Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời dư lượng các kháng sinh sulfonamid và trimethoprim thường sử dụng trong thịt gia súc, gia cầm bằng phương pháp lc ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ LÂM ĐẠI DƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG CÁC KHÁNG SINH SULFONAMID VÀ TRIMETHOPRIM THƯỜNG SỬ D

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LÂM ĐẠI DƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG CÁC KHÁNG SINH SULFONAMID VÀ TRIMETHOPRIM THƯỜNG SỬ DỤNG

TRONG THỊT GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Cần Thơ - 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LÂM ĐẠI DƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG CÁC KHÁNG SINH SULFONAMID VÀ TRIMETHOPRIM THƯỜNG SỬ DỤNG

TRONG THỊT GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LÂM ĐẠI DƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG CÁC KHÁNG SINH SULFONAMID VÀ TRIMETHOPRIM THƯỜNG SỬ DỤNG

TRONG THỊT GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LÂM ĐẠI DƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG CÁC KHÁNG SINH SULFONAMID VÀ TRIMETHOPRIM THƯỜNG SỬ DỤNG

TRONG THỊT GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc Chất

MS: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

Cần Thơ – 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này được đảm bảo tính trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nghiên cứu khác

Cần Thơ, ngày 24 tháng 09 năm 2021

Tác giả luận văn

Lâm Đại Dương

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến Thầy PGS

TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, người đã luôn đồng hành, hướng dẫn, động viên,

hỗ trợ, truyền cảm hứng cho tôi trong suốt chặn đường nghiên cứu khoa học đầy khó khăn nhưng cũng không thiếu niềm vui, hạnh phúc Đối với riêng tôi, được làm việc dưới sự hướng dẫn của Thầy là sự may mắn và vinh hạnh vô cùng to lớn khi điều tôi nhận được không chỉ là kết quả cuối cùng mà còn là tinh thần làm việc, tư duy nghiên cứu và tình Thầy trò không gì so sánh được Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy!

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các Thầy, Cô tại Liên bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất đã hết lòng tạo mọi điều kiện, chia sẻ kinh nghiệm, luôn lắng nghe, ủng hộ tinh thần trong quá trình tôi thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các Anh, Chị học viên lớp sau đại học Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất khóa 2019-2021 đã hỗ trợ, hợp tác, động viên nhau trong những lúc khó khăn suốt hai năm học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình mình Cảm ơn mọi người đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, giúp đỡ, ủng hộ để tôi có được ngày hôm nay!

Cần Thơ, ngày 24 tháng 09 năm 2021

Tác giả luận văn

Lâm Đại Dương

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về kháng sinh và thực trạng sử dụng kháng sinh hiện nay 3

1.2 Kháng sinh nhóm sulfonamid và kháng sinh trimethoprim 7

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu hiện nay 12

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép đầu dò khối phổ ba tứ cực 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim bằng phương pháp LC-MS/MS có trong mẫu thịt gia súc (heo, bò), gia cầm (gà) 37

3.2 Thẩm định quy trình định lượng và ứng dụng quy trình đã thẩm định phân tích đánh giá dư lượng kháng sinh sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim có trong mẫu thịt gia súc (heo, bò), gia cầm (gà) thu thập tại Kiên Giang 48

Chương 4 BÀN LUẬN 63

4.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim bằng phương pháp LC-MS/MS có trong mẫu thịt gia súc (heo, bò), gia cầm (gà) 63 4.2 Thẩm định quy trình định lượng và ứng dụng quy trình đã thẩm định phân tích đánh giá dư lượng kháng sinh sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim có trong mẫu thịt gia súc (heo, bò), gia cầm (gà) thu thập tại Kiên Giang 76

KẾT LUẬN 80 KIẾN NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ tắt,

AOAC Association of official

ANSORP Asian Network for Surveillance

of Resistant Pathogens

Mạng lưới giám sát của châu

Á về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp

BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn

HPLC High Performance Liquid

KONSAR Korean Nationwide Surveillance

of Antimicrobial Resistance

Mạng lưới giám sát quốc gia

về kháng thuốc của Hàn Quốc

MeOH Methanol

MIC Minimal Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MRM Multiple Reaction Monitoring Chế độ chọn lọc nhiều lần

QuEChERS Quick, easy, cheap, effective,

rugged, safe

UHPLC Ultra High Performance Liquid

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc chung của kháng sinh nhóm sulfonamid 7

Hình 1.2 Cấu trúc của kháng sinh sulfaquinoxalin 10

Hình 1.3 Cấu trúc của kháng sinh sulfathiazol 10

Hình 1.4 Cấu trúc của kháng sinh sulfamethoxazol 11

Hình 1.5 Cấu trúc của kháng sinh trimethoprim 12

Hình 1.6 Sơ đồ khối của ba tứ cực nối tiếp 21

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu khảo sát……….……….30

Hình 3.1 Kết quả auto-tune của SMX (a) và SQX (b) trong hỗn hợp chuẩn…38 Hình 3.2 Kết quả manual-tune ion phân tử ban đầu của TMP (a) và SQX (b).39 Hình 3.3 Sắc ký đồ phân tích đồng thời 4 kháng sinh STZ, SMX, SQX, TMP ở điều kiện khối phổ và sắc ký phù hợp……… 41

Hình 3.4 Quy trình xử lý mẫu thực tế……….……… 49

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu dung môi (a), trắng (b), chuẩn trong dung môi (c), trắng thêm chuẩn (d) và trắng thêm chuẩn lần 2 (e) của STZ………51

Hình 3.6 Phổ đồ MS1 scan của mẫu trắng thịt gà thêm chuẩn……….52

Hình 3.7 Phổ đồ MS2 scan của TMP (a) và STZ (b) trong mẫu trắng thịt gà 52

Hình 3.8 Phương trình hồi quy tuyến tính của kháng sinh SMX (a), SQX (b), STZ (c), TMP (d) trên nền mẫu thịt gà truy xuất từ phần mềm Masslynx 4.1……… 54

Hình 3.9 LOD (a) và LOQ (b) của STZ trên nền mẫu thịt gà……… 56

Hình 3.10 Sắc ký đồ phân tích TMP và SMX trong mẫu thịt heo TH3………61

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Kết quả khảo sát điều kiện MS trong nghiên cứu [16] 14

Bảng 1.2 Tổng hợp một số công trình nghiên cứu trên thế giới 15

Bảng 2.1 Chuẩn bị dãy dung dịch xây dựng đường chuẩn 27

Bảng 2.2 Quy định mức độ sai lệch cho phép của tỷ lệ ion trên mẫu chuẩn và mẫu thử 33

Bảng 2.3 Độ thu hồi cho phép đối với các khoảng nồng độ khác nhau 35

Bảng 3.1 Thông số khối phổ tối ưu hóa phân tích các kháng sinh………….40

Bảng 3.2 Chương trình gradient rửa giải đồng thời 4 kháng sinh………… 41

Bảng 3.3 Thông tin quy trình chiết và các yếu tố được khảo sát………… 42

Bảng 3.4 Kết quả độ thu hồi của các quy trình chiết khảo sát……… 43

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá quy trình xử lý mẫu tối ưu trên từng nền mẫu…44 Bảng 3.6 Hệ số gốc các đường chuẩn và giá trị tính toán ME……… 45

