Khảo sát và so sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm của cao vỏ hột với nhân hột xoài (mangifera indica l )

Tuy nhiên, các nghiên cứu được thực hiện trên hột Xoài nói chung chưa đi sâu vào xác định rõ công dụng đến từ vỏ hột hay nhân hột cũng như chưa cho so sánh được các hoạt tính của bộ phận

HÀ CAO THIỆN

KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG VIÊM

CỦA CAO VỎ HỘT VỚI NHÂN HỘT XOÀI (MANGIFERA INDICA L.)

Chuyên ngành: Dược lý – Dược lâm sàng

Mã số: 20820510014

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS ĐẶNG DUY KHÁNH

TS NGUYỄN NGỌC NHÃ THẢO

Cần Thơ – 2022

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các sơ đồ hình vẽ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan chung về cây Xoài và hột Xoài 3

1.2 Tổng quan chung về hột Xoài 7

1.3 Tổng quan về các mô hình nghiên cứu kháng khuẩn và kháng viêm 10

1.4 Tổng quan về các công trình nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn và kháng viêm của hột Xoài 17

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu và vật liệu nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3 Đạo đức trong nghiên cứu 32

Chương 3: KẾT QUẢ 33

3.1 Kết quả nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao vỏ hột và nhân hột Xoài 33

3.2 Kết quả nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng viêm của cao vỏ hột và nhân hột Xoài 41

Chương 4: BÀN LUẬN 48

4.1 Tác dụng kháng khuẩn 48

4.2 Hiệu quả kháng viêm 55

KẾT LUẬN 62

PHỤ LỤC

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào

Tác giả luận văn

Hà Cao Thiện

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Ngọc Nhã Thảo,

TS Đặng Duy Khánh là những người thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện luận văn này Các thầy cô đã luôn tận tình chỉ bảo, động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn vừa qua Sự thành công của luận văn nghiên cứu này là kết quả của sự nhiệt tình hướng dẫn của các thầy cô đối với em Nếu không có sự hướng dẫn giúp đỡ đó em không thể hoàn thành được luận văn này

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô của bộ môn Dược

lý -Dược lâm sàng nói riêng và các thầy cô của khoa Dược, các thầy cô phòng sau đại học tại Trường Đại học Y Dược Cần Thơ nói chung đã hết lòng hướng dẫn giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình đi học

Tên tác giả luận văn

Hà Cao Thiện

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

DMSO Dimethyl Sulfoxide

E coli Escherichia coli

P acnes Propionibacterium acnes

S aureus Staphylococcus aureus

S mutans Streptococcus mutans

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất dùng trong nghiên cứu ….… 22 Bảng 2.2 Danh sách vi khuẩn dùng trong nghiên cứu….… 23 Bảng 2.3 Danh sách thiết bị dùng trong nghiên cứ….… 23 Bảng 2.4 Các cao thuốc và thuốc dùng trong thử nghiệm kháng viêm …… 29

Bảng 3.1 Định tính khả năng kháng Propionibacterium acnes, Staphylococcus

aureus và Escherichia coli 33

Bảng 3.2 MIC của cao chiết từ vỏ hột và nhân hột Xoài trên 1 số chủng vi

Biểu đồ 3.1 Độ sưng phù bàn chân chuột ở lô sinh lí, lô chứng bệnh và lô

đối chứng (diclofenac) 44

Biểu đồ 3.2 Độ sưng phù bàn chân chuột ở lô sinh lí, lô chứng bệnh, lô đối chứng (diclofenac) với vỏ hột Xoài liều 500mg/kg và 750mg/kg 45

Biểu đồ 3.3 Độ sưng phù bàn chân chuột ở lô sinh lí, lô chứng bệnh, lô đối chứng (diclofenac) với nhân hột Xoài liều 500mg/kg và 750mg/kg 46

Biểu đồ 3.4 Độ sưng phù bàn chân chuột ở lô sinh lí, lô chứng bệnh, lô đối chứng (diclofenac) với nhân hột Xoài liều 500mg/kg và vỏ hột Xoài liều 500mg/kg 47

Biểu đồ 3.5 Độ sưng phù bàn chân chuột ở lô sinh lí, lô chứng bệnh, lô đối chứng (diclofenac) với nhân hột Xoài liều 750mg/kg và vỏ hột Xoài liều 750mg/kg 48

Hình 1.1 Cây Xoài (Mangifera indica L) 3

Hình 1.2 Quả Xoài cát hòa lộc 4

Hình 1.3 Hột Xoài cát hòa lộc 7

Hình 2.1 Máy đo độ phù chân chuột 37140 Plethysmometer 24

Hình 2.2 Cách đọc kết quả kháng khuẩn 26

Hình 2.3 Chân chuột sau khi được tiêm carragreenan 31

Hình 3.1 Định tính khả năng kháng Propionibacterium acnes 34

Hình 3.2 Định tính khả năng kháng Staphylococcus aureus 35

Hình 3.3 Định tính khả năng kháng Escherichia coli 36

Hình 3.4 Kết quả MIC của mẫu cao nhân hột (NH) trên vi khuẩn Propionibacterium acnes 37

Hình 3.5 Kết quả MIC của mẫu cao nhân hột (NH) trên vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia coli 38

