Nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh và các gen đề kháng kháng sinh carbapenem của vi khuẩn acinetobacter baumannii phân lập từ bệnh phẩm đường hô hấp tại bệnh viện đa khoa thành phố cần thơ nă

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ TRẦN LĨNH SƠN NGHIÊN CỨU SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ CÁC GEN ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CARBAPENEM CỦA VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII PHÂN LẬP TỪ BỆNH PHẨM ĐƯỜN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

TRẦN LĨNH SƠN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ CÁC GEN ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CARBAPENEM

CỦA VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII

PHÂN LẬP TỪ BỆNH PHẨM ĐƯỜNG HÔ HẤP TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THÀNH PHỐ CẦN THƠ

NĂM 2021-2022

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Cần Thơ, 2022

TRẦN LĨNH SƠN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH VÀ CÁC GEN ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CARBAPENEM

CỦA VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII

PHÂN LẬP TỪ BỆNH PHẨM ĐƯỜNG HÔ HẤP TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THÀNH PHỐ CẦN THƠ

nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào

Tác giả

TRẦN LĨNH SƠN

rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ quí thầy cô, gia đình và bạn bè Nhân đây, tôi xin chân thành cảm ơn cũng như bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Thầy PGS.TS Trần Đỗ Hùng - Khoa Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ là người thầy trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu cũng toàn thể các cán bộ Trường Đại học Y Dược Cần Thơ đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi và các bạn học viên khác trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cám ơn đến Khoa Vi sinh - Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể thu thập mẫu, thông tin bệnh nhân và thực hiện để tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bệnh nhân đã tham gia nghiên cứu này

Xin chân thành cám ơn!

Tác giả

TRẦN LĨNH SƠN

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình, biểu đồ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương vi khuẩn Acinetobacter baumannii 3

1.2 Kháng sinh 8

1.3 Sự đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii 13

1.4 Các phương pháp nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii 16

1.5 Tình hình các nghiên cứu về sự đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3 Đạo đức trong nghiên cứu 38

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 Một số đặc điểm chung mẫu nghiên cứu của bệnh nhân 39

3.2 Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii 41

3.3 Tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng kháng sinh carbapenem của vi khuẩn Acinetobacter baumannii 46

3.4 Mối liên quan của các gen mã hoá carbapenemase với kết quả kháng sinh đồ 51

4.3 Tỷ lệ xuất hiện các gen kháng kháng sinh với carbapenem của vi khuẩn

Acinetobacter baumannii 65

4.4 Mối liên quan của các gen mã hoá carbapenemase với kết quả kháng sinh

đồ 69

KẾT LUẬN 72 KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

VIẾT

TẮT

ARN Acid Ribonucleic Vật chất di truyền ARN AST Antibiotic Susceptibility Testing Thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh ADN Acid Deoxyribonucleic Vật chất di truyền ADN

BA Blood Agar Thạch máu

BHI Brain Heart Infusion Agar Thạch BHI

BSA Bovine Scrum Albumin

CFU Colony Form Units Đơn vị hình thành khuẩn lạc CLSI Clinical and Laboratory Standard Instite Viên tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDR Extensire drug Resistance Siêu kháng thuốc

EF-G Elongation factor G Yếu tố kéo dài G

Fw Forward primer Mồi xuôi

ICU Intensive Care Unit Khoa hồi sức tích cực–chống độc KIA Kligler Iron Agar Môi trường KIA

LPS Lipopolysaccharides

mARN Messenger ARN ARN thông tin

MC Mac-Conkey Agar Môi trường MC

MIC Minimal Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MDR Multidurg Resistance Đa kháng thuốc

MR-VP Methyl Red and Voges Proskauer Môi trường MR-VP

PBP Penicillin Binding Protein Liên kết protein-penicillin PCR Polymerase Chain Reaction Chuỗi phản ứng trùng hợp

PDR Pandrug Resistance Toàn kháng thuốc

Rv Reverse primer Mồi ngược

TAE Tris Acetate EDTA Đệm TAE

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế Giới

Bảng 1.1 Các đặc điểm sinh vật hoá học của Acinetobacter baumannii 5

Bảng 2.1 Cách đọc kết quả định lượng các loại vi khuẩn trong mẫu đàm 28 Bảng 2.2 Danh sách các kháng sinh được khảo sát kháng sinh đồ trên

Acinetobacter baumannii 32

Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi cho các gen đích 35 Bảng 2.4 Các thành phần tham gia phản ứng multiplex PCR 36 Bảng 3.1 Đặc điểm về giới tính, nhóm tuổi và nghề nghiệp của bệnh nhân ghi trên bệnh phẩm 39 Bảng 3.2 Đặc điểm về các khoa, phòng lâm sàng 40

Bảng 3.3 Tỷ lệ đề kháng carbapenem của vi khuẩn Acinetobacter Baumannii

42

Bảng 3.4 Tỷ lệ đề kháng theo từng loại kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter

baumannii theo các khoa phòng lâm sàng 43

Bảng 3.5 Tỷ lệ đa đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii

Bảng 3.12 Phân bố các tổ hợp gen đề kháng kháng sinh với carbapenem theo các khoa, phòng lâm sàng 50 Bảng 3.13 Liên quan giữa tỷ lệ các gen mã hoá carbapenemase ở hai nhóm nhạy cảm và đề kháng với kháng sinh carbapenem 51 Bảng 3.14 Liên quan giữa phân bố các tổ hợp gen mã hoá carbapenemase ở hai nhóm nhạy cảm và đề kháng với kháng sinh carbapenem 52 Bảng 3.15 Liên quan giữa tỷ lệ các gen với tỷ lệ đa đề kháng kháng sinh của

vi khuẩn Acinetobacter baumannii 53

Bảng 3.16 Liên quan giữa phân bố các tổ hợp gen với tỷ lệ đa đề kháng kháng

sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii 54

Bảng 3.17 Kết quả multiplex PCR và kháng sinh đồ của các mẫu 55

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii 4

Hình 1.2 Khuẩn lạc Acinetobacter baumannii trên môi trường Blood Agar 4 Hình 1.3 Khuẩn lạc Acinetobacter baumannii trên môi trường Mac-Conkey Agar 5

Hình 1.4 Các vị trí tác dụng của kháng sinh 8

Hình 1.5 Các cơ chế đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii 14

Hình 1.6 Máy xét nghiệm tự động Vitek 2 compact 17

Hình 2.1 Acinetobacter baumannii trên phết nhuộm Gram 29

Hình 2.2 Diễn giải kết quả thử nghiệm oxidase 30

Hình 2.3 Diễn giải kết quả thử nghiệm catalase 31

Hình 3.1 Tổ hợp các gen theo kết quả điện di của phản ứng multiplex PCR 47

Biểu đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 37

Biểu đồ 3.1 Đặc điểm về các loại bệnh phẩm 40

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ đề kháng kháng sinh chung 41

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ đề kháng từng loại kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii theo loại bệnh phẩm 42

Biểu đồ 3.4 Tần suất xuất hiện các gen đề kháng kháng sinh với carbapenem 46

MỞ ĐẦU

Tại Việt Nam, theo báo cáo năm 2015 của Bộ Y tế về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp đang chiếm tỷ lệ cao (khoảng 70%), các vi khuẩn chiếm ưu thế trong việc gây bệnh là họ

Enterobacteriaceae [2] Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ đề kháng

kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm đang ở mức rất cao [27], [28], [29], [59]