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ ổn định trong dung môi……… 46

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ ổn định trong nền mẫu gia cầm……… 47

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ ổn định trong nền mẫu gia súc……… 47

Bảng 3.10 Dung dịch X để hòa tan cắn……… 48

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống trên mẫu trắng thêm chuẩn (n = 6)……… 50

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu trên các yếu tố thời gian lưu, số điểm IP và tỷ lệ ion sai lệch của các chất phân tích……….53

Bảng 3.13 Phương trình hồi quy, hệ số tương quan, khoảng tuyến tính các kháng sinh trên nền mẫu thịt heo – thịt bò và thịt gà………55

Bảng 3.14 Kết quả xác định LOD, LOQ của các kháng sinh trên nền mẫu… 56

Bảng 3.15 Kết quả xác định LOD, LOQ của các kháng sinh trên nền mẫu thịt heo – thịt bò………56

Bảng 3.16 Độ lặp lại và độ tái lặp của các kháng sinh trên mẫu thịt gà………57 Bảng 3.17 Độ lặp lại và độ tái lặp của các kháng sinh trên mẫu thịt heo – bò 58 Bảng 3.18 Độ đúng của các kháng sinh trên mẫu thịt heo – bò và thịt gà…….58 Bảng 3.19 Kết quả đánh giá độ không đảm bảo đo……… 59 Bảng 3.20 Kết quả tổng hợp của các thông số thẩm định quy trình phân tích 60 Bảng 3.21 Kết quả phân tích bốn kháng sinh trên mẫu thịt heo thực tế………62

MỞ ĐẦU

Bất chấp việc luôn là công cụ hiệu quả trong công tác điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi sinh vật cho con người, kháng sinh vẫn được ví như là con dao hai lưỡi, khi việc sử dụng không đúng cách hay lạm dụng kháng sinh sẽ dẫn đến hiện tượng đề kháng thuốc hết sức nguy hiểm [7]

Bên cạnh đó, kháng sinh còn được sử dụng trong chăn nuôi với nhiều mục đích khác nhau như phòng bệnh, trị bệnh hoặc tăng trưởng cho vật nuôi Một nghiên cứu về thức ăn trong chăn nuôi tại Việt Nam cho thấy, tỷ lệ kháng sinh trên mỗi kilogam thức ăn cho gà và heo lần lượt là 25,7 mg và 62,3 mg [56] Kết quả khảo sát 208 trang trại chăn nuôi tại một tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long ghi nhận lượng kháng sinh sử dụng tính trên đầu gia cầm cao gấp 6 lần một số nước Châu Âu Đặc biệt, sulfonamid-trimethoprim là một trong những kháng sinh được sử dụng nhiều nhất (2,78 mg/tuần/con) [42] Điều

này đã dẫn đến tỷ lệ đề kháng trên 202 chủng Campylobacter phân lập từ 343

trang trại chăn nuôi lợn và gia cầm ở Đồng bằng sông Cửu Long đối với kháng sinh sulfamethoxazol-trimethoprim lên đến 99 % [38]

Trước thực tiễn này, Tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc (FAO), Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã hợp tác thông qua một thỏa thuận giữa ba bên, xác định mức độ kháng kháng sinh là một trong

ba chủ đề hành động phối hợp ưu tiên và xây dựng một kế hoạch hành động

toàn cầu về phòng chống kháng kháng sinh (FAO /OIE /WHO, 2011) Việt

Nam đã hưởng ứng tích cực bằng việc ban hành Quyết định số

2625/QĐ-BNN-TY về “Kế hoạch hành động quốc gia về quản lý sử dụng kháng sinh và phòng

chống kháng kháng sinh trong sản xuất chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản giai đoạn 2017-2020” [5] nhằm đẩy mạnh các hoạt động quản lý sử dụng kháng

sinh trong chăn nuôi, góp phần phòng chống kháng kháng sinh, nâng cao hiệu quả của công tác phòng, khám chữa bệnh, đảm bảo sức khỏe nhân dân

Để thực hiện kế hoạch trên, cấp thiết phải xây dựng được quy trình định lượng các kháng sinh có trong các nền mẫu khác nhau Một số kỹ thuật đã được ứng dụng để phân tích các kháng sinh như phổ hồng ngoại gần và trung bình [10] có nhược điểm về quy trình chuẩn bị phức tạp và độ nhạy thấp chưa đáp ứng yêu cầu tính ứng dụng khả thi, phù hợp về mặt kinh tế, xã hội Bên cạnh

đó, kỹ thuật sắc ký lỏng ghép một số đầu dò như dãy diod quang [18] hoặc huỳnh quang [33] cũng được áp dụng, tuy nhiên độ nhạy còn chưa cao, dẫn đến hạn chế về khả năng phân tích Đặc biệt, kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) với ưu điểm về độ nhạy, tính chính xác và tin cậy cao đang được

sử dụng rộng rãi để phát triển phương pháp phân tích các kháng sinh trên nền mẫu thực phẩm [4], [12], [47] Tuy nhiên việc phát triển quy trình định lượng đồng thời dư lượng bốn kháng sinh trimethoprim, sulfathiazol, sulfaquinoxalin, sulfamethoxazol có trong mẫu thịt heo, bò, gà vẫn còn rất ít nghiên cứu

Vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời dư lượng các kháng sinh Sulfonamid và Trimethoprim thường sử dụng trong thịt gia súc, gia cầm bằng phương pháp LC-MS/MS” được thực

hiện, với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời sulfaquinoxalin, sulfamethoxazol, sulfathiazol, trimethoprim có trong mẫu thịt heo, bò, gà bằng phương pháp LC-MS/MS

2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời sulfaquinoxalin, sulfamethoxazol, sulfathiazol, trimethoprim có trong mẫu thịt heo, bò, gà theo hướng dẫn của EC-657/2002, AOAC 2002 và ứng dụng quy trình đã thẩm định phân tích đánh giá dư lượng các kháng sinh này trong mẫu thịt heo, bò, gà thu thập tại tỉnh Kiên Giang

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về kháng sinh và thực trạng sử dụng kháng sinh hiện nay

1.1.1 Tổng quan về kháng sinh

Theo Bộ Y Tế Việt Nam, “kháng sinh (antibiotics) là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, actinomycetes), có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác” Sau thời gian dài phát triển, khái niệm kháng sinh được mở rộng để gọi những chất tổng hợp hay bán tổng hợp có khả năng kháng khuẩn Dựa vào cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân chia thành các nhóm:

- Beta-lactam: các penicillin, các cephalosporin, các beta-lactam khác, các chất ức chế beta-lactamase

sự sinh trưởng và phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn Trong một số trường hợp thực tế như để tăng khả năng diệt khuẩn, điều trị nhiễm khuẩn do nhiều loại vi khuẩn gây ra hay giảm khả năng xuất hiện chủng đề kháng mới, chúng ta phải

tiến hành phối hợp kháng sinh Tuy nhiên, bất lợi đi kèm trong việc sử dụng kháng sinh phối hợp là giá thành cao, gia tăng nguy cơ gây tác dụng phụ và khó thể hiện sự đồng vận ở người