Hình 3.7 Kết quả MIC của mẫu cao vỏ hột (VH) trên vi khuẩn Staphylococcus

aureus và trên vi khuẩn Escherichia coli 40

MỞ ĐẦU

Xoài không chỉ là một loại nông sản mang năng xuất lớn, đem lại hiệu quả kinh tế cao còn là một loại trái cây giàu chất dinh dưỡng rất tốt cho sức khỏe Ngoài quả, thì các bộ phận khác của Xoài cũng được tận dụng để làm dược liệu để chữa các bệnh thông thường rất hiệu quả đã được chứng minh qua nhiều công trình nghiên cứu Hằng năm, nguồn Xoài tiêu thụ là rất lớn nên lượng phế phẩm thải ra môi trường cũng rất đáng kể đặc biệt là hột Xoài Một

bộ phận trước đây được cho là không có giá trị Tuy nhiên, ít ai biết rằng hột Xoài cũng có những tác dụng riêng mang lại lợi ích cho sức khỏe mà nếu tận dụng được những nguồn phế phẩm này để tạo ra các chế phẩm có giá trị thì sẽ góp phần hạn chế lượng rác thải ra môi trường cũng như mang lại thêm những lợi ích kinh tế mới cho người sản xuất

Cây Xoài có tên khoa học là Mangifera indica L (M indica) thuộc họ

Đào lộn hột (Anacardiaceae) Theo Đông y, quả Xoài dùng để trị ho, tiêu hóa không bình thường, vỏ quả dùng trị kiết lỵ, lá dùng để trị các bệnh đường hô hấp như ho, viêm phế quản mạn tính hay cấp tính, dùng ngoài trị viêm da, vỏ thân dùng trị ho, đau sưng họng và đau răng; nhựa từ vỏ dùng trị kiết lỵ, bệnh ngoài da, bạch đới, kinh nguyệt quá nhiều [3], [10], [19]

Hột Xoài chứa rất nhiều thành phần hóa học như protein, phosphat, carbohydrat, magie, natri, canxi và các thành phần sinh học khác axit béo, phenolic,…[3], [42] Một số công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy hột Xoài có tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn [22], [38], [45] Hột Xoài có hai bộ phận là nhân hột và vỏ hột Tuy nhiên, các nghiên cứu được thực hiện trên hột Xoài nói chung chưa đi sâu vào xác định rõ công dụng đến

từ vỏ hột hay nhân hột cũng như chưa cho so sánh được các hoạt tính của bộ phận nào mạnh hơn Riêng ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu được

công bố về tác dụng của hột Xoài Vì vậy, nghiên cứu “Khảo sát và so sánh

hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm của cao vỏ hột với nhân hột Xoài (Mangifera indica L.)” được đặt ra với 2 mục tiêu:

- Khảo sát và so sánh hoạt tính kháng khuẩn của cao vỏ hột và nhân hột Xoài trên một số chủng vi khuẩn

- Khảo sát và so sánh hoạt tính kháng viêm của cao vỏ hột và nhân hột Xoài bằng phương pháp gây phù bàn chân chuột

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chung về cây Xoài và hột Xoài

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Xoài

Hình 1.1 Cây Xoài (Mangifera indica L.)

Tên khoa học: Mangifera indica L

Tên khác: Mãng quả, mác moang (Tày)

Tên nước ngoài: Mango tree, cuckoo’sjoy, spring tree, mango (Anh), arbre de mango manguier, mangot, Mangue, manguier (Pháp), manga, mangueira (Bồ Đào Nha), manja (Hà Lan), mangou, mangoro (Châu phi)

Họ: Đào lộn hột (Anacardiaceae) [2], [29], [30]

1.1.2 Mô tả

Cây to cao 15-20m Lá nguyên, mọc so le, đơn, thuôn dài, nhẵn, bóng, dài 15-30cm, rộng 5-7cm Hoa nhỏ, màu vàng nhột, thành chùy ở đầu cành Quả hạch khá to, hạch dẹt, hình thận, cứng trên có những thớ sợi khi nẩy mầm thì hơi mở ra Hột có lớp vỏ mỏng, màu nâu, không phối nhũ, lá mầm không đều [14]

1.1.3 Một số loài

Trên thế giới, Xoài có khoảng 50 loài, ở nước ta có khoảng 11 loài

Một số loài: Mangifera cambodiana (Xoài cơm), Mangifera foatida (Xoài hôi), Mangifera indica (Xoài cát hòa lộc), Mangifera mekongensis (Xoài thanh ca), Mangifera dongnaiensis (Xoài đồng nai), Mangifera longipes (Xoài cuốn dài), Mangifera duperreana (Xoài lửa), Mangifera flavan (Xoài vàng),

Mangifera altissima, Mangifera caesia, Mangifera applanata, Mangifera casturi [2], [29], [30]

Hình 1.2 Quả Xoài cát hòa lộc

1.1.4 Thành phần hóa học của cây Xoài

Xoài chứa nhiều hợp chất hóa học khác nhau đặc biệt là polyphenolic, flavonoid, triterpenoids Trong đó, mangiferin một xanthon glycoside là thành phần chính có trong hầu hết các bộ phận của cây nhiều nhất trong thân vỏ 5-7%, lá 1-3% tuỳ chủng loại

- Lá Xoài: chứa mangiferin, taraxarol, friedelin, tannin, lupeol -  -

sitosterol, isomangiferin, homomangiferin, acid gallic , kaempferol, estragol, 3 – glucoside astrageline, quercetin, isoquercetin

- Vỏ thân Xoài: chứa các chất mangiferin, homomangiferin,

cycloartenol, cycloart - 24 – ene – 3 -  - 26 – diol, dammarendiol, 3 –

cetodammar 24 – E – ene 20S - 26 diol, α amyrin, acid mangiferolic, 14 - methaethyl mangiferoli , acid ambolic , acid friedelin, friedelan – 3-  - ol, acid

ellagic , acid protocatechuic

- Hoa Xoài khô chứ 15% tanin, (acid galotanic ), acid galic, chủ yếu chứa

tinh dầu gồm 2 octen, α,  pinen, α phelandren limonen, dipenten, nerol,

geraniol, nerylk acetat, citronela, mangiferol và sesquiterpen ceton

- Quả Xoài: chứa các acid như mangiferonic, isomangiferolic, acid

ambonic và acid ambonic, các acid polyphenol: m.digalic, ellagic, quercetin; isoquercetin, mangiferin, violaxanthin, các đường glucose, galactose và rhamnose; các vitamin B1, B2 và C,  - caroten Quả chưa chín có cis ocimen,

myrcen, glucan, arabinan và galacturonan

- Hột Xoài: có chứa chất béo gồm acid myristic, phosphotidic,

phosphatidylinositol; phosphatidyl glycerol, phosphatidyl ethanol amin, mesoinositol và mangiferol, acid mangiferic,  - glucogallin, gallotannin