Trong đó, vi khuẩn Acinetobacter baumannii được biết đến như là một tác nhân

hàng đầu trong danh sách các loại vi khuẩn có tỷ lệ đề kháng kháng sinh nguy hiểm nhất [66] Chúng gây những bệnh lý với mức độ nặng khác nhau như: viêm phổi, nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn vết mổ, nhiễm khuẩn hệ tiết niệu…

Tỷ lệ vi khuẩn Acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện đang tăng

dần hằng năm trên nhiều quốc gia trên thế giới Cùng với đó là trình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này đang ngày càng tăng cao, như đề kháng kháng sinh với nhiều loại kháng sinh như: carbapenem, cephalosporin,

cefepim… Theo tác giả Vũ Quỳnh Nga, tỷ lệ vi khuẩn Acinetobacter baumannii

kháng 100% với các cephalosporin thế hệ thứ 3, kháng 96,6% với cefepim, kháng 98,3% với ciprofloxacin và kháng 80-90% với các carbapenem [12] Nguyên nhân của tình trạng này do sử dụng kháng sinh nhiều và kéo dài, việc lạm dụng và sử dụng kháng sinh không theo chỉ định của bác sĩ cũng góp phần làm cho sự đề kháng kháng sinh diễn biến phức tạp và trầm trọng hơn [34]

Trong khi tốc độ vi khuẩn đề kháng kháng sinh ngày càng tăng nhanh, với cơ chế đề kháng kháng sinh ngày càng phức tạp và khó xác định, việc nghiên cứu tìm ra kháng sinh mới không thể theo và đáp ứng kịp trong công tác điều trị trên lâm sàng Hiện nay mặc dù có nhiều tác giả đã thực hiện các

nghiên cứu về vi khuẩn Acinetobacter baumannii cũng như vấn đề đề kháng

kháng sinh của vi khuẩn này, tuy nhiên các nghiên cứu này chỉ áp dụng phương

pháp thủ công, nuôi cấy thông thường Trong khi đó, việc xác định sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này bằng nhiều phương pháp như: định danh và làm kháng sinh đồ bằng máy tự động, sinh học phân tử đã khá phổ biến và đem lại nhiều hiệu quả tối ưu, nhưng chưa được áp dụng phổ biến rộng rãi

Xuất phát từ những vấn đề cấp bách và cần thiết đó, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh và các gen đề kháng

kháng sinh carbapenem của vi khuẩn Acinetobacter baumannii phân lập

từ bệnh phẩm đường hô hấp tại khoa xét nghiệm Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ năm 2021-2022” với ba mục tiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii phân lập từ bệnh phẩm đường hô hấp tại Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ năm 2021-2022

2 Xác định tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng kháng sinh carbapenem của Acinetobacter baumannii bằng kỹ thuật multiplex PCR tại Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ năm 2021-2022

3 Tìm hiểu mối liên quan của các gen mã hoá carbapenemase và kết quả kháng sinh đồ ở Acinetobacter baumannii tại Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ năm 2021-2022.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương vi khuẩn Acinetobacter baumannii

1.1.1 Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii là một trong những vi khuẩn được chú ý trong

nhóm vi khuẩn Gram âm gây bệnh, có kích thước tương đối ngắn, gần như hình tròn hoặc hình que Nó được đặt theo tên của nhà vi khuẩn học Paul Baumann

Acinetobacter baumannii có thể là một mầm bệnh cơ hội ở người, ảnh hưởng

đến những người có hệ thống miễn dịch bị suy giảm và trở nên nghiêm trọng như một bệnh nhiễm trùng có nguồn gốc từ bệnh viện

Phân loại của Acinetobacter baumannii:

Loài : Acinetobacter baumannii [40]

Về mặt hình thái Acinetobacter baumannii là: một vi khuẩn Gram âm, đa

hình (hình cầu khuẩn hoặc cầu trực khuẩn), thường có dạng song cầu, không di động, có kích thước 0,9-1,6µm, có vỏ khá dày và không sinh nha bào và có nguồn gốc từ trong thiên nhiên như đất, nước, thực phẩm… Ngoài ra, trong môi trường bệnh viện , chúng có thể tìm thấy trên giường, rèm, tường, các dụng cụ

và thiết bị y tế… [3]

Hình 1.1 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii

(Nguồn: Atlas hình thể vi khuẩn và khuẩn lạc, 2009 [17])

1.1.2 Đặc điểm sinh học của Acinetobacter baumannii

1.1.2.1 Tính chất nuôi cấy

Acinetobacter baumannii là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối và dễ mọc trên các

môi trường nuôi cấy thông thường ở nhiệt độ 35-37oC như:

- Trong môi trường canh thang, vi khuẩn mọc nhanh và đục đều

- Trên môi trường thạch máu (Blood Agar) khuẩn lạc tương đối nhẵn đôi khi có hơi nhầy, không gây tan máu, có màu trắng đục hoặc màu xám nhạt và

- Trên môi trường Mac-Conkey Agar thấy được các khuẩn lạc không lên men lactose nên có màu trắng đục và hình tròn với kích thước nhỏ [40]

Hình 1.3 Khuẩn lạc Acinetobacter baumannii trên môi trường

Mac-Conkey Agar

(Nguồn: Atlas hình thể vi khuẩn và khuẩn lạc, 2009 [17])

1.1.2.2 Tính chất sinh vật hoá học của Acinetobacter baumannii

Các đặc điểm sinh vật hoá học của Acinetobacter baumannii:

Bảng 1.1 Các đặc điểm sinh vật hoá học của Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii

1 Thử nghiệm oxidase Âm tính

2 Thử nghiệm catalase Dương tính

6 H2S, Indol, MR-VP, Urease Âm tính

7 Galactose, Malonate Dương tính

Giống như một số loại vi khuẩn Gram âm khác, chúng dễ bị các chất khử

trùng tiêu diệt nhưng Acinetobacter baumannii có tính chất thay đổi tuỳ theo

điều kiện và phân bố trong các môi trường khác nhau như: ở ngoại cảnh (đất, nước, không khí…), trong môi trường bệnh viện (có thể tìm thấy trên giường, rèm, tường, các dụng cụ và thiết bị y tế…) [37]

Acinetobacter baumannii có thể tồn tại lâu và tích luỹ các gen đề kháng

kháng sinh ngay trong bệnh viện nhờ vào việc tồn tại ở trạng thái không hoạt động và khả năng hình thành biofilm Việc hình thành biofilm giúp cho

Acinetobacter baumannii có thể bám vào bề mặt các sinh vật sống và cả bề mặt

khác, mặt khác đây cũng chính là một trong những yếu tố quan trọng trong việc

tồn tại và gây bệnh của Acinetobacter baumannii [46]

1.1.3 Khả năng gây bệnh

Nguồn lây: Acinetobacter baumannii có thể sống trong nhiều điều kiện khác

nhau của tự nhiên cũng như trong môi trường bệnh viện, đặc biệt còn có thể cư trú trên da của người bệnh và người khoẻ mạnh, nhân viên y tế do đó họ sẽ trở thành người lành mang trùng có nguy cơ lây nhiễm tiềm tàng khá cao

Đường lây: vi khuẩn Acinetobacter baumannii lây qua các đường sau:

- Lây qua con đường tiếp xúc: đây là con đường lây nhiễm chính Bệnh nhân có thể tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với các nguồn nhiễm như: bệnh nhân, nhân viên y tế bị nhiễm, các bề mặt môi trường bị nhiễm khuẩn đặc biệt

là các dụng cụ xâm lấn vào cơ thể bệnh nhân và từ đó đi vào trong dòng máu như các catheter mạch máu, ống nội khí quản [18]

- Lây qua đường giọt bắn: vi khuẩn Acinetobacter baumannii có thể lây

qua đường giọt bắn hoặc không khí, điều này giúp cho việc lý giải cho khả năng lan tràn với phạm vi rộng của vi khuẩn trong môi trường bệnh viện [18]

Đối tượng gây bệnh của Acinetobacter baumannii: vi khuẩn gây bệnh trên

bệnh nhân có bệnh lý mạn tính, suy giảm miễn dịch do HIV/AIDS, việc sử

dụng thuốc ức chế miễn dịch hay thuốc chống phân bào một thời gian dài…

Yếu tố độc tố của vi khuẩn Acinetobacter baumannii:

- Các đặc tính độc lực của Acinetobacter baumannii chủ yếu được đề cập

từ việc tránh được sự thanh thải của hệ thống miễn dịch, tạo điều kiện cho mật

độ vi khuẩn cao kích hoạt nhiễm trùng huyết qua trung gian lipopolysaccharides (LPS)-Toll like receptor 4 (TLR4) [44]

- Polysaccharide là một yếu tố độc lực quan trọng giúp tránh được miễn dịch, trong khi LPS gây sốc nhiễm trùng [44]

- Protein màng ngoài A có liên quan đến việc cải thiện độ bám dính, đặc biệt với các tế bào biểu mô của đường hô hấp Nó khu trú trong ty thể và nhân được biểu hiện bởi phân tử proapoptotic cytochrome C gây chết tế bào [44]

Cơ chế gây bệnh của Acinetobacter baumannii: được tính từ lúc nghiên cứu

cho đến hiện nay thì các cơ chế gây bệnh của Acinetobacter baumannii được

mô tả như sau:

- Sự hình thành màng sinh học, sự xâm thực của bề mặt môi trường được thúc đẩy bởi sự kết dính qua pili và sự hình thành đó của màng sinh học Protein gắn với màng sinh học cần thiết cho sự duy trì và trưởng thành của màng sinh học Bap cũng có vai trò khá quan trọng trong việc xâm nhập của vi khuẩn vì điều kiện thuận lợi cho sự bám dính vào các tế bào [44]

- Protein màng ngoài A, sản xuất OmpA cần thiết tạo ra một màng sinh học nguyên vẹn, cần thiết cho sự bám dính lên các tế bào biểu mô, gây ra

apoptosis của tế bào bằng cách xâm nhập vào tế bào và kích thích giải phóng

cytochrme C và các yếu tố gây apoptosis Mặc khác OmpA cũng giúp liên kết với yếu tố H, là chất ức chế con đường bổ thể thay thế [44]

- Fimbriae giúp gắn sinh vật vào các bề mặt trong môi trường Chúng cũng giúp định cư trên các bề mặt sinh vật, chẳng hạn như tế bào biểu mô [44]

1.2 Kháng sinh

1.2.1 Định nghĩa

Kháng sinh là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo

ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, actinomycetes), có tác dụng ức chế

sự phát triển của các vi sinh vật khác [2]

1.2.2 Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh

Hoạt tính kháng khuẩn của hầu hết các nhóm kháng sinh đều liên quan trực tiếp đến các đặc tính điển hình của cấu trúc vi khuẩn hoặc các quá trình trao đổi chất của chúng Để tìm hiểu vị trí tác dụng của một loại kháng sinh cụ thể trước hết phải nắm được cấu trúc của kháng sinh và nơi nó có thể gắn kết Hầu hết các đích của kháng sinh thường liên quan trực tiếp đến tế bào vi khuẩn thông qua việc ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào hoặc ức chế hình thành vật liệu

di truyền [45]

Hình 1.4 Các vị trí tác dụng của kháng sinh

(Nguồn: Ebimieowei E và Ibemologi A, 2016 [45])

1.2.2.1 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

Kháng sinh ngăn cản sự khởi đầu của quá trình tổng hợp protein bằng cách gắn vào tiểu đơn vị ribosom 30S và 50S với các cơ chế bao gồm:

- Liên kết không đảo ngược với ribosom 30S và ngăn cản phức hệ khởi đầu 30S (30S-mARN-tARN): các amioglycosid [2]

- Liên kết đảo ngược với ribosom 30S và ức chế quá trình liên kết aminoacyl-t-ARN với vị trí tiếp nhận trên ribosom 70S: các tetracycline

- Cản trở có thể đảo ngược quá trình tương tác giữa mARN và ribosom 30S mà không gây sai sót trong dịch mã mARN như các amoniglycoside: spectinomycin (kháng khuẩn)

- Liên kết ribosom 50S ức chế hoạt tính của piptidyl transferase: lincomycin, clindamycin, cloramphenocol [2]

Ngoài cơ chế trên, các kháng sinh còn có khả năng tác động lên quá trình kéo dài chuỗi peptid nhờ vào liên kết với yếu tố kéo dài G (EF-G) và ức chế giải phóng yếu tố kéo dài G (EF-G) từ phức hợp EF-R/GDP: acid fusidic

1.2.2.2 Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic

Kháng sinh có thể tác động vào quá trình sinh tổng hợp acid nucleic bao gồm cả sinh tổng hợp ARN và ADN

Quá trình ức chế sinh tổng hợp ARN nhờ vào liên kết với các ARN polymerase độc lập với ADN và ức chế sự khởi đầu tổng hợp ARN: rifampin, rifammycin, rifampicin [2]

Đối với sinh tổng hợp ADN, kháng sinh liên kết với tiểu đơn vị A của ADN gyrase (topoisomerase) và ngăn cản quá trình siêu cuộn xoắn của ADN bởi vậy

ức chế quá trình tổng hợp ADN: quinolon, fluoroquinolone, acid oxolinic [2]

1.2.2.3 Kìm hãm các quá trình trao đổi chất

Cơ chế này thông qua quá trình sinh tổng hợp acid folic Đây là chất rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cả acid nucleic và acid amin Một

số loại kháng sinh như sulphonamid và trimethoprim thể hiện tính chất như một

cơ chất giả cần thiết cho quá trình trao đổi chất ở tế bào vi khuẩn Cơ chế này làm cho enzyme của vi khuẩn gắn với kháng sinh thay vì gắn vào cơ chế thông thường Cụ thể đối với sulfonamide, đóng vai trò như: tetrahydrofolate là một thành phần quan trọng trong việc tổng hợp acid folic ở tế bào vi khuẩn [45] Các chất tương tự acid para-aminobenzoic ức chế cạnh tranh đối với sự hình thành acid folic: sulfonamide, sulfone, para-aminosalicylid, depsone (kháng khuẩn)