Như đã đề cập ở trên, kháng sinh luôn được đánh giá là con dao hai lưỡi

mà việc sử dụng luôn phải được thực hiện với tất cả sự hiểu biết và thận trọng, đặc biệt trong bối cảnh tình trạng kháng thuốc ngày càng trở nên nghiêm trọng

do tình trạng sử dụng tràn lan, sai mục đích và phác đồ như hiện nay [7]

1.1.2 Thực trạng sử dụng kháng sinh hiện nay

1.1.2.1 Thực trạng sử dụng kháng sinh trên thế giới

Để ngăn chặn sự đề kháng kháng sinh trên toàn cầu, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã giới thiệu công cụ phân loại kháng sinh AWaRE (Access – nhóm Tiếp cận, Watch – nhóm Theo dõi; và Reserve – nhóm Dự trữ) và kêu gọi tăng tỷ lệ sử dụng kháng sinh toàn cầu trong nhóm Tiếp cận lên ít nhất 60

% đến năm 2023 cũng như giảm sử dụng các kháng sinh có nguy cơ độc tính

và kháng thuốc cao từ nhóm Theo dõi và Dự trữ Tuy nhiên, kết quả đánh giá tại 76 quốc gia trên toàn cầu trong giai đoạn từ 2000 – 2015 cho thấy, tỷ lệ tiêu thụ kháng sinh nhóm Theo dõi trên bình quân đầu người đã tăng 90,9 % so với mức tăng 26,2 % của nhóm Tiếp cận Sự gia tăng tiêu thụ kháng sinh thuộc nhóm Theo dõi ở các quốc gia thu nhập thấp và vừa (165,0 %) là lớn hơn rõ rệt

so với các quốc gia thu nhập cao (27,9 %) Ngoài ra, tỷ lệ các quốc gia đạt được chỉ tiêu sử dụng kháng sinh thuộc nhóm Tiếp cận chiếm ít nhất 60 % tổng lượng kháng sinh tiêu thụ của họ đã giảm từ 50 (chiếm 76 %) trong 66 quốc gia vào năm 2000 xuống còn 42 (chiếm 55 %) trong 76 quốc gia vào năm 2015 [26] Điều này không chỉ cho thấy những thách thức trong việc đạt được mục tiêu sử dụng kháng sinh toàn cầu (60 % thuộc nhóm Tiếp cận) của WHO mà còn là một trong những lý do của vấn nạn kháng thuốc (AMR) hiện nay

Thực tế cho thấy hiện nay trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển, vấn đề kháng thuốc đã trở nên báo động Gánh nặng về chi phí điều trị do các bệnh nhiễm khuẩn gây ra khá lớn do việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền Năm 2011, tình hình lao kháng thuốc đang xảy ra

ở hầu hết các quốc gia Toàn cầu có khoảng 640.000 trường hợp lao đa kháng thuốc, trong số đó khoảng 9 % là siêu kháng thuốc Việc tiếp cận toàn cầu đối với các thuốc kháng vi rút để điều trị người bệnh HIV làm tăng nguy cơ kháng thuốc Sự kháng của vi rút đối với các thuốc này đang là mối đe dọa đối với loài người Khoảng 15 % người bệnh được điều trị đã phải dùng đến các thuốc phác đồ bậc hai và bậc ba, vốn tốn kém gấp 100 lần so với các thuốc phác đồ bậc một [6]

Số liệu nghiên cứu giám sát ANSORP từ tháng 1/2000 đến tháng 6/2001 của 14 trung tâm từ 11 nước Đông Nam Á cho thấy tỷ lệ kháng cao của vi khuẩn

S pneumoniae Trong số 685 chủng vi khuẩn S pneumoniae phân lập được từ

người bệnh, có 483 (52,4 %) chủng không còn nhạy cảm với penicillin, 23 %

ở mức trung gian và 29,4 % đã kháng với penicillin (MIC ≥ 2mg/l) Kết quả phân lập vi khuẩn cho thấy tỷ lệ kháng penicillin ở Việt Nam cao nhất (71,4 %) tiếp theo là Hàn Quốc (54,8 %), Hồng Kông (43,2 %) và Đài Loan (38,6 %)

Tỷ lệ kháng erythromycin cũng rất cao, ở Việt Nam là 92,1 %, Đài Loan là 86

%, Hàn Quốc là 80,6 %, Hồng Kông là 76,8 % và Trung Quốc là 73,9 % [37]

Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005-2007 ở các bệnh viện Hàn

Quốc cho thấy S aureus kháng Methicillin 64 %; K pneumoniae kháng cephalosporin thế hệ 3 là 29 %; E coli kháng fluoroquinolone 27 %, P

aeruginosa kháng 33 %, Acinetobacter spp kháng 48 %; P aeruginosa kháng

amikacin 19 %, Acinetobacter spp kháng 37 % E faecium kháng vancomycin

và Acinetobacter spp kháng imipenem tăng lên dần Tỷ lệ kháng phát hiện tại

các phòng xét nghiệm của E coli và K pneumoniae đối với cephalosporin thế

hệ 3 và P aeruginosa đối với imipenem cao hơn trong bệnh viện [44]

1.1.2.2 Thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam

Theo kết quả khảo sát về việc bán thuốc kháng sinh ở các hiệu thuốc cho thấy, trong tổng số 2953 nhà thuốc được điều tra có 499/2083 hiệu thuốc ở thành thị (chiếm tỷ lệ 24 %) và 257/870 hiệu thuốc ở nông thôn (chiếm tỷ lệ 29,5 %) có bán đơn thuốc kê kháng sinh Phần lớn kháng sinh được bán mà không có đơn với tỷ lệ 88 % ở thành thị và 91 % ở nông thôn Ba loại kháng sinh được bán nhiều nhất là ampicillin/amoxicillin (29,1 %), cephalexin (12,2

%) và azithromycin (7,3 %) Ngoài ra, theo kết quả “Tìm hiểu thực trạng sử dụng kháng sinh trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại các đơn vị điều trị tích cực ở một số cơ sở khám, chữa bệnh” cho thấy 4 chủng vi khuẩn phân lập được nhiều

nhất là Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, E.coli, Klebsiella spp Tần suất nhiễm Acinetobacter spp hay Pseudomonas spp chiếm tỷ lệ ưu thế (>50 %)

trong viêm phổi bệnh viện (thở máy hay không thở máy) Bốn chủng này đều

là vi khuẩn đa kháng kháng sinh Sự kháng thuốc cao đặc biệt ở nhóm cephalosporin thế hệ 3, 4 (khoảng từ 66-83 %), tiếp theo là nhóm aminosid và fluoroquinolon với tỷ lệ kháng xấp xỉ trên 60 % Sự kháng thuốc cao còn được phản ánh qua việc sử dụng kháng sinh theo kinh nghiệm ban đầu không phù hợp với kết quả kháng sinh đồ là 74 % [6]

Kháng sinh không chỉ được sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn cho con người mà còn được sử dụng trong chăn nuôi để nhằm kích thích tăng trưởng hoặc phòng và điều trị cho vật nuôi Một nghiên cứu về thức ăn trong chăn nuôi tại Việt Nam cho thấy, tỷ lệ kháng sinh trên mỗi kg thức ăn cho gà và heo lần lượt là 25,7 mg và 62,3 mg [56] Kết quả khảo sát 208 trang trại chăn nuôi tại một tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long ghi nhận lượng kháng sinh sử dụng tính trên đầu gia cầm cao gấp 6 lần một số nước Châu Âu Đặc biệt, sulfonamid