- Các hợp chất manglesisterol, acid mangfarnasoic, mangecoumarin, cùng với n – tetracosan, n - triacontan, mangiferolic acid methyl ester cũng được phân lập từ vỏ quả Xoài [2], [27], [35]

1.1.5 Tác dụng chữa bệnh từ Xoài

Chữa đau răng: Lấy một miếng vỏ thân tươi khoảng 30-40g, cạo bỏ vỏ

ngoài, rồi thái mỏng giã nát ép với nước, thêm ít muối rồi ngậm trong 10 phút, nhổ nước ngày 4 - 5 lần Nếu dùng khô, lấy 20g sắc với 400mL, giữ sôi trong nửa giờ, cô còn 100mL Thêm ít muối ngậm mỗi lần 20mL trong 10 phút, rồi

nhổ đi Ngày 3 - 4 lần dùng nhiều ngày Vỏ Xoài khô 3 phần, quả me một phần,

quả bồ kết một phần Tất cả sấy khô, tán nhỏ Cho bột vào chỗ răng đau, ngậm

10 phút rồi nhổ đi, ngày 3 - 4 lần

Trị giun: Nhân hột Xoài phối hợp với hột chanh, mỗi vị 5-20g, sắc uống

vào sáng sớm và lúc đói Nhân hột Xoài phơi khô tán nhuyễn thành bột, mỗi lần uống 1,5-2g

Chữa kiết lị tiêu chảy: Lá tươi, phơi trong râm đến khô, nghiền thành bọt

mịn, uống mỗi ngày 1 - 2g, ngày uống 2 - 3 lần Nhân hột Xoài 5 - 10g giã nát

ép lấy nước, thêm ít muối vào uống ngày 2 - 3 lần dùng 3 ngày Nhân hột Xoài

15 - 20g, sắc kĩ nước làm chia làm 3 lần uống trong ngày

Chữa xuất huyết tử cung, khái huyết, chảy máu ruột, trĩ: Vỏ quả Xoài

chín, nấu thành cao lỏng 2 : 1 cứ cách 1 - 2 giờ lại uống một thìa cà phê

Trị ngứa lỡ ngoài da, âm đạo: Vỏ thân sắc đặc ngâm rửa Có thể dùng

nhừ Xoài hoà với nước chanh rồi bôi

Rửa vết thương: Lá Xoài tươi 200g, cho vào 1 lít nước, đun sôi 10 phút,

dùng để rửa vết thương

Ho, viêm họng: Lá Xoài tươi 200g, cho vào 1 lít nước, đun nhỏ lửa cho

sôi 15 phút, sau đó bắc xuống, dùng khăn trùm kín đầu để xông Khi xông nhớ

há miệng để đưa hơi vào cổ họng Làm mỗi ngày 1 lần [2]

1.2 Tổng quan chung về hột Xoài

1.2.1 Thông tin về hột Xoài

Hột Xoài là một hột đơn lớn, gồm có một lớp vỏ cứng bao quanh nhân, phẳng, màu trắng kem và có nhiều xơ Nó sở hữu một nguồn dinh dưỡng và chất chống oxy hóa Những hột giống này được làm sạch hoàn toàn và sấy khô

Hột Xoài chứa các thành phần dinh dưỡng như protein, chất xơ, carbohydrate, phốt pho, magiê, natri và canxi Chúng cũng có một số hoạt chất sinh học như phenolic, axit béo không bão hòa và các hợp chất chống oxy hóa Hột Xoài cũng chứa có một số hoạt chất sinh học, phenolic, axit béo không bão hòa và các hợp chất chống oxy hóa Chúng còn có thể ăn được nhưng chỉ khi

đã chín, hột có thể chế biến thành dạng bột hoặc dầu hoặc bơ

Hình 1.3 Hột Xoài cát hòa lộc

1.2.2 Tác dụng của hột Xoài đối với sức khỏe

1.2.2.1 Dinh dưỡng trong hột Xoài

Hột Xoài là một hột đơn lớn, gồm phần vỏ cứng bao quanh nhân Hột Xoài thường có màu trắng kem, phẳng và có nhiều xơ Bên trong hột Xoài chứa một nguồn dinh dưỡng dồi dào và chất chống oxy hóa tuyệt vời

Các thành phần dinh dưỡng được tìm thấy trong hột Xoài bao gồm: Protein, Chất xơ, Carbohydrate, Photpho, Magie, Natri, Canxi

Ngoài ra, hột Xoài còn chứa một số hoạt chất sinh học như phenolic, axit béo không bão hòa và các hợp chất chống oxy hóa

Chính vì thế, dù không phải là cách phổ biến để giúp tăng cường sức khỏe, nhưng hột Xoài có thể mang đến nhiều lợi ích sức khỏe khi bạn sử dụng chúng thường xuyên [17]

1.2.2.2 Tác dụng của hột Xoài

Nhờ trong hột Xoài chứa khá nhiều dưỡng chất nên khi sử dụng hột Xoài

có thể giúp bạn nhận được một số lợi ích sức khỏe sau đây:

Bảo vệ răng miệng: Hột Xoài sấy khô có thể trở thành loại kem đánh răng tốt nhất, bởi nó có thể giúp làm chắc răng, chống viêm nướu và chữa bệnh hôi miệng Đồng thời bột hột Xoài còn giúp bảo vệ răng miệng của bạn luôn sạch khỏe

Tiêu chảy: Trong y học cổ truyền Ấn Độ, hột Xoài được ghi nhận có đặc tính chống tiêu chảy hiệu quả Chiết xuất từ hột Xoài có thể giúp kháng khuẩn,

ức chế sự phát triển của vi khuẩn tụ cầu vàng - nhân gây tiêu chảy

Giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch: Tiêu thụ hột Xoài giúp giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh về tim mạch và cao huyết áp Hoạt Xoài có khả năng làm giảm chỉ số cholesterol xấu và ổn định chỉ số cholesterol nói chung Nguyên nhân là bởi hột Xoài có chứa chất chống oxy hóa polyphenol có thể cải thiện vấn đề về tim và huyết áp cao

Tốt cho bệnh tiểu đường: Chiết xuất từ hột Xoài có thể giúp kiểm soát lượng đường trong máu, giúp thay đổi enzym của ruột và gan để giảm sự hấp thu glucose, phù hợp với người bị bệnh tiểu đường hoặc những người có nguy

cơ mắc bệnh này

Tốt cho hệ tiêu hóa: Với hoạt động chống oxy hóa polyphenol cao, hột Xoài có khả năng giảm đáng kể mức cholesterol trong máu

Kháng viêm: Trong hột Xoài có chứa hợp chất phenolic, đây là hợp chất

có thể giúp kháng viêm hiệu quả đối với bệnh nhân mắc bệnh gout và các bệnh mãn tính và bệnh về đường tiêu hóa

Giảm cân: Chiết xuất từ nhân của hột Xoài có thể giúp cải thiện khả năng hấp thu glucose và chất béo trong quá trình tiêu hóa Do đó, việc uống đồ uống

có chiết xuất từ hột Xoài có thể sẽ giúp bạn giảm cân nặng

Giảm rụng tóc: Một trong những tác dụng của hột Xoài là thúc đẩy quá trình mọc tóc, đồng thời cũng có thể loại bỏ các vấn đề của da dầu như viêm và gàu

Chăm sóc da: Với đặc tính chống oxy hóa cao, hột Xoài có tác dụng chăm sóc da, làm chậm quá trình lão hóa, giảm sẹo mụn, đồi mồi và nếp nhăn

Ngừa ung thư: Trong hột Xoài chứa hàm lượng chất chống oxy hóa cao

và chất phytochemical, axit gallic, những hợp chất này có khả năng làm giảm nguy cơ mắc một số loại ung thư Một nghiên cứu đã chứng minh, chiết xuất ethanol từ hột Xoài có tác dụng chống tăng sinh đối với tế bào ung thư và kết quả khả quan trong việc giảm nguy cơ ung thư vú

Như vậy, không chỉ quả Xoài, lá Xoài, noãn Xoài, giờ đây cả hột Xoài cũng có rất nhiều công dụng tốt cho sức khỏe Để dùng hột Xoài bạn có thể chế biến chúng thành dạng bột, dầu hoặc bơ để sử dụng [17]

1.2.3 Tìm hiểu chung về điều chế cao đặc

Cao thuốc là các chế phẩm được điều chế bằng cách cô đặc, sấy khô các

dịch chiết thảo mộc đến các thể chất nhất định (lỏng, đặc, khô) Cao đặc là khối

đặc quánh, hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20% Tuỳ theo bản chất của dược liệu và dung môi mà người ta chọn phương pháp chiết xuất thích hợp Với dung môi là nước có thể áp dụng phương pháp ngâm lạnh, thường ngâm phân đoạn với lượng dung môi 8 - 12 lần so với lượng dược liệu Sau đó tiến hành cô đặc ở áp suất giảm đến thể chất quy định

Để điều chế cao đặc vỏ hột và nhân hột thì nguyên liệu khô được chiết kiệt bằng phương pháp ngâm bởi các dung môi ethanol 96% Dịch chiết ethanol 96%, được loại tạp chlorophyll bằng than hoạt Cô bay hơi dung môi các dịch

chiết thu được đến thể cao đặc

Cao đặc sau khi điều chế sẽ được đánh giá đạt các tiêu chuẩn sản phẩm quy định đối với cao thuốc theo quy định chung của dược điển Việt Nam V và tiêu chuẩn riêng bao gồm cảm quan, mất khối lượng do làm khô, cắn không tan trong nước, định tính, giới hạn nhiễm khuẩn, định lượng và bảo quản [4]

1.3 Tổng quan về các mô hình nghiên cứu kháng khuẩn và kháng viêm

1.3.1 Tổng quan về một số mô hình kháng khuẩn

Phương pháp khuyếch tán trên thạch

Phương pháp đặt giấy

Đặt đĩa giấy có tẩm thuốc lên đĩa thạch đã trải một lớp huyền dịch vi khuẩn, thường áp dụng với kháng sinh có tác dụng tốt trên vi khuẩn (còn gọi là phương pháp kháng sinh đồ, là thử nghiệm đi trước tìm Minimum inhibitory concentration - MIC) Phương pháp này có nhược điểm là khó áp dụng trên những hóa chất khó khuyếch tán trên bản thạch vì sẽ làm sai lệch kết quả và khó tính toán

Phương pháp đục lỗ

Tương tự như trên nhưng thay vì dùng đĩa giấy ta đục lỗ trên thạch và đổ thuốc vào lỗ đó Với phương pháp này cần phải xác định dung dịch đệm và môi trường để khuếch tán Phương pháp này đòi hỏi kinh nghiệm và thời gian, hơn nữa cũng chưa có tiêu chuẩn đánh giá đường kính vòng vô khuẩn Do đó việc kết luận chỉ mang tính chất tương đối