1.2.2.4 Tác động lên thành tế bào vi khuẩn

Kháng sinh đại diện cho cơ chế ức chế sinh tổng hợp acid mycolic, một thành phần của thành tế bào vi khuẩn, là isoniazid tuy nhiên cơ chế chính tác động lên thành tế bào vi khuẩn của kháng sinh đó là quá trình ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Quá trình tổng hợp peptidoglycan diễn ra theo ba bước,

và mỗi bước đều có thể trở thành đích tác động của kháng sinh Trong đó giai đoạn thứ ba của quá trình tổng hợp của thành tế bào gồm quá trình polymer hóa

và gắn peptidoglycan mới sinh vào thành tế bào là giai đoạn tác động chủ yếu của kháng sinh Giai đoạn này có sự tham gia của các PBP đó là các enzyme thuộc họ transglycosylase và transpeptidase, đóng vai trò then chốt trong việc hình thành peptidoglycan bằng cách thêm các pentapeptide disaccaride để mở rộng chuỗi glycan của phân tử peptidoglycan đã có và cả chuỗi liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan chưa trưởng thành [2]

Các loại thuốc thuộc nhóm beta-lactam như: penicillin, carbapenem và cephalosporin có thể ngăn chặn liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan bằng cách ức chế sự hình thành liên kết peptide bằng cơ chế PBP [2]

1.2.2.5 Tác động lên màng tế bào vi khuẩn

Một trong những đích tác động quan trọng khác của kháng sinh trên màng

tế bào đó là LPS Kháng sinh sẽ liên kết với LPS để phá hủy lớp màng ngoài LPS có vài điểm tích điện âm có khả năng tương tác với kháng sinh cyclopeptide như polymycin và colistin tích điện dương, ngoài ra một vài phản ứng kỵ nước giữa hai phân tử cũng dẫn tới làm phân rã lớp màng ngoài [2] Các kháng sinh nhóm polyen tạo kênh ion giả gắn với màng sterol của màng

tế bào nấm tạo ra phức hợp màng-polyen có thể thay đổi tính thấm của màng, dẫn tới làm thất thoát các thành phần của màng tế bào [2]

Cơ chế cuối cùng tác động lên màng tế bào là ức chế quá trình tổng hợp màng lipid Những kháng sinh này ức chế quá trình liên kết của các tiểu đơn vị tạo thành ergosterol và có thể trực tiếp phá hủy màng tế bào nấm: imidazole, miconazole, ketoconazole, clotrimazole và fluconazole [4]

1.2.3 Kháng sinh nhóm beta-lactam

Đây là nhóm kháng sinh lớn và được sử dụng rộng rãi Việc đặt tên là dựa trên cấu trúc phân tử có vòng beta-lactam, một amid nội phân tử mà nhóm amin ở vị trí beta so với nhóm chức acid Các kháng sinh nhóm này gắn vào PBP và ngăn cản quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan ở thành tế bào làm cho

tế bào vi khuẩn bị ly giải và chết Nhóm kháng sinh này bao gồm 5 phân nhóm là: penicillin, cephalosporin, monobactam, carbapenem, và nhóm chất ức chế beta-lactamase [2], [4]

nhiên trên vi khuẩn Gram dương nhưng yếu hơn Tuy nhiên, aminopenicillin

lại mở rộng trên một số vi khuẩn Gram âm như: Haemophilus influenza,

Salmonella, Escherichia coli [46]

- Penicillin phổ rộng: loại này có tác dụng mạnh hơn các loại khác trên

các vi khuẩn Gram âm (đặc biệt là: Pseudomonas và Proteus) do tăng tính thẩm

thấu qua màng tế bào vi khuẩn [46] Ưu điểm chủ yếu của nhóm này là có tác

dụng lên chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

- Thế hệ II: có tác dụng mạnh hơn trên vi khuẩn Gram âm và yếu hơn trên vi khuẩn Gram dương so với thế hệ I, các chất thuộc thế hệ II tương đối bền với beta-lactamase

- Thế hệ III: tác dụng lên vi khuẩn Gram dương đặc biệt là tụ cầu, tuy nhiên kém hơn cephalosporin thế hệ I, nhưng có phổ rộng tác dụng mạnh mẽ trên vi khuẩn Gram âm Khả năng kháng beta-lactamase mạnh hơn so với thế

hệ II

- Thế hệ IV: đây là cephalosporin phổ rộng Trên vi khuẩn Gram dương chúng có hoạt tính tương tự cephalosporin thế hệ I Trên vi khuẩn Gram âm, do các cephalosporin thế hệ IV có các ion lưỡng cực nên có thể thấm qua màng ngoài của vi khuẩn, có tác dụng kháng beta-lactamase mạnh hơn thế hệ III

1.2.3.3 Carbapenem

Nhóm kháng sinh này được tìm thấy vào năm 1976, chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc chống lại các bệnh nhiễm khuẩn Vì vậy chúng thường

được gọi là “sự lựa chọn cuối cùng” và chỉ được chỉ định khi tình trạng bệnh nhân trở nên trầm trọng hoặc nghi ngờ có sự đề kháng kháng sinh [2], [46] Một

số đại diện trong nhóm này bao gồm:

- Imipenem: có phổ tác dụng hiệu quả đối với cả vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí, thường dùng đường uống, hoạt động với liều thấp và ít tác dụng phụ [2]

- Meropenem: có phổ tác dụng hiệu quả lên trực khuẩn Gram âm, đặc biệt với các bệnh nhiễm khuẩn cơ hội [2]

- Ertapenem: có phổ tác dụng hiệu quả với trực khuẩn Gram âm không lên men đường lactose [2]

1.2.3.4 Nhóm ức chế beta-lactamase

Các chất này có cấu trúc beta-lactam, nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn, mà chỉ có vai trò ức chế beta-lactamase của vi khuẩn bằng cách ức chế không thuận nghịch nhiều beta-lactamase làm thay đổi enzyme, bất hoạt và không cho chúng giải phóng trở lại Các chất hiện nay được sử dụng trên lâm sàng là acid clavulanic, sulbactam và tazobactam [2], [4], [46]

1.3 Sự đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii

1.3.1 Các cơ chế đề kháng kháng sinh

Các cơ chế đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii bao gồm:

beta-lactamase, bơm đẩy thuốc, thay đổi cấu trúc aminoglycoside, thay đổi tính thấm của màng và thay thế vị trí gắn thuốc [37] Các cơ chế này có thể hướng tới nhiều loại kháng sinh khác nhau và có thể được vận hành cùng lúc để giúp

Acinetobacter baumannii đề kháng toàn bộ các kháng sinh thuộc cùng một

nhóm Ví dụ như: trong cơ chế của Acinetobacter baumannii đa đề kháng

carbapenem, ngoài cơ chế chính thuỷ phân carbapenem nhờ vào sự hoạt động của carbapenemase, khả năng biến đổi các PBP cũng liên quan tính đề kháng

carbapenem của Acinetobacter baumannii [2]

Hình 1.5 Các cơ chế đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii

(Nguồn: Asif M, Alvi I.A và Reham S.U, 2018 [40]) Beta-lactamase là một cơ chế quan trọng đối với khả năng đa đề kháng của

Acinetobacter baumannii, có bốn phân lớp beta-lactamase đã được xác định ở

vi khuẩn bao gồm: phân lớp A, B, C, D Trong đó các gen liên quan trực tiếp

hệ thống carbapenemase thuộc vào ba phân lớp A, B, D [53]

- Phân lớp A: mặc dù có khá nhiều các beta-lactamase thuộc phân lớp A

được phát hiện ở Acinetobacter baumannii như: TEM, SHV, CTX-M, GES,

SCO, VEB, CARB và KPC Tuy nhiên, chúng chỉ đóng một vai trò nhỏ trong

tính đề kháng beta-lactam của vi khuẩn này, đặc biệt là đối với khả năng đề kháng carbapenem [50], [53], [58]