- trimethoprim là một trong những kháng sinh được sử dụng nhiều nhất (2,78 mg/tuần/con) [42] Điều này đã dẫn đến tỷ lệ đề kháng trên 202 chủng

Campylobacter phân lập từ 343 trang trại chăn nuôi lợn và gia cầm ở Đồng bằng sông Cửu Long đối với kháng sinh sulfamethoxazol-trimethoprim lên đến

99 % [38] Đây là vấn nạn cần được lưu ý khi chăn nuôi gia súc gia cầm có vai trò vô cùng quan trọng đối với Đồng bằng sông Cửu Long nói chung và tỉnh Kiên Giang nói riêng, với quy mô đàn gia cầm hơn 5 triệu con và gia súc gần 200.000 con [17]

1.2 Kháng sinh nhóm sulfonamid và kháng sinh trimethoprim

1.2.1 Giới thiệu về nhóm kháng sinh sulfonamid

Năm 1913, người ta đã tìm thấy thuốc phẩm nhuộm azoic cryzoidin có tác dụng diệt khuẩn và tương đối ít độc Sau đó, người ta gắn thêm vào phân tử cryzoidin nhóm sulfamid giúp phẩm nhuộm bền hơn, cho ra đời một chất có tác dụng chống tụ cầu và liên cầu đó là prontosil, cũng là chất kháng khuẩn đầu tiên thu được bằng phương pháp tổng hợp toàn phần Khi phân tích công thức,

ta thấy prontosil được điều chế bằng cách diazo hóa p-aminobenzen sulfonamid (sulfanilamid) ngưng tụ với m-phenylendiamin Qua nhiều thử nghiệm, người

ta nhận thấy sulfanilamid là thành phần có tác dụng kháng khuẩn Sulfanilamid

đã trở thành sulfonamid đầu tiên trong lịch sử Việc phát hiện ra prontosil và sulfanilamid đã mở ra một kỷ nguyên mới cho việc hóa trị liệu các bệnh nhiễm khuẩn Dựa trên cấu trúc của sulfanilamid người ta đã tổng hợp rất nhiều sulfonamid, trong đó có khoảng 40 loại được sử dụng làm thuốc [14]

Các sulfonamid có cấc trúc chung:

Hình 1.1 Cấu trúc chung của kháng sinh nhóm sulfonamid

Khi R2 là H thì sulfonamid mới có tính kháng khuẩn, khi R2 khác H thì hoạt chất là tiền thuốc R1 có thể là mạch thẳng hay dị vòng, nếu là dị vòng thì hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn Khi R1 và R2 đều là H thì ta thu được sulfonamid đơn giản nhất – sulfanilamid

Các sulfonamid thường ở dạng tinh thể trắng hoặc hơi vàng nhạt trừ prontosil, không mùi, vị đắng, ít tan trong nước, benzen, chloroform, tan trong alcol, glycerin, aceton

Trừ một số sulfonamid không hấp thu qua đường tiêu hóa và được sử dụng trị nhiễm khuẩn đường ruột như ftalazol, sulfaguanidin,… còn đa số các sulfonamid hấp thu qua đường ruột Khoảng 70 % sulfonamid được hấp thu và tìm thấy trong nước tiểu sau 30 phút Ngoài ruột, sulfonamid có thể hấp thu qua

dạ dày, da, hô hấp,… nhưng hấp thu qua đường ruột là ít tác dụng phụ nhất Sulfonamid được phân phối khắp các tế bào cơ thể Sulfonamid có thể nhanh chóng đi vào màng phổi, hoạt dịch mắt và các dịch tương tự Trong cơ thể, sulfonamid có thể tham gia một số chuyển hóa như gắn protein, acetyl hóa hay liên hợp glucuronic Sulfonamid thải trừ chủ yếu qua đường tiết niệu dưới dạng

tự do, acetyl hóa hay liên hợp glucuronic

Sulfonamid có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng trên cả vi khuẩn Gram

(+) và Gram (-) như tụ cầu Sstaphylococcus), liên cầu (Streptococcus), phế cầu (Pneumococcus), màng não cầu (Menigococcus), lậu cầu (Gonococcus), trực khuẩn lỵ (Shigella), thương hàn (Samonella), E colli, … Sulfonamid không có tác dụng trên M.tubeculosis, M leprea, Ricketsia, Plasmodium, nấm,…

Tác dụng phụ khi sử dụng sulfonamid là khoảng 5 % khác nhau đối với mỗi cá thể và mỗi loại sulfonamid như rối loạn hệ thống tạo máu, độc tính trên thận hay phản ứng tăng nhạy cảm

Một số sulfonamid kháng khuẩn chính bao gồm [14]:

- Sulfonamid tác dụng nhanh: sulfanilamid, sulfasalazin, sulfathiazol

- Sulfonamid tác dụng chậm: sulfadimethoxin, sulfamethoxypyridazin, sulfadoxin

- Sulfonamid tác dụng trung gian: sulfamethoxazol (kết hợp với trimethoprim), sulfacetamid, sulfamethizol, sulfaguanidin, ftalylsulfathiazol

1.2.2 Giới thiệu về kháng sinh sulfaquinoxalin, sulfamethoxazol, sulfathiaol và trimethoprim

Kháng sinh nhóm sulfonamid là một trong những nhóm kháng sinh được

sử dụng phổ biến nhất hiện nay Tuy nhiên, do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn ngày một gia tăng nên người ta thường sử dụng dạng phối hợp giữa sulfonamid với trimethoprim, đặc biệt là sulfamethoxazol với tỷ lệ 1 trimethorpim 5 sulfamethoxazol với tác dụng kháng khuẩn, tăng hiệu quả điều trị và giảm tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn Ngoài ra, một số sulfonamid cũng được sử dụng phổ biến trong thú y như sulfaquinoxalin, sulfathiazol [14]

1.2.2.1 Sulfaquinoxalin

- Công thức: C14H12N4O2S

- Khối lượng phân tử: 300,3

- Sulfaquinoxalin là 4-amino-N-quinoxalin-2-ylbenzen sulfonamid, tồn tại ở dạng bột màu vàng

- Thực tế không tan trong nước và trong ether; rất ít tan trong alcohol, hòa tan trong dung dịch nước kiềm

- Cần bảo quản tránh ánh sáng [7], [9], [31]

- Giá trị pKa: 5,9 [64]

- Giới hạn dư lượng tối đa cho phép (MRL): 100 ppb (µg/kg) [32]

Hình 1.2 Cấu trúc của kháng sinh sulfaquinoxalin

1.2.2.2 Sulfathiazol

- Công thức phân tử: C9H9N3O2S2

- Khối lượng phân tử: 255,3

- Sulfathiazol là 4-amino-N-2thiazolybenzene sulfonamid, tồn tại ở dạng bột kết tinh trắng hay hơi vàng nhạt, không mùi, vị đắng