Phương pháp ống trụ

Ống trụ nhỏ có thuốc ở trong đặt lên thạch đã trải một lớp huyền dịch nấm Tương tự như các phương pháp trên nếu thuốc có tác dụng sẽ tạo thành vòng ức chế

Phương pháp pha loãng

Pha loãng trong môi trường lỏng

Trong một dãy các ống nghiệm chứa môi trường đã được pha sẵn chất thử nghiệm ở những nồng độ khác nhau, dùng pipet vô khuẩn để đưa vi khuẩn thử nghiệm vào Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng 18 - 24 giờ Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng Phương pháp này có ưu điểm là nhanh gọn, chính xác, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được đối với những chất tan được trong nước Kết quả được đánh giá bằng cách soi độ đục

Pha loãng trên bản thạch

Chất thử nghiệm được pha loãng ở các nồng độ khác nhau trong môi trường cấy có chứa thạch đã được hấp tiệt trùng, đổ vào đĩa petri chờ thạch đông Dùng pipet lấy một lượng vi khuẩn theo quy định đưa lên bản thạch ở những vị trí đã được đánh dấu sẵn Đem ủ ở 370C trong 18 - 24 giờ Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn trên bản thạch Phương pháp này thích hợp cho những chất khó tan trong nước [16]

Xác định MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

Phương pháp pha loãng hay phương pháp pha loãng bán định lượng (Semi – quantitative dilution test)

Những thử nghiệm này nói chung được gọi là thử nghiệm MIC Kết quả được thể hiện bằng nồng độ chất thử tối thiểu (µm/mL) có khả năng ức chế sự mọc của vi khuẩn

Nguyên tắc: chất thử được pha loãng thành dãy nồng độ từ thấp tới cao

theo cấp số nhân trong môi trường nuôi cấy Mỗi nồng độ chất thử được cấy một lượng vi khuẩn nhất định và được nuôi cấy trong vòng 18 - 24 giờ Nồng

độ chất thử thấp nhất mà ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (môi trường không đục hoặc vi khuẩn không mọc trên mặt thạch) được gọi là giá trị MIC

Một số phương pháp thực hiện thử nghiệm MIC:

Phương pháp pha loãng trong thạch: chất thử được pha loãng trong thạch Phương pháp này có ưu điểm là có thể tiến hành đồng thời trên cùng một dãy nồng độ chất thử với nhiều chủng vi sinh vật Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là không có giá trị kinh tế cao khi thực hiện thử nghiệm nhiều vi sinh vật trên nhiều loại chất thử

Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng: chất thử được pha loãng trong các ống nghiệm chứa môi trường lỏng Đây là phương pháp tốt nhất cho mọi loại vi sinh vật khi dùng chất thử phối hợp Tuy nhiên, không có giá trị kinh tế cao khi thực hiện thử nghiệm nhiều loại vi sinh vật trên cùng hoặc nhiều chất thử

Phương pháp vi pha loãng trong môi trường lỏng: kháng sinh được pha loãng trong các giếng vi lượng Phương pháp này tốt nhất cho thử nghiệm nhiều chất thử trên nhiều loại vi khuẩn Tuy nhiên, phương pháp này rất khó đọc kết quả khi chất thử có màu [20]

1.3.2 Tổng quan một số mô hình thử tác dụng kháng viêm

Một số mô hình in vivo gây viêm cấp và bán cấp

Viêm có thể do nhiều nguyên nhân gây ra như: nhiễm khuẩn, thiếu máu cục bộ, tương tác kháng nguyên - kháng thể, tổn thương do hóa chất, nhiệt độ,

cơ học Tuy nhiên, dù do nguyên nhân nào thì pha cấp tính của phản ứng viêm cũng xuất hiện 4 triệu chứng điển hình là: sưng, nóng, đỏ, đau Trong thực nghiệm, người ta dùng các hóa chất tạo ra phản ứng viêm tương tự trên lâm

sàng để nghiên cứu tác dụng của thuốc Thuốc làm giảm các triệu chứng này được coi là tác dụng kháng viêm cấp Trong các phương pháp thì gây phù (sưng) là phương pháp hay được sử dụng nhất

Mô hình gây phù bàn chân chuột

Nguyên tắc

Mô hình này có thể dùng nhiều chất gây viêm khác nhau như: carrageenan, histamin, dextran, kaolin, formaldehyd, men bia, albumin trứng khi tiêm các chất này vào bàn chân chuột sẽ kích thích giải phóng ra các chất trung gian hóa học như histamin, prostaglandin, serotonin và kết quả là gây phù Thuốc có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột được coi là có tác dụng kháng viêm

Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan

Carragenan là một polysaccharid được cấu tạo từ các polymer của (1,3)-D-galactose và β-(1,4)-3,6-hydro-D-galactose (hay L-galactose) chiết xuất từ các loài tảo biển Carrageenan có 3 loại chính: Lamda, Kappa và Iota, trong đó Lamda carrageenan thường được sử dụng trong các thử nghiệm kháng viêm Do là một hợp chất cao phân tử với có phân tử lượng trên 1.0000 dalton nên khi vào trong cơ thể carrageenan trở thành kháng nguyên và kích thích hệ thống miễn dịch Tuy nhiên, một cơ chế khác cũng được đề nghị cho tác động gây viêm của carrageenan, đó là tác động gây teo, ức chế sinh trưởng và gây

β-chết tế bào của carrageenan [15]

Mô hình này dựa trên cơ chế phóng thích nhiều chất trung gian gây viêm khác nhau bởi carrageenan Sự gây phù chân chuột bởi carrageenan diễn ra qua

