là mẫu có đủ tế bào và không bị ức chế