- Nhiệt độ nóng chảy: 202-202,5 °C Độ tan ở 26 °C (mg/100 mL): nước

60 (pH 6,03), alcol 525

- Tan trong aceton, axit vô cơ loãng, dung dịch KOH và NaOH, nước ammoniac và carbonat kiềm Rất ít tan trong nước, thực tế không tan trong cloroform, ether

- Cần bảo quản tránh ánh sáng [8], [21], [31]

- Giá trị pKa: 7,2 [64]

- Giới hạn dư lượng tối đa cho phép (MRL): 100 ppb (µg/kg) [32]

Hình 1.3 Cấu trúc của kháng sinh sulfathiazol 1.2.2.3 Sulfamethoxazol

- Công thức phân tử: C10H11N3O3S

- Khối lượng phân tử: 253,3

- Sulfamethoxazol là 4-amino-N-(5-methylisoxazol-3-yl)benzen

sulfonamid, tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng

- Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, tan trong dung dịch natri hydroxyd loãng và dung dịch axit loãng

- Cần bảo quản tránh ánh sáng

- Sulfamethoxazol là sulfamid có tác động trung gian dùng trị nhiễm trùng đường tiểu, sinh dục, nhiễm trùng da [59], [62]

- Giá trị pKa: 5,8 [23]

- Giới hạn dư lượng tối đa cho phép (MRL): 100 ppb (µg/kg) [32]

Hình 1.4 Cấu trúc của kháng sinh sulfamethoxazol

1.2.2.4 Trimethoprim

- Công thức phân tử: C14H18N4O3

- Khối lượng phân tử: 290,3

- Trimethoprim là 2,4 diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidin, tồn tại ở dạng bột trắng hoặc trắng hơi vàng

- Rất khó tan trong nước (0,4 mg/L) và ether (0,3 mg/mL), khó tan trong ethanol 96 %, tan trong cloroform (18,2 mg/mL) và methanol (12,1 mg/mL)

- Cần bảo quản tránh ánh sáng

- Trimethoprim được sử dụng trong các trường hợp điều trị đợt cấp của viêm phế quản mạn, dự phòng lâu dài nhiễm khuẩn tiết niệu tái phát, nhiễm

khuẩn tiết niệu dưới cấp tính nhạy cảm với trimethoprim, viêm phổi do

pneumocystis carinii [59], [60]

- Giá trị pKa: 7,4 [34]

- Giới hạn dư lượng tối đa cho phép (MRL): 50 ppb (µg/kg) [32]

Hình 1.5 Cấu trúc của kháng sinh trimethoprim

1.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu hiện nay

1.3.1 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tác giả Vũ Thị Huệ (2015) đã tiến hành xây dựng quy trình phân tích định lượng nhanh đồng thời ba hoạt chất kháng sinh sulfaguanidin, sulfamethoxazol, trimethoprim bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với phương pháp hồi quy đa biến trên nền mẫu thuốc tân dược, cho kết quả giới hạn phát hiện LOD lần lượt là 5,9 µg/viên nén, 10,4 µg/viên nén, 14,2 µg/viên nén; giới hạn định lượng LOQ lần lượt là 19,7 µg/viên nén, 34,5 µg/viên nén, 47,5 µg/viên nén [10]

Tác giả Bùi Minh Thái (2011) sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò UV-Vis phân tích định lượng đồng thời kháng sinh metronidazol và bốn kháng sinh nhóm sulfonamid bao gồm sulfaguanidin, sulfamethoxazol, sulfamethoxypiridazin, sulfadoxin, ứng dụng phân tích thực tế trên mẫu tôm Một số thông tin về quy trình phân tích bao gồm:

- Pha tĩnh: RP – C18 (25 cm x 4,6 cm; 5 µm)

- Pha động: 20 % ACN – 80 % đệm acetat 10 mM (pH = 4,5)

- Giới hạn định lượng LOQ là 0,083 ppm, 0,066 ppm, 0,04 ppm, 0,079 ppm, 0,096 ppm lần lượt tương ứng với metronidazol, sulfaguanidin, sulfamethoxazol, sulfamethoxypiridazin, sulfadoxin [15]

Nhóm tác giả Phạm Thị Thanh Yên, Nguyễn Quang Trung, Huỳnh Trung Hải (2014) xây dựng quy trình định lượng đồng thời bốn kháng sinh sulfathiazol, sulfamethazin, sulfamethoxazol, sulfamerazin trong nước mặt bằng sắc ký lỏng hai lần khối phổ, ứng dụng phân tích mẫu nước sông, hồ tại

Hà Nội Kết quả quy trình phân tích:

- Kết quả khảo sát ion phân tử ban đầu kiểu ion hóa dương (ES+) và ion phân mảnh cho định lượng và định tính được trình bày trong Bảng 1.1:

Bảng 1.1 Kết quả khảo sát điều kiện MS trong nghiên cứu [16]

Hoạt chất

Ion phân tử ban đầu (m/z)

Phân mảnh định lượng (m/z) / Năng lượng (V)

Phân mảnh định tính (m/z) / Năng lượng (V)

Nhận xét: các nghiên cứu ở trên sử dụng các phương pháp phân tích hiện

đại như phổ hồng ngoại gần và trung bình, sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu

dò UV-Vis hoặc hai lần khối phổ, tuy nhiên vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như độ nhạy kém dẫn đến giới hạn phát hiện LOD và giới hạn đinh lượng LOQ còn thấp [10], [15] hoặc không thẩm định đầy đủ phương pháp phân tích theo các tiêu chí của hướng dẫn thường quy [16] Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào được thực hiện định lượng đồng thời bốn hoạt chất sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim trên nền mẫu gia súc, gia cầm tại Việt Nam

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bảng 1.2 Tổng hợp một số công trình nghiên cứu trên thế giới

Dung môi B: nước:ACN:acid formic 5:95:0,1 %

LC Thận heo và gia cầm

- Xử lý mẫu: QuEChERS

- Điều kiện sắc ký: cột Eclipse C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) Dung môi A:

XDB-nước acid formic 0,1 % Dung môi B:

ACN với acid formic 0,1 %

[58]

ID Sữa

- Xử lý mẫu: LLE

- Điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Synergi 4u Max RP 80A (250 x 3 mm, 4 µm) Dung môi A: nước acid formic 0,1

% : ACN 95:5 tt/tt Dung môi B: nước acid formic 0,1 % : ACN 5:95 tt/tt

LC Gan bò, ngựa, lợn và gia cầm

- Xử lý mẫu: acetonitril và natri sulfat khan

- Điều kiện sắc ký: cột Luna C18 (150 x 2,1 mm) Dung môi A: amonium acetat

10 mM với axit acetic 0,1 % Dung môi B: methanol

HPLC Thức ăn chăn nuôi

- Xử lý mẫu: hỗn hợp acetate/ methanol/

acetonitril (50:25:25, tt/tt/tt)

- Điều kiện sắc ký: cột Zorbax Eclipse XDB (150 x 4,6 mm, 5 µm) Dung môi A: nước axit acetic 0,08 % Dung môi B:

acetonitril Dung môi C: methanol

LC Thịt cá, lợn và gia cầm

- Xử lý mẫu: LLE với hệ dung môi methanol – acetonitril axit hóa bằng acid formic 0,05 %

[51]