- Phân lớp B: đây là phân lớp đóng vai trò quan trọng đối với khả năng

đề kháng beta-lactam của Acinetobacter baumannii nhờ vào phổ hoạt động

rộng, hoạt tính tiềm năng của carbapenemase và khả năng đề kháng với các chất ức chế Mặc dù, các metallo-beta lactamase không phải là carbapenemase

chiếm ưu thế ở Acinetobacter baumannii Tuy nhiên, các gen VIM, IMP và SIM

đã được phát hiện tham gia vào khả năng đề kháng ở mức độ cao với các kháng

D được phát hiện, 45 trong số đó thể hiện hoạt tính thuỷ phân carbapenem Các

gen OXA có thể định vị trên nhiễm sắc thể hoặc một plasmid Hiện nay có 9 phân nhóm chính của các OXA carbapenemase nhưng có 4 nhóm chiếm ưu thế là: OXA-23, OXA-40, OXA-51 và OXA-58 [50], [53], [58]

Ngoài beta-lactamase bơm đẩy thuốc cũng chính là cơ chế liên quan đến

tính đề kháng đối với nhiều nhóm kháng sinh khác nhau của Acinetobacter

baumannii như imipenem và tigecycline Hiện nay có bốn nhóm bơm đẩy chính

liên quan đến khả năng đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii bao

gồm siêu họ RND, siêu họ MFS, họ MATE và một số họ nhỏ SMR

Enzyme biến đổi aminoglycoside (AMEs) là cơ chế chính đối với các kháng sinh aminoglycoside [37] Cơ chế này liên quan đến ba nhóm enzyme gồm: acetyltransferase, adenylstransferase và phosphotransferase, các enzyme này

có khả năng thay đổi hoặc đảo vị trí các nguyên tố trong cấu trúc hoá học của

kháng sinh aminoglycoside Bên cạnh các cơ chế trên Acinetobacter baumannii

cũng được ghi nhận khả năng đề kháng kháng sinh với vai trò của các cơ chế khác như thay đổi tính thấm của màng và thay thế vị trí gắn thuốc [2], [4]

1.3.2 Tần suất xuất hiện các gen carbapenemase

Các gen carbapenemase thuộc phân lớp A chỉ đóng vai trò nhỏ trong khả năng đề kháng carbapenem nên các nghiên cứu về vấn đề này khá hạn chế Trong các nghiên cứu của Raghdaa và cộng sự năm 2018 tại Ai Cập đã đề cập

đến sự xuất hiện của các gen GES thuộc phân lớp A có tỷ lệ xuất hiện là 50%

Một số nghiên cứu cụ thể riêng với gen này tại Bỉ năm 2018 cho thấy sự xuất

hiện gen này là 7,2% trên các mẫu thu được [60]

Phân lớp B và D là hai phân lớp được quan tâm hơn do được đánh giá là

những gen chính trong cơ chế đề kháng carbapenem của Acinetobacter

baumannii Đây cũng là các gen thường được nghiên cứu, các gen phổ biến

trong nhóm B metallo-lactamase như: VIM, IMP và NDM và nhóm D là các gen thuộc họ OXA như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58 và OXA-24 Trong

nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự năm 2017, tác giả đã thực hiện

nghiên cứu và đã phát hiện sự có mặt của OXA-23, IMP và VIM lần lượt là 85,3%, 4,4% và không có mẫu nào có mặt của VIM [20] Tuy nhiên, nghiên

cứu về sự xuất hiện của các gen này chủ yếu là sử dụng kỹ thuật PCR đơn mồi

để phát hiện từng gen đề kháng kháng sinh và mất nhiều thời gian trong việc phát hiện từng gen

1.4 Các phương pháp nghiên cứu sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Acinetobacter baumannii

1.4.1 Phương pháp cổ điển

Thu nhận và nhận xét bệnh phẩm theo đại thể Tiến hành nhuộm Gram từ bệnh phẩm tìm thấy sự hiện diện của cầu trực khuẩn Gram âm, xếp thành dạng đơn, đôi, tụ thành đám

Nuôi cấy phân lập: thực hiện kỹ thuật cấy 3 chiều để cấy bệnh phẩm nghi ngờ lên các môi trường phân lập như: môi trường thạch máu, môi trường Mac-conkey, môi trường thạch chocolate ủ 37oC trong 18-24 giờ Sau đó tiến hành định danh vi khuẩn bằng các thử nghiệm sinh hoá như: catalase, oxidase, môi trường KIA, môi trường SIM, môi trường Ure, môi trường MR-VP, môi trường citrate… ủ 37oC trong 18-24 giờ và tiến hành định danh vi khuẩn

Khảo sát độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy kháng sinh trên thạch (phương pháp Kirby bauer): kháng sinh thấm trên đĩa giấy khuếch tán ra môi trường xung quanh trên mặt thạch sẽ

ức chế sự tăng sinh của vi khuẩn Đường kính vùng bị ức chế thể hiện độ nhạy của vi khuẩn đối với kháng sinh [2]

Phương pháp E-test là một phương pháp được thiết lập tốt để thử nghiệm

độ nhạy cảm của thuốc kháng khuẩn trong các phòng thí nghiệm vi sinh trên toàn thế giới E-test bao gồm một dải nồng độ (μg/mL) kháng sinh được xác định trước trên một dải nhựa có kích thước 5x57mm và được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh Khi dải Etest được đặt lên mặt thạch đã dàn vi khuẩn, kháng sinh ở các bậc nồng độ nhanh chóng khuếch tán trong thạch Sau khi nuôi cấy qua đêm, sẽ xuất hiện vùng ức chế hình elip đối xứng qua dải plastic Giá trị MIC được xác định trực tiếp tại điểm cắt của hình elip với dải Etest [2]

1.4.2 Phương pháp tự động bằng máy Vitek 2 compact

Máy Vitek 2 compact là hệ thống định danh và làm kháng sinh đồ tự động được tích hợp cơ sở dữ liệu những tính chất sinh học hoá học của vi sinh vật, với nguyên lý định danh vi sinh vật và phân tích độ nhạy cảm kháng sinh bằng cách theo dõi liên tục sự phát triển của vi sinh vật trong các giếng của card, tự động báo cáo kết quả khi xét nghiệm hoàn tất Bên cạnh đó còn cho phép cảnh báo và dò tìm cơ chế đề kháng kháng sinh của vi sinh vật [8]

Hình 1.6 Máy xét nghiệm tự động Vitek 2 compact

Định danh và làm kháng sinh đồ:

- Phương pháp định danh: dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh hoá của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu sắc trong tấm card

- Phương pháp thực hiện kháng sinh đồ: sử dụng nguyên lý đo độ đục

để theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trong các giếng trong card [8]

- Cả hai phương pháp đều thực hiện chung theo nguyên lý sự suy giảm cường độ sáng, hệ thống sử dụng các bước sóng 660nm, 568 nm, 428 nm để đo cường độ ánh sáng bị chặn lại khi ánh sáng đi qua các giếng Với phần mềm xử

lý chuyên dụng chứa cơ sở dữ liệu về định danh và kháng sinh đồ kiểm tra sự

ổn định của kết quả [8]