2 pha: khởi đầu là sự phóng thích histamine và serotonin, pha thứ 2 là sự phóng thích prostaglandin, protease và lysosome Pha thứ nhất bắt đầu ngay lập tức sau khi tiêm dưới da carrageenan và giảm dần trong 2 giờ, pha thứ hai bắt đầu sau khi kết thúc pha thứ nhất và duy trì suốt từ 3 đến 6 giờ [36]

Thực hiện theo mô hình gây viêm bằng tác nhân carrageenan Dựa trên

mô hình được Winter và cộng sự đề nghị vào năm 1962 [41] Carrageenan là một tác nhân gây viêm thông dụng Gây viêm cho chuột bằng cách tiêm vào gan bàn chân chuột một thể tích dung dịch carrageenan 1% trong nước muối sinh lí Tùy theo mô hình thử nghiệm mà chuột được cho uống các dung dịch thử nghiệm trước hoặc sau gây viêm Đánh giá tác động gây viêm vào các thời điểm khác nhau, có thể từ 1 giờ đến 6 giờ sau khi gây viêm hoặc theo dõi vào các ngày tiếp theo

Tác động kháng viêm được đánh giá bằng cách so sánh độ phù chân chuột giữa lô thử với lô chứng và lô đối chứng ở cùng 1 thời điểm Độ phù chân chuột chính là tỉ lệ phần trăm giữa độ tăng thể tích chân chuột trước-sau gây viêm và thể tích chân chuột ban đầu chưa gây viêm

Mô phỏng mô hình gây viêm khớp cấp tính bằng carrageenan

Chuột được gây viêm khớp cấp bằng cách tiêm vào khớp gối chân phải sau liều duy nhất 5μL hỗn dịch carrageenan 2% Chu vi khớp gối được đo trước khi tiêm và ở các thời điểm 3-27-51-75 giờ sau khi tiêm carrageenan Lô chứng được tiêm dung dịch NaCl 0,9% và lô thử đáp ứng của mô hình được thoa gel ketoprofen 2,5% (10mg, 2 lần/ngày), lên khớp gối chân Theo dõi và đánh giá mức độ gây viêm khớp của carrageenan và đáp ứng của ketoproten dựa vào mức độ sưng viêm ở khớp gối, mức độ đau và hình ảnh vi thể [24]

Mô phỏng mô hình gây viêm khớp mạn tính

Chuột được gây viêm khớp mạn tính bằng cách tiêm vào khớp gối chân phải sau 5μL hỗn dịch carrageenan 2%, 7 liều cách mỗi 3 ngày trong 19 ngày Đánh giá mức độ gây viêm của carrageenan (từ ngày 1 đến ngày 19) và mức

độ duy trì phản ứng viêm (từ ngày 20 đến ngày 27) dựa trên sự sưng viêm, mức

độ đau và hình ảnh vi thể Mô hình được thử đáp ứng bằng thuốc đối chứng ketoprofen (đánh giá từ ngày 20 đến ngày 27 với liều thoa tại chổ 10 mg lên

khớp gối, mỗi ngày 2 lần cách nhau 6 giờ vào thời điểm nhất định trong ngày) [28]

Mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan

Mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan tiến hành theo Winter

và cộng sự: Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô, được cho uống nước muối sinh lí hoặc thuốc đối chiếu hoặc Eosinophile (EOS) liên tục trong 5 ngày Ngày thứ 5, sau 1 giờ uống thuốc, tiêm 0,05mL carrageenan 1% vào gan bàn chân sau từng chuột Đo thể tích bàn chân chuột tại thời điểm trước và sau khi tiêm carrageenan 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ và 7 giờ Thông số đánh giá là mức độ phù chân chuột (ΔV%) và phần trăm ức chế phù so với lô chứng (I%) [41]

Mô hình gây viêm khớp gối chuột bằng carrageenan

Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô, được cho uống nước muối sinh

lí hoặc thuốc đối chiếu hoặc EOS liên tục trong 5 ngày Ngày thứ 5, sau 1 giờ uống thuốc, tiêm 0,15mL carrageenan 2% vào khớp gối chân sau từng chuột Sau 4 giờ, xác định các thông số đánh giá là mức độ sưng vùng khớp gối, mức

độ viêm khớp dựa theo triệu chứng, số lượng bạch cầu, hoạt độ myeloperoxidase (MPO) - định lượng theo phương pháp của Bradley [23] Hiện nay, phương pháp này vẫn được áp dụng rộng rãi và không có nhiều thay đổi đáng kể so với mô hình đầu tiên năm 1982

Mô hình gây phù chân chuột bằng histamin

Sự phù chân chuột gây ra do histamin xảy ra tại thời điểm sớm gắn với phản ứng của thành mạch Histamin được phóng thích bởi sự mất hột của tế bào mast gây ra do các chất trung gian gây viêm bao gồm interleukin-1 (IL-1) Điều này dẫn đến sự phóng thích các peptide thần kinh (neuropeptide) cũng như các prostaglandin và acid monohydroxy eicosatetraenoic từ tế bào nội mô mạch máu gây ra chứng tăng cảm giác đau (hyperalgesia) và các đáp ứng viêm khác

Cách tiến hành tương tự phương pháp carrageenan nhưng thay bằng 0,1mL dung dịch histamine 1% [34]

Các mô hình tương tự

Tương tự với cách tiến hành và cách đánh giá mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, nhiều nhà nghiên cứu đã cải biến và sử dụng các chất

gây viêm khác như hỗn dịch kaolin 5%; dung dịch lòng trắng trứng 1%;

formalin 1% (Turner 1965); dextran 1% đến 3% (Turner 1965); dextran 6%

(Winter 1963), dung dịch carrageenan 1% thêm 100 ng PGE 2 hoặc PGI 2, hỗn

dịch bột men bia 2,5%; 0,1mL dung dịch trysin 0,1%; dung dịch collagenase; dung dịch serotonin 0,02%; bradykinin 0,005%; prostaglandin E 2 0,1mg/mL;

gel bentonit; 0,1mL nystatin 15000 đơn vị; adriamycin 0,5% (gây phù chân

chuột nhắt)