UHPLC-MS

- Sữa, cá

- Xử lý mẫu: phương pháp 1: acid formic 0,1 % trong dung dịch EDTA 0,1 % : ACN : MeOH (1:1:1 tt/tt/tt) Phương pháp 2: ACN : dung dịch TCA 5 % (1:3 tt/tt), làm sạch bằng SPE

- Điều kiện sắc ký: cột ACQUITY UPLC BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7µm)

Dung môi A: methanol Dung môi B:

nước axit formmic 0,01 %

LC Sữa bột, bơ, thịt cá và trứng

- Xử lý mẫu: chiết với hệ dung môi EDTA 0,1 % : ACN : MeOH (1:1:1, tt/tt/tt)

- Điều kiện sắc ký: cột Atlantis T3 C18 (100 x 2,1 mm, 3 µm) Positive mode:

dung môi A: nước acid formic 0,01 %;

dung môi B: methanol Negative mode:

dung môi A: đệm ammonium format 1mM Dung môi B: MeOH; dung môi C:

HILIC Thịt bò

- Xử lý mẫu: chiết lần 1 với ACN và lần

2 với hỗn hợp dung môi gồm ammonium acetate, sodium chloride, EDTA và TCA

- Điều kiện sắc ký: cột Acquity UPLC BEH HILIC (100 x 2,1 mm, 1,7 µm)

Dung môi A: ACN Dung môi B: nước ammonium format 1 mM với acid formic 0,1 % Dung môi C: MeOH

[50]

Nhận xét: các công trình nghiên cứu trên đều sử dụng kỹ thuật phân tích

hiện đại bao gồm sắc ký lỏng ghép đầu dò dãy diod quang (LC-PDA) [18], sắc

ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang (HPLC-FLD) [33], sắc ký lỏng pha loãng đồng vị ghép khối phổ (ID-LCMS) [36], sắc ký lỏng tương tác thân nước ghép đầu dò khối phổ (HILIC-MS/MS) [50], sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC-MS/MS) [22], [25], [51], [52], [57], [58], sắc ký lỏng ghép đầu

dò thời gian bay (LC-TOF) [43], và đặc biệt là sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép đầu dò thời gian bay và khối phổ (UHPLC-QTOF-MS) [49] Các phương pháp này được lựa chọn để phát triển phương pháp phân tích dựa trên số lượng chất phân tích và độ phức tạp của nền mẫu Tuy nhiên, phổ biến hơn cả vẫn là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò một lần hoặc hai lần khối phổ (LC-MS hoặc LC-MS/MS) với ưu điểm rõ rệt về giới hạn phát hiện rất thấp, cho phép ứng dụng định lượng đồng thời các chất có hàm lượng thấp trong nền mẫu phức tạp như tôm, cá, thịt gia súc gia cầm, sữa, cơ quan động vật,… Ngoài ra, đây cũng là một công cụ định tính rất nhanh và hiệu quả dựa trên cơ

sở dữ liệu khối phổ có sẵn

Các hợp chất được định lượng đồng thời với bốn đối tượng của đề tài (sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim) đều là những nhóm kháng sinh hoặc thuốc hóa dược được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi,

có nguy cơ cao tồn đọng trong các mẫu do việc sử dụng bừa bãi và quá liều, ví

dụ như các kháng sinh nhóm sulfonamid (dapson, sulfaguanidin, sulfadimidin, sulfamethizol, sulfapyridin,…) [43], nhóm tetracyclin, nhóm aminoglycosides, nhóm macrolides [58], nhóm penicillins [22], các thuốc hóa dược như atenolol, atorvastatin, tramadol, triamterene, carbamazepin, meloxicam,…[49], [52] Do nền mẫu phức tạp nên phương pháp xử lý mẫu cũng khá đa dạng và trong một

số nghiên cứu gồm nhiều bước như phương pháp QuEChERS [25], [43], chiết lỏng lỏng (LLE) [36], [51], chiết pha rắn (SPE) [18], hoặc kết hợp chiết với

dung môi/ hệ dung môi hữu cơ và làm sạch tiếp với SPE [49] Cột sắc ký sử dụng chủ yếu là cột pha đảo C18 với kích thước và cỡ hạt khác nhau phù hợp cho phân tích hỗn hợp các chất bằng phương pháp HPLC hoặc UPLC ghép với các loại đầu dò Pha động sử dụng là các dung môi hữu cơ phân cực như MeOH, ACN hoặc nước, có thể thêm các đệm như acid formic, ammonium format, axit acetic với nồng độ khác nhau, giúp tăng khả năng phân tách và phù hợp với thiết bị phân tích Các nghiên cứu có thể sử dụng [22], [25], [36] hoặc không

sử dụng nội chuẩn [18], [43], [49] nhưng đều chứng minh được tính chính xác

và ổn định của phương pháp phân tích Nội chuẩn được sử dụng là những chất

có cấu trúc hóa học gần giống với chất khảo sát (cùng nhóm hoặc là đồng vị), bền vững, tách khỏi chất phân tích, thời gian lưu gần với chất phân tích, có sẵn trên thị trường và đối với riêng đầu dò khối phổ là tạo được phân mãnh phù hợp, ổn định khi bắn phá bằng khối phổ

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép đầu dò khối phổ ba tứ cực

Phương pháp UPLC-MS/MS được xem là một trong những công cụ phân tích định lượng mạnh nhất hiện nay, cho độ nhạy cao (fg/ml), độ chính xác và tính đặc hiệu cao, được ứng dụng trong phân tích mẫu dược phẩm, thực phẩm,

mỹ phẩm, trong lĩnh vực độc chất học, sinh dược học và dược động học,… [39], [53]

1.4.1 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) có thể chịu được áp suất lên đến 1200 bar cho phép phân tích với các cột sắc ký có kích thước hạt nhỏ

từ 1,5 – 2 µm, giúp giảm thời gian, dung môi phân tích và quan trọng hơn làm tăng khả năng phân tách, tăng hiệu năng cột, giúp cải thiện độ phân giải của phương pháp lên gấp nhiều lần [1]

thước giọt sương càng nhỏ đến khi tạo nên sự giải hấp các ion

Ưu điểm: ESI tạo ion dương hoặc âm tùy vào điện thế, thích hợp cho các

hợp chất kém bền nhiệt, có khối lượng phân tử lớn và có tính phân cực

Nhược điểm: các hợp chất mà phân tử không mang nhóm chức dễ ion

hóa có thể áp dụng kỹ thuật ESI bằng cách tạo muối natri, kali, amoni hay acetat Tuy nhiên, với sự hiện diện của các ion này có thể tạo các sản phẩm cộng, gây khó khăn cho việc biện giải cấu trúc hóa học [13], [39], [53]

1.4.2.2 Bộ phận phân tích ba lần tứ cực

Đầu dò hai lần khối phổ (MS/MS) với bộ phận phân tích khối kiểu ba lần

tứ cực được ghép nối tiếp nhau như hình 1.6 Trong đó tứ cực thứ nhất Q1 sẽ chọn lọc các ion mong muốn (ion mẹ) được đưa vào Q2 có vai trò tạo ra sự phân ly ion do va chạm (collision induced dissociation; CID) với các khí trơ