1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử

Kỹ thuật PCR: là phương pháp sinh học phân tử phổ biến hiện nay được sử dụng, được dùng để khuếch đại một đoạn ADN ngắn, đã xác định được một phần (có thể là gen đơn, hay một phần của gen) Trong kỹ thuật PCR, phối hợp khả năng lai đặc hiệu của các đoạn ADN có trình tự bổ sung với gen đích cùng khả năng kéo dài chuỗi của ADN polymerase để nhân bản các đoạn ADN khác nhau lên nhiều lần so với ban đầu ADN polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn-mồi (đặc hiệu), trong môi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn Phương pháp này có độ nhạy cao, chính xác, phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh trong khoản thời gian ngắn [22]

Kỹ thuật multiplex PCR: các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng tác nhân gây bệnh Multiplex PCR khuếch đại nhiều ADN đích trong cùng một mẫu trong cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi Kỹ thuật này dựa trên sự khuếch đại ADN trong vùng sao chép của vi sinh vật Đây

là vùng không mã hoá ADN có vị trí giữa các gen và có tính bảo thủ cao giúp phân biệt giữa các loài vi khuẩn [22]

- Phân loại phản ứng multiplex PCR: có 02 loại phản ứng [32]

+ Phản ứng multiplex PCR dùng một khuôn: phương pháp này sử dụng một loại khuôn, thường là ADN hệ gen, cùng với các cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược) để khuếch đại một số vùng gen khác nhau có chứa trong sợi khuôn [22]

+ Phản ứng multiplex PCR dùng nhiều khuôn: thực hiện một phản ứng với nhiều loại khuôn và nhiều cặp mồi Tuy nhiên sự có mặt của nhiều cặp mồi

có thể dẫn đến việc liên kết chéo giữa các mồi với nhau và có thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này với khuôn kia Do đó, thiết kế mồi rất quan trọng [22]

- Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR [22]:

+ Đối chứng nội kiểm (Internal control): vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR đơn lẻ là hiện tượng âm tính giả do sai về các thành phần hay chu trình nhiệt Multiplex PCR đã khắc phục hiện tượng âm tính giả do mỗi sản phẩm khuếch đại sẽ cung cấp một giá trị khác nhau

+ Hiệu quả cao: chi phí về hoá chất cũng như thời gian tiến hành multiplex PCR giảm đáng kể so với một phản ứng PCR đơn lẻ

+ Xác định được chất lượng khuôn: phản ứng multiplex PCR có thể xác định được chất lượng mẫu (khuôn) hiệu quả hơn phản ứng PCR thông thường

+ Xác định được hàm lượng khuôn: luỹ thừa các số lượng bản sao và tiêu chuẩn của phản ứng multiplex PCR có thể được sử dụng để ước lượng hàm lượng khuôn có trong mẫu

- Ứng dụng của multiplex PCR: có nhiều ứng dụng rộng rãi, có thể xác định sự có mặt cùng lúc nhiều tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn, đồng thời được sử dụng vào: xác định tác nhân gây bệnh, phát hiện đột biến, phát hiện đột biến mất đoạn trong gen… [22]

1.5 Tình hình các nghiên cứu về sự đề kháng kháng sinh của Acinetobacter

baumannii

1.5.1 Tình hình các nghiên cứu trên thế giới

Ở Mỹ: từ năm 2004 đến 2005, ở 76 trung tâm trên khắp nước Mỹ đã có

nhiều nghiên cứu báo cáo về mức độ nhạy cảm của Acinetobacter baumannii

đối với kháng sinh như sau: 10-50% đối với carbapenem, 35-40% đối với ceftazidim/cefepim, 10-30% đối với aminoglycoside [47]

Ở châu Âu: một số nghiên cứu cho thấy hơn một nửa số chủng

Acinetobacter baumannii phân lập được đề kháng với các loại kháng sinh được

giám sát (carbapenem, aminoglycoside, fluoroquinolone) ngay cả kháng sinh

nhóm polymyxin được báo cáo là còn nhạy cảm với Acinetobacter baumannii cũng đã xuất hiện các báo cáo về Acinetobacter baumannii kháng polymyxin ở

các quốc gia có tỷ lệ đề kháng carbapenem cao [47] Ví dụ như: tác giả Maida

Sisirak và cộng sự năm 2009 đã cho thấy tỷ lệ vi khuẩn Acinetobacter

baumannii đề kháng với các loại kháng sinh: ciprofloxacin là 85,8%,

gentamycin là 83,2%, carbapenem là 52,8% [55]

Ở Iran, nghiên cứu của tác giả Maryam Pourhajibagher năm 2016 cho thấy

tỷ lệ đề kháng đa kháng sinh ở Acinetobacter baumannii là 74,2%, với sự chú

ý khả năng đề kháng thuốc của Acinetobacter baumannii đối với imipenem là

54,5% [56]

Ở khu vực châu Á: tại một số nước như Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc,

Singapore cho thấy tình trạng nhiễm vi khuẩn Acinetobacter baumannii với tỷ

lệ đề kháng kháng sinh gia tăng từ 50-70%, trong đó nổi trội là nhóm carbapenem chiếm tỷ lệ đề kháng khá cao và ở mức báo động khi so với các tỷ

lệ đề kháng kháng sinh ở những nhóm kháng sinh khác [36], [54]

1.5.2 Tình hình các nghiên cứu ở Việt Nam

Tác giả Nguyễn Ánh Tuyết và cộng sự năm 2019 đã khảo sát tỷ lệ phân lập

và đề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii tại Bệnh viện Nhân dân Gia Định, thì Acinetobacter baumannii chiếm 81,6% trong các chủng được

phân lập Qua nghiên cứu đã cho thấy chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh cao với nhiều loại kháng sinh, nhất là ciprofloxacin chiếm 86,4%, cefepime chiếm 86%, imipenem chiếm 83%, nhưng vẫn chưa đề kháng với colistin [31]

Tác giả Lê Hoàng Phúc và cộng sự năm 2019 đã thực hiện nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi liên quan thở máy tại Bệnh viện Đa khoa Trung

Ương Cần Thơ, với chủng vi khuẩn Acinetobacter baumannii phân lập được

chiếm 53,5%, cùng với đó là sự đề kháng kháng sinh cao như: đề kháng kháng sinh với cefepime và ceftriaxone chiếm 94%, imipenem chiếm 87,2%, meropenem chiếm 90,5%, nhưng vẫn còn đáp ứng điều trị với colistin [15] Tác giả Phan Trần Xuân Quyên và cộng sự năm 2019 thực hiện nghiên cứu

về sự đề kháng kháng sinh và kết quả điều trị viêm phổi bệnh viện do vi khuẩn

Acinetobacter baumannii tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Cần Thơ, Acinetobacter baumannii chiếm khoảng 56,7% tổng số các chủng vi khuẩn

Gram âm gây bệnh, nổi bật là chủng này đề kháng kháng sinh hầu hết các loại kháng sinh như: 100% với cephalosporin, đề kháng 96,6% với cefepim, 98,3% với ciprofloxacin và chưa có ghi nhận sự đề kháng với colistin [19]

Tác giả Lâm Nguyệt Anh và cộng sự năm 2020 đã thực hiện nghiên cứu về đặc điểm vi khuẩn và tình hình đề kháng kháng sinh tại Bệnh viện Đa khoa Cà

Mau Trong số vi khuẩn phân lập được thì Acinetobacter baumannii đề kháng

kháng sinh cao với các kháng sinh thực nghiệm Nổi bật là tỷ lệ đề kháng kháng sinh với ampicillin chiếm 98%, đề kháng kháng sinh với cefepim chiếm 88%,