Gây phù bằng kaolin: cơ chế gây viêm của kaolin cũng tương tự như

carrageenan Mô hình này hiện nay ít được sử dụng do một số hạn chế như kaolin gây phù rất mạnh, vì vậy để đánh giá khả năng ức chế phù của thuốc sẽ gặp khó khăn, nhất là với các thuốc có nguồn gốc dược liệu Hơn nữa, kaolin không tan trong nước và tạo thành hỗn dịch trong nước nên lượng tiêm khó chính xác, phù tạo thành không đều và ổn định

Gây phù bằng dextran: cơ chế gây phù chân chuột bằng dextran thông

qua việc giải phóng histamin và serotonin (Parratt và west 1957) Theo nghiên cứu của Winter, phenylbutazone không có tác dụng giảm phù trên mô hình này, ngoại trừ điều đó thì mô hình gây phù bằng dextran giống mô hình gây phù bằng carrageenan hơn các mô hình khác Đây cũng là mô hình được sử dụng nhiều ở Việt Nam và không có nhiều thay đổi và cập nhật đáng kể so với mô hình đầu tiên năm 1993 [44]

1.4 Tổng quan về các công trình nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn và kháng viêm của hột Xoài

1.4.1 Một số công trình nghiên cứu trên thế giới

Maisuthisakul, et al (2018) [32] cũng công bố cho thấy dịch chiết nhân hột Xoài ở Thái Lan có chứa các hợp chất phenolic với hoạt tính chống oxy hóa cao; dịch chiết nước của nhân hột Xoài chín được ngâm cũng cho thấy có hoạt

tính kháng viêm in vitro Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết còn

có khả năng kháng vi sinh vật như Staphylococcus aureus và Streptococcus

mutans (S mutans) Từ những công dụng đã xác định, nước xúc miệng chăm

sóc sức khỏe khoang miệng được bào chế chứa dịch chiết nhân hột Xoài có khả

năng chăm sóc sức khỏe răng miệng, kháng S aureus, S mutans in vitro và cho

đặc tính ức chế viêm cao hơn chlorohexidin Các kết quả thu được trong nghiên

cứu này chỉ ra rằng chất chiết xuất từ hột nước của M indica có thể là một

nguồn tiềm năng của các chất kháng viêm, kháng vi khuẩn và chất chống oxy hóa Tuy nhiên, rất ít loại nước súc miệng này đã trải qua quá trình kiểm tra nghiêm ngặt, bằng chứng là rất ít thông tin về hạn sử dụng bao gồm các đặc tính kháng viêm và kháng khuẩn Mục đích của nghiên cứu này là xác định các

đặc tính kháng khuẩn của nước súc miệng có chứa hột Xoài (Mangifera indica) kháng lại các tác nhân gây bệnh răng miệng liên quan đến sâu răng, S aureus

và S mutans, để cung cấp thông tin cho các chuyên gia nha khoa về hiệu quả

của sản phẩm in vitro và sử dụng những loại nước súc miệng này làm cơ sở để

đánh giá các sản phẩm thực vật kháng khuẩn Hoạt động ức chế viêm và thời hạn sử dụng của nước súc miệng cũng được đánh giá Nước súc miệng

chlorohexidine nổi lên như một loại nước súc miệng hiệu quả nhất để ức chế S

aureus và S mutans Nước súc miệng có chứa hột Xoài thể hiện vùng ức chế

kháng lại S aureus (12mm) hơn S mutans (10mm) và cũng cho thấy đặc tính

ức chế viêm cao hơn chlorohexidine Thật không may, nước súc miệng có chứa

nhân của M indica cho thấy rất ít độ ổn định do màu sắc bị thay đổi

Nghiên cứu của Amgad A Awad El-Gied, et al (2012) [22] cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết methanol và ethanol của hột Xoài ở Sudan

trên các chủng Streptococcus pneumonia, Enterobacter aerogenes, Klebsiella

pneumonia and Candida albicans, Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra

các hoạt động kháng khuẩn in vitro của chất chiết xuất từ methanol và ethanol của hột Xoài kháng lại 25 đại diện vi khuẩn gram dương, gram âm, axit nhanh

và nấm Hột Xoài được Soxhlet chiết xuất bằng cách sử dụng methanol và ethanol làm dung môi Các chất chiết xuất được thử nghiệm kháng lại vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán đĩa ở các nồng độ khác nhau: 5mg/mL, 3,75mg/mL, 3,125mg/mL, 2,5mg/mL, 1,875mg/mL và 1,25mg/mL) Các chiết xuất methanol và ethanol của hột Xoài cho thấy tác dụng ức chế tốt đối với hầu hết các chủng vi khuẩn đã thử nghiệm Các vùng ức chế được tạo ra bởi chiết xuất Xoài ít hơn các vùng được tạo ra bởi thuốc kiểm soát dương tính tiêu chuẩn Điều này có thể là do tỷ lệ khuếch tán thấp của chiết xuất Xoài trong môi trường agarose, một điều cần được nghiên cứu thêm Các sản phẩm này là liệu pháp kháng khuẩn mới tiềm năng trong lĩnh vực dân tộc học Vùng ức chế trung bình được tạo ra nằm trong khoảng từ 5mm đến 18mm với