(nitơ, heli, argon) ở áp suất cao hơn với mức năng lượng va đập được lựa chọn

Nhờ va chạm này năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ion) hay ion phân mảnh Tiếp theo, các ion con hình thành này được chọn lọc

dẫn vào Q3 và đến đầu dò

Ưu điểm: độ nhạy tốt nhất cho phân tích định lượng Cho nhiều thông tin

về cấu trúc hợp chất nhờ sự kiểm soát những ion mẹ, ion con, mảnh trung hòa

Nhược điểm: giá thành cao, đòi hỏi điều kiện về hệ thống điện trường đạt

chuẩn Với đầu dò khối phổ ba lần tứ cực để thu được tín hiệu cao nhất (có độ nhạy cao nhất), cần khảo sát một số thông số như chế độ ion hóa (dương hay âm), thế mao quản (capillary voltage), thế cone (cone voltage), thời gian chờ ghi nhận tín hiệu (dwell time), nhiệt độ buồng ion hóa, năng lượng buồng va chạm (collision cell energy), tốc độ dòng khí phun (nebulizer gas flow), nhiệt

độ khí bay hơi (desolvation temperature) và tốc độ dòng khí bay hơi (desolvation gas flow) [10], [39], [53]

Hình 1.6 Sơ đồ khối của ba tứ cực nối tiếp

1.4.2.3 Các chế độ sử dụng trong kỹ thuật khối phổ ba lần tứ cực

Khối phổ cho nhiều dạng dữ liệu Phổ biến nhất là phổ khối, trình bày trên hệ trục: cường độ tương đối (trị số m/z) Người ta chọn pic có cường độ mạnh nhất được gọi là pic cơ bản (base peak) chấp nhận là 100 để tính cường

độ tương đối của các pic khác

Trong thao tác, trên máy MS-MS ta có thể thực hiện các chế độ phân tích (Mode) như sau:

- Chế độ MS full Scan: khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ scan thường được lựa chọn để khảo sát phân tử ban đầu

- Chế độ MRM (Multiple reaction monitoring): Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ hai

(thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập hai (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ ba và đưa vào đầu dò để phát hiện

- Chế độ SIM: Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một

số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion phân tử ban đầu

- Chế độ quét những ion phân mảnh (Daughter scan): tập trung trên máy khối phổ thứ nhất (trong buồng ion hoá nhiều ion với m/z khác nhau), chọn khảo sát một ion với m/z cụ thể (bây giờ, ion này được gọi là ion báo trước), cho ion này vào buồng va chạm để va chạm với khí trơ, để phân mảnh, rồi xác định những ion phân mảnh vừa được tạo thành trong máy khối phổ thứ hai

- Chế độ quét những ion báo trước hay ion cha mẹ - Precursor (parents) ion spectrum: tập trung trên máy khối phổ thứ nhì, chọn nghiên cứu một mảnh ion con, rồi quét máy khối phổ thứ nhất để tìm xem trong máy khối phổ thứ nhất có nhiều ion với m/z khác nhau, thì những ion nào đã có thể phân mảnh

để tạo thành mảnh ion con này

- Chế độ SRM (Selected reaction monitoring): Cô lập ion cần chọn, sau

đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện [13], [39], [53]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các kháng sinh phân tích sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol

và trimethoprim có trong các mẫu thử giả lập và mẫu thử ứng dụng

Mẫu trắng: mẫu thịt heo, bò, gà sạch không chứa các chất phân tích sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim được mua tại siêu thị thành phố Cần Thơ Mẫu trắng được gửi đi phân tích tại Trung tâm Kiểm nghiệm MekongLAB Cần Thơ và có giấy chứng nhận không chứa sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim (Phụ lục 13)

Mẫu thử giả lập: mẫu hỗn hợp chuẩn sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim được thêm vào mẫu trắng với nồng độ thích hợp

để xây dựng và thẩm định phương pháp

Mẫu thử: Các mẫu thịt heo, bò, gà thu thập tại các cơ sở giết mổ, chợ, siêu thị trên địa bàn tỉnh Kiên Giang

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Mẫu được chọn theo hướng dẫn của các tiêu chuẩn Việt Nam: TCVN

4833 - 1: 2002 - Thịt và sản phẩm thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Lấy

mẫu [2]

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Những mẫu thịt bị hôi, thối không đạt tiêu chuẩn vi sinh hoặc không đáp ứng theo tiêu chuẩn chọn mẫu

2.1.4 Nguyên vật liệu - hóa chất, dung môi - trang thiết bị

- Các chất chuẩn được bảo quản ở 2-8 oC và tránh ánh sáng:

+ Công ty TRC (Canada) cung cấp: sulfaquinoxalin có số lô

5-MIC-120-1 và hàm lượng 96%; sulfathiazol có số lô 6-ABY-97-5-MIC-120-1 và hàm lượng 98%

+ Do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp: sulfamethoxazol có số lô QT071 100118 và hàm lượng 99,8%; trimethoprim

có số lô QT044 080718 và hàm lượng 99,5%

- Hoá chất, dung môi: methanol (MeOH), acetonitril (ACN), acid formic (AF), isopropanol (ISP) đạt tiêu chuẩn HPLC gradient, nước cất đạt tiêu chuẩn

MS của Merck, Đức Các hóa chất NaCl khan, Na2SO4 khan, MgSO4 khan đạt

tiêu chuẩn dùng cho phân tích

- Trang thiết bị:

+ Hệ thống sắc ký lỏng WATERS ACQUITY UPLC H-Class system,

ghép đầu dò khối phổ ba lần tứ cực của Waters (Xevo TQD)

+ Cân phân tích ABT 220-5DM, bể siêu âm Wisd WUC-D22H

+ Tủ lạnh sâu Sanyo MDF-236

+ Máy đo pH Consort C1020

+ Máy Vortex VM-10 DAIHAN Scientific

+ Máy li tâm Hitech

+ Máy khuấy từ IKAC-MAG HS 10

+ Máy cô khí nitơ OA-HEATTM

+ Các dụng cụ thuỷ tinh màu trong phân tích

+ Màng lọc nylon 0,45 µm, 0,2 µm

2.1.5 Địa điểm nghiên cứu và thời gian nghiên cứu

LBM HPT-KNT-ĐC Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Thời gian từ tháng 01 năm 2020 đến tháng 07 năm 2021

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

Tổng cộng nghiên cứu được tiến hành trên 267 mẫu trong đó bao gồm:

- 79 mẫu phân tích được dùng để xây dựng quy trình định lượng đồng thời dư lượng các kháng sinh sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol,

trimethoprim trong mẫu thịt gia súc, gia cầm bằng phương pháp LC-MS/MS

- 156 mẫu phân tích được dùng để thẩm định quy trình định lượng đồng thời dư lượng các kháng sinh sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol,

trimethoprim trong mẫu thịt gia súc, gia cầm theo hướng dẫn của EC/2002

- 10 mẫu thịt heo, 13 mẫu thị bò, 09 mẫu thịt gà thu thập tại các siêu thị

và chợ trên địa bàn tỉnh Kiên Giang được ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định để phân tích đồng thời dư lượng các kháng sinh sulfaquinoxalin,

sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim

Lấy mẫu: theo TCVN 4833 – 1 : 2002 cho mẫu thịt và sản phẩm thịt [2]