đề kháng kháng sinh với cefazolin 96%, đề kháng kháng sinh với Gentamicin 87%, nhưng chưa đề cập đến sự đề kháng kháng sinh colistin [1]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh án của bệnh nhân nhiễm vi khuẩn Acinetobacter baumannii và các chủng Acinetobacter baumannii được phân lập từ các bệnh phẩm đường hô hấp

tại Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Bệnh án của bệnh nhân nhiễm khuẩn được phân lập dương tính với chủng

Acinetobacter baumannii

Tất cả các chủng Acinetobacter baumannii được phân lập từ các bệnh phẩm

đường hô hấp (đàm, mủ, dịch rửa phế quản và dịch hút phế nang) của bệnh nhân được chẩn đoán viêm phổi bệnh viện (bao gồm cả viêm phổi có liên quan thở máy) tại khoa xét nghiệm Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ

Bệnh nhân có nhiều loại bệnh phẩm đường hô hấp phân lập được chủng

Acinetobacter baumannii thì chỉ thu một loại bệnh phẩm duy nhất trên mỗi

bệnh nhân

Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Các chủng vi khuẩn Acinetobacter baumannii được phân lập trên các bệnh

phẩm khác trên cùng một bệnh nhân ở những lần phân lập sau của đợt điều trị

Các chủng vi khuẩn Acinetobacter baumannii được tiến hành nuôi cấy và

được phân lập quá 72 giờ

Các mẫu bệnh phẩm không được thực hiện kháng sinh đồ hoặc có thực hiện kháng sinh đồ nhưng không đầy đủ các loại kháng sinh trong nghiên cứu

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại khoa xét nghiệm Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ và phòng xét nghiệm Sinh học phân tử trường Đại Học Y Dược Cần Thơ, từ tháng 4 năm 2021 đến tháng 4 năm 2022

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích

𝑍 !" ∝

" = 1,96, với độ tin cậy 95%

d = 0,08: là sai số lựa chọn

p1 = 0,33, p là tỷ lệ Acinetobacter baumannii đề kháng kháng sinh

tại Bệnh viện phổi Trung Ương của tác giả Lưu Thị Ngọc Hân năm 2019 [3]

n1: số mẫu phân lập được Acinetobacter baumannii Theo công

thức tính cỡ mẫu n1 = 132,7

p2 = 0,9, p là tỷ lệ Acinetobacter baumannii mang gen mã hoá

carbapenemase tại Bệnh viện phổi Trung Ương của tác giả Lưu Thị Ngọc Hân năm 2019 [3]

n2: số mẫu phân lập được Acinetobacter baumannii Theo công

thức tính cỡ mẫu n2 = 54

Để tối ưu cho nghiên cứu cỡ mẫu nghiên cứu sẽ được chọn là n = 133

Thực tế, chúng tôi đã thu thập được 135 chủng vi khuẩn Acinetobacter

baumannii phù hợp với tiêu chuẩn chọn mẫu

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu

Chọn mẫu thuận tiện cho đến khi phân lập đủ cỡ mẫu phù hợp dựa vào tiêu chuẩn chọn mẫu và tiêu chuẩn loại trừ

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

2.2.4.1 Khảo sát đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu

Chủng Acinetobacter baumannii được phân lập từ bệnh phẩm đường hô

hấp trên các bệnh nhân với các đặc điểm như sau:

- Năm sinh của bệnh nhân ghi trên bệnh phẩm: được chia 3 nhóm tuổi là dưới 40, từ 40 đến 60 và trên 60 tuổi

- Về giới tính của bệnh nhân ghi trên bệnh phẩm: chia làm 2 nhóm là nam và nữ

- Nghề nghiệp của bệnh nhân ghi trên bệnh phẩm: chia làm 4 nhóm là công nhân viên, nông dân, buôn bán, hưu trí

- Các loại bệnh phẩm bao gồm 4 loại: đàm, mủ, dịch rửa phế quản và dịch hút phế nang

- Về khoa phòng gồm: ICU, nội tổng hợp, nội tiết và một số khoa phòng khác

2.2.4.2 Xác định tỷ lệ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii phân lập từ bệnh phẩm đường hô hấp

Một số định nghĩa biến về sự đề kháng kháng sinh:

- Kháng (R-Resistant) là kiểu đề kháng mà kháng sinh ở liều thông thường không có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hoặc được khẳng định qua nồng độ ức chế đường kính vùng ức chế nằm trong giới hạn của cơ chế đề kháng, hoặc thực tế kháng sinh không có hiệu quả trong điều trị

- Nhạy cảm (S-Susceptible) là khi vi khuẩn bị ức chế bởi nồng độ thông thường đạt được của một kháng sinh nào đó khi dùng với liều để điều trị

- Kháng trung gian (I-Intermediate) là kiểu đề kháng trong đó với những nồng độ ức chế tối thiểu của một kháng sinh thường đạt được trong máu và tổ chức cho đáp ứng thấp hơn so với kiểu nhạy cảm Kháng trung gian phản ánh hiệu quả lâm sàng tại các cơ quan, bộ phận mà thuốc phân bố hoặc kết quả điều trị đạt được khi sử dụng kháng sinh đó với liều cao hơn liều thông thường Đối với kiểu đề kháng này cần thận trọng khi đánh giá ranh giới mức độ đề kháng trong việc nhận định kết quả [2]

Thực hiện kháng sinh đồ của vi khuẩn Acinetobacter baumannii trên máy

xét nghiệm vi sinh tự động Vitek 2 compact tại khoa xét nghiệm, Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ nhằm xác định:

- Tỷ lệ đề kháng kháng sinh chung: xác định tỷ lệ đề kháng, đề kháng

trung gian và nhạy cảm kháng sinh của Acinetobacter baumannii với các loại

kháng sinh thực nghiệm (Bảng 2.2)

- Tỷ lệ đề kháng kháng sinh carbapenem của Acinetobacter baumannii:

các loại kháng sinh carbapenem thử nghiệm gồm: imipenem (IPM), ertapenem (EPT), meropenem (MEM) Nhạy cảm với carbapenem: các chủng vi khuẩn

Acinetobacter baumannii nhạy cảm hoặc đề kháng với 1 loại carbapenem Đề

kháng với carbapenem: tất cả các chủng Acinetobacter baumannii đề kháng với

cả 3 loại carbapenem thử nghiệm

- Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của chủng Acinetobacter baumannii theo

loại bệnh phẩm: đàm, mủ, dịch rửa phế quản và dịch hút phế nang

- Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của chủng Acinetobacter baumannii theo

các khoa, phòng lâm sàng: ICU, khoa nhiễm, nội nhiễm, ngoại tổng quát, nội

hô hấp, khoa khám bệnh…

- Tỷ lệ đề kháng đa kháng sinh của chủng Acinetobacter baumannii: các

mức độ đề kháng phân ra như: đa đề kháng (MDR-Multidrug resistance) là tác nhân được phân lập đề kháng với ít nhất một kháng sinh ở ít nhất ba nhóm

kháng sinh; siêu đề kháng (Extensive-drug resistance) là những chủng vi khuẩn kháng với tất cả trừ một hoặc hai nhóm kháng sinh còn tác dụng; đề kháng hoàn toàn (PDR-Pandrug resistance) là những chủng vi khuẩn kháng với tất cả các nhóm kháng sinh hiện có [6]