Dụng cụ lấy mẫu và các vật chứa đơn vị mẫu: vật liệu của vật chứa tiếp

xúc trực tiếp với các đơn vị mẫu phải không thấm nước, không thấm mỡ, không hòa tan và không hấp thụ Dụng cụ lấy mẫu và các vật chứa đơn vị mẫu phải

khô, sạch và không ảnh hưởng đến thành phần hóa học của sản phẩm

Quy trình lấy mẫu: lấy các đơn vị mẫu trong các bao gói sẵn hoặc từ mẫu

thịt miếng có khối lượng không quá 2 kg, lấy các đơn vị mẫu thứ cấp được cắt thành miếng từ bề mặt cắt sao cho việc tổn thương mẫu là nhỏ nhất, với khối

lượng khoảng 500 g đến 1 kg

Bao gói đơn vị mẫu: gói từng đơn vị mẫu vào trong vật chứa mẫu thích

hợp, đóng kín, niêm phong và dán nhãn

Vận chuyển và bảo quản các đơn vị mẫu: sau khi lấy mẫu, gửi các đơn

vị mẫu đến phòng thử nghiệm càng nhanh càng tốt, trong suốt thời gian đó

chúng phải được duy trì ở nhiệt độ bảo quản sản phẩm

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

2.2.4.1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời sulfaquinoxalin, sulfathiazol, sulfamethoxazol, trimethoprim bằng phương pháp LC- MS/MS có trong mẫu thịt gia súc (heo, bò), gia cầm (gà)

- Dung dịch AF 1 % trong ACN: hút chính xác 1 mL acid formic đậm đặc vào bình định mức 100 mL, bổ sung vừa đủ bằng acetonitril, lắc đều

- Dung dịch ACN:MeOH (1:1): hút chính xác 10 mL ACN vào bình định mức 20 mL, bổ sung vừa đủ bằng MeOH, lắc đều

- Dung dịch ISP 10 %, 20 %, 40 %, 60 % trong ACN: hút chính xác 5

mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL ISP vào bình định mức 50 mL, bổ sung vửa đủ bằng ACN, lắc đều

Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc 400 ppm SQX, STZ, SMX, TMP trong MeOH: Cân chính xác khoảng 4 ± 0,1 mg lần lượt các chuẩn nói trên vào các bình định mức 10 mL, thêm khoảng 5 mL dung môi MeOH, đánh siêu âm đến khi các chất rắn tan hoàn toàn Bổ sung vừa đủ bằng dung môi MeOH (nồng độ thực của chuẩn gốc được tính toán lại theo độ tinh khiết của chuẩn sử dụng)

- Dung dịch hỗn hợp chuẩn 200 ppb SQX, STZ, SMX, TMP: hút chính xác 25 µL mỗi dung dịch chuẩn gốc 400 ppm của các chất phân tích bằng micropipet cho vào bình định mức 50 mL Bổ sung vừa đủ bằng hỗn hợp dung dịch ACN:AF pH 3 (10:90), lắc đều

- Dung dịch hỗn hợp chuẩn ở nồng độ 10 lần mức MRL (10MRL), tương ứng nồng độ 1 ppm đối với các sulfonamid và 500 ppb đối với trimethoprim:

từ các dung dịch chuẩn gốc 400 ppm của các chất phân tích, lần lượt hút chính xác 125 µL đối với SQX, STZ, SMX và 62,5 µL đối với trimethoprim bằng micropipet cho vào bình định mức 50 mL Bổ sung vừa đủ bằng hỗn hợp dung dịch ACN:AF pH 3 (10:90), lắc đều

- Dung dịch xây dựng đường chuẩn C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8: hút chính xác một thể tích (µL) hỗn hợp chuẩn 10MRL như miêu tả trong Bảng 2.1 bằng micropipet cho vào bình định mức 10 mL, bổ sung vừa đủ bằng hỗn hợp dung dịch ACN:AF pH 3 (10:90), lắc đều để thu được dãy nồng độ xây dựng đường chuẩn:

Bảng 2.1 Chuẩn bị dãy dung dịch xây dựng đường chuẩn

Thể tích hút (µL)

Nồng độ các sulfonamid (ppb)

Nồng độ TMP (ppb)

Sử dụng chế độ auto-tune để khảo sát các thông số khối phổ nhằm thu được tín hiệu tốt nhất của các kháng sinh Kiểm tra lại kết quả từ auto-tune bằng

Các thông số khối phổ dự kiến khảo sát:

+ Kiểu ion hóa ESI: dương (ES+) hay âm (ES-)

+ Thế mao quản (capillary voltage): 2-4,5 kV

+ Thế cone (cone voltage): 10-80 V

+ Thời gian chờ ghi nhận tín hiệu (dwell time): 0,1-0,5 giây

+ Năng lượng buồng va chạm (collision cell energy): 5-40 V

+ Nhiệt độ khí hóa hơi (desolvation temp): 100-600 °C

+ Tốc độ dòng khí hóa hơi (desolvation gas flow): 50-1000 L/giờ

Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp

Tham khảo các tài liệu được công bố, kết hợp với tính phân cực trung bình đến cao của các chất phân tích nên phương pháp sắc ký pha đảo được áp dụng với hệ pha động bao gồm các dung môi hữu cơ acetonitril, methanol, kết

hợp nước acid formic với các pH khác nhau

Điều kiện sắc ký khảo sát:

- Pha tĩnh: cột Agilent Poroshell 120 Phenyl-Hexyl (4,6 mm × 150 mm; 2,7 µm), cột Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 150 mm; 3,5 µm) và cột GL InertSustain C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm)

- Pha động: acetonitril, methanol, nước hoặc nước acid formic Thay đổi

loại dung môi, tỷ lệ dung môi với pH thay đổi

- Chương trình rửa giải isocratic và gradient

Khảo sát quá trình tách chiết và làm sạch mẫu

Mẫu trắng là mẫu thịt heo, bò, gà không có chứa các chất phân tích được chứng nhận bởi phòng phân tích độc lập Mekong Laboratories (Phụ lục 14)

Chuẩn bị mẫu cho một đợt phân tích: thịt heo, bò, gà (100 – 150 g) được

rã đông hoàn toàn, sau đó được cắt nhỏ và xay nhuyễn trong máy xay Cân chính xác khoảng 2,00 ± 0,1 g mẫu thịt đã xay nhuyễn cho vào ống ly tâm 15

mL, sau đó thêm vào dung dịch hỗn hợp các chất chuẩn ở nồng độ MRL trong dung môi chiết và xử lý theo các quy trình khảo sát

Tiến hành tách chiết và làm sạch mẫu: tham khảo các nghiên cứu được công bố [25], [43], [45], [46], [47] và TCVN 11294:2016, TCVN 11838:2017 [3], [4], nhóm nghiên cứu tiến hành xử lý mẫu trên nguyên tắc sử dụng dung môi chiết chất phân tích là dung môi hữu cơ, tủa loại protein bằng dung môi hữu cơ và các muối vô cơ, loại tạp chất béo bằng phương pháp ngâm lạnh với nước đá Các thông số của quy trình được khảo sát bao gồm loại và thể tích dung môi hữu cơ chiết (mL), lượng muối vô cơ sử dụng (mg), thời gian ngâm lạnh (phút) theo sơ đồ ở Hình 2.1