- Tỷ lệ đề kháng đa kháng sinh của chủng Acinetobacter baumannii theo

một số đặc điểm như: nhóm tuổi, giới tính, loại bệnh phẩm đường hô hấp và các khoa phòng lâm sàng

2.2.4.3 Xác định tỷ lệ xuất hiện các gen đề kháng kháng sinh carbapenem của Acinetobacter baumannii bằng phương pháp multiplex PCR

- Tần suất xuất hiện các gen (OXA-23, OXA-51 và IMP) đề kháng kháng

sinh carbapenem

- Phân bố sự có mặt của các tổ hợp gen (đơn gen 23, đơn gen

51, tổng hợp 2 gen 23+51 hoặc 51+IMP và tổ hợp 3 gen 23+OXA-51+IMP) đề kháng kháng sinh carbapenem của vi khuẩn Acinetobacter baumannii

OXA Tỷ lệ xuất hiện các gen và các tổ hợp gen đề kháng kháng sinh carbapenem theo loại bệnh phẩm

- Tỷ lệ xuất hiện các gen và tổ hợp gen đề kháng kháng sinh carbapenem theo các khoa, phòng lâm sàng

2.2.4.4 Tìm hiểu mối liên quan của các gen mã hoá carbapenemase và kết quả kháng sinh đồ của Acinetobacter baumannii

- Mối liên quan giữa tỷ lệ các gen mã hoá carbapenemase ở hai nhóm nhạy cảm và đề kháng carbapenem theo kết quả kháng sinh đồ

- Mối liên quan giữa kiểu phân bố các tổ hợp gen mã hoá carbapenemase

ở hai nhóm nhạy cảm và đề kháng carbapenem theo kết quả kháng sinh đồ

- Mối liên quan giữa tỷ lệ xuất hiện các gen với tỷ lệ đa đề kháng kháng

sinh của Acinetobacter baumannii

- So sánh kết quả về sự có mặt của các gen mã hoá carbapenemase và khả năng đề kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ

2.2.5 Phương pháp thu thập số liệu

2.2.5.1 Phương tiện nghiên cứu

Dụng cụ, thiết bị cần thiết: máy định danh và kháng sinh đồ tự động Vitek

2 Compact, máy vortex, máy đo độ đục, máy autoclave, tủ ủ, tủ an toàn sinh học cấp 2, kính hiển vi, bình nến, đèn cồn, khuyên cấy, tăm bông, type nhựa cho máy định danh và làm kháng sinh đồ, găng tay, …

Sinh phẩm và hoá chất: môi trường thạch máu, thạch Mac-conkey, thạch MHA, môi trường tăng sinh, hoá chất nhuộm Gram, nước muối sinh lý, Latex, dung dịch H2O2, Card hoá chất định danh và làm kháng sinh đồ thực hiện trên máy Vitek 2 Compact

2.2.5.2 Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu

Lấy mẫu bệnh phẩm:

- Mẫu đàm: trước hết cho bệnh nhân súc miệng sạch, không súc miệng bằng nước súc miệng có chất sát trùng, hướng dẫn bệnh nhân hít thở ba thì: hít sâu-thở chậm, hít sâu-thở mạnh, hít sâu-ho Trường hợp bệnh nhân không thể

tự ho được thì phải tiến hành hút đàm Bệnh nhân khạc vào lọ vô trùng rộng miệng có nắp chặt, tránh lẫn nước bọt Bệnh phẩm được nhận định tốt phải đáp ứng được những điều kiện sau: <10 tế bào vẩy, ≥25 bạch cầu đa nhân trung tính, đọc ở vật kính dầu X100 để tiến hành đánh giá mẫu lấy đủ tiêu chuẩn [8]

- Mẫu mủ: được thực hiện bởi các bác sĩ lâm sàng trong khi tiến hành các thủ thuật chọc hút hoặc lấy mẫu Mẫu mủ được thu thập như sau: dùng tăm bông vô trùng lấy mẫu để quệt lấy mủ, chất nghi ngờ là mủ hoặc chất nhầy; hay

có thể lấy mủ cho vào lọ lấy bệnh phẩm vô trùng, hay tube Eppendorf biopure rồi gửi ngay đến phòng xét nghiệm yêu cầu thực hiện cấy ngay, cho tăm bông

đã quệt mủ vào môi trường chuyên chở Stuart-Amies [8]

- Mẫu dịch (bao gồm dịch hút phế nang và dịch rửa phế quản): được thực hiện bởi các kỹ thuật viên/điều dưỡng có kinh nghiệm, mẫu sau khi được lấy

sẽ cho vào lọ vô trùng và vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm và yêu cầu được tiến hành nuôi cấy

Nuôi cấy vi khuẩn:

- Đàm: bệnh phẩm được cấy trên các môi trường thạch máu, ủ bình nến

CO2 (5-10%) ở 37oC trong 24 giờ Cần làm loãng bệnh phẩm bằng L-Cystein hoặc sputolysin (có tác dụng giải phóng vi khuẩn khỏi khối đặc) Tiến hành pha loãng 10 lần trong nước muối sinh lý trước khi cấy, áp dụng phương pháp cấy đếm [8] Đọc kết quả và định lượng các loại vi khuẩn mọc như sau:

N-Acetyl-Bảng 2.1 Cách đọc kết quả định lượng các loại vi khuẩn trong mẫu đàm

Hộp thạch Mẫu đàm

pha loãng

Vòng cấy định lượng

Thể tích đàm được cấy

Số vi khuẩn được định lượng

- Mủ và chất dịch: bệnh phẩm được tiến hành cấy theo phương pháp vạch

3 chiều hoặc theo zic-zac vào môi trường tối thiểu là: BA, MC

Xác định tính chất vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram:

- Mục đích: thực hiện kỹ thuật nhuộm Gram để phân loại vi khuẩn dựa vào hình thể, cách sắp xếp, đặc tính bắt màu của vi sinh vật

- Nguyên tắc: chất rượu sẽ đẩy được phức hợp tím Crystal Violet và

iodine của vi khuẩn Gram âm

để nghiêng lam kính cho khô

+ Phủ dung dịch Lugol lên hết phết nhuộm để yên trong 2 phút Rửa sạch dưới vòi nước chảy nhẹ

+ Tẩy màu bằng cách nhỏ lên góc trên của lam kính nhuộm dung dịch ethanol 95% cho đến khi lam kính sạch màu, rửa sạch cồn dưới vòi nước nhẹ

+ Phủ dung dịch Fuchsin trong 1 phút Rửa sạch dung dịch thừa dưới vòi nước nhẹ

+ Thấm khô lam kính Quan sát qua kính hiển vi, với vật kính dầu X100

để quan sát hình thái, cách sắp xếp và tính chất bắt màu Kết quả: cầu trực khuẩn, Gram âm bắt màu đỏ/hồng nhạt

Hình 2.1 Acinetobacter baumannii trên phết nhuộm Gram

(Nguồn: Atlas hình thể vi khuẩn và khuẩn lạc, 2009 [17])

Định danh và thực hiện kháng sinh đồ: bằng thử nghiệm catalase, thử

nghiệm oxidase, máy xét nghiệm tự động Vitek 2 Compact

Dương tính: xuất hiện phức hợp màu tím/xanh sau 10-30 giây

Âm tính: không thay đổi màu

Hình 2.2 Diễn giải kết quả thử nghiệm oxidase

(Nguồn: Atlas hình thể vi khuẩn và khuẩn lạc, 2009 [17])

H2O2 HCatalase 2O + O2