18mm/Mycobacterium smegmatis cho thấy vùng ức chế cao nhất Trong hầu

hết các chủng thử nghiệm, các vùng ức chế có thể so sánh được đã được ghi

nhận đối với cả chiết xuất methanol và ethanol Can-dida albicans và

Aspergilllus niger đều bị ức chế bởi các chất chiết xuất Các chiết xuất

methanol và ethanol của hột Xoài cho thấy tác dụng ức chế tốt đối với hầu hết các chủng vi khuẩn đã thử nghiệm Các vùng ức chế được tạo ra bởi chiết xuất Xoài ít hơn các vùng được tạo ra bởi thuốc kiểm soát dương tính tiêu chuẩn Trong hầu hết các chủng thử nghiệm, các vùng ức chế có thể so sánh

được đã được ghi nhận đối với cả chiết xuất methanol và ethanol Can-dida

albicans và Aspergilllus niger đều bị ức chế bởi các chất chiết xuất Các chiết

xuất methanol và ethanol của hột Xoài cho thấy tác dụng ức chế tốt đối với hầu hết các chủng vi khuẩn đã thử nghiệm Các vùng ức chế được tạo ra bởi chiết xuất Xoài ít hơn các vùng được tạo ra bởi thuốc kiểm soát dương tính tiêu chuẩn Điều này có thể là do tỷ lệ khuếch tán thấp của chiết xuất Xoài trong môi trường agarose, một điều cần được nghiên cứu thêm Các sản phẩm này là liệu pháp kháng khuẩn mới tiềm năng trong lĩnh vực dân tộc học

Suranyu Khammuang, et al (2011) [39] cũng công bố dịch chiết hột của nhiều giống Xoài Thái có khả năng kháng khuẩn gram (-) và gram (+) và kháng oxy hóa mạnh hơn vitamin C Nghiên cứu này báo cáo các hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn của bốn chất chiết xuất từ hột Xoài tươi từ các giống của Thái Lan Tất cả các chất chiết xuất từ hột Xoài cho thấy hoạt tính kháng khuẩn thú vị kháng lại cả vi khuẩn gram dương và gram âm được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa Chủng gây bệnh nhạy cảm nhất bị ức chế bởi tất

cả các chất chiết xuất (đặc biệt là giống Kaew) là Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853 Công trình này cho thấy các ứng dụng tiềm năng cho các ứng dụng thực tế của chiết xuất hột Xoài từ các giống Thái Lan, làm nguồn chất chống oxy hóa và kháng khuẩn

1.4.2 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam một số tác giả đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hiệu quả cao chiết lá Xoài như trên lá Xoài non (nghiên cứu của Nguyễn thị Ái Lan (2018) [9], Trần Thu Hòa (2017) [11]), và lá Xoài nói chung (Nguyễn Thị Trúc Loan (2019) [13]) Thành phần chính của lá Xoài là mangiferin cũng được nghiên cứu chiết xuất và bào chế thành chế phẩm trà thảo dược bảo vệ sức khỏe với các tác động ngăn chặn cholesterol, tăng sự phân giải và hạn chế sự hình thành glucose, chống oxy hóa và chứng minh có tác dụng tương tự các thuốc trị tiểu đường và làm giảm cholesterol Chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam được thực hiện trên hột Xoài và việc xác định các hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa cũng chưa được công bố

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao vỏ hột (VH) và nhân hột (NH) Xoài được bào chế đạt tiêu chuẩn của cao đặc theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam V từ mẫu hột của quả Xoài vừa chín vàng thu hái tại Quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ từ tháng 02 – 04/2021

và đã được định danh, lưu mẫu tại Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền - Thực vật dược, trường Đại học Y Dược Cần Thơ

2.1.2 Động vật, nguyên liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Động vật nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chủng Wiss albino khỏe mạnh, chỉ lấy giới tính đực, khối lượng 30 – 35g do Phòng thí nghiệm sinh lí động vật, bộ môn Sư phạm Sinh học, khoa Sư phạm trường Đại học Cần Thơ cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng tự nhiên, cho

ăn bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm 7 ngày trước khi bắt đầu nghiên cứu

Các thuốc đối chứng trong nghiên cứu là các kháng sinh levofloxacin (nồng độ 10g/mL), trimethoprim/sulfamethoxazole tỷ lệ 1:20 (nồng độ 2,5g/mL) dùng trong khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Đối chứng diclofenac (nồng độ 10mg/kg) dùng trong khảo sát hoạt tính kháng viêm

2.1.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Cao đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%

2.1.4 Tiêu chuẩn loại trừ

Trong quá trình nghiên cứu, tiến hành loại bỏ mẫu cao khô bị ẩm, bị nhiễm nấm mốc, không đạt chất lượng theo tiêu chuẩn quy định

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất dùng trong nghiên cứu

STT Hóa chất Hãng sản xuất Nơi sản xuất Ghi chú

4 Thạch Mueller

9 Dimethyl sulfoxide

14 Diclofenac 25 mg

(Fenaflam)

CTY Dược Hậu Giang

Việt Nam

16 Nước muối sinh lý Vĩnh Phúc Việt Nam 0.9%

Bảng 2.2 Danh sách vi khuẩn dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.3 Danh sách thiết bị dùng trong nghiên cứu

4 Máy đo độ phù chân chuột

37140 Plethysmometer Ugo Basile Italia

Hình 2.1 Máy đo độ phù chân chuột 37140 Plethysmometer

2.1.5 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và bộ môn Vi sinh

- Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

Liên Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền - Thực vật dược - Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

Liên bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng - Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát và so sánh hoạt tính kháng khuẩn của cao vỏ hột và nhân hột Xoài

2.2.1.1 Chuẩn bị môi trường

Môi trường hoạt hóa vi khuẩn thử nghiệm: Tryptic Soy Agar (TSA) Bổ

sung 5% máu đối với chủng Propionibacterium acnes

Môi trường thử nghiệm: Thạch Mueller - Hinton (MHA), MHA + 5% máu

2.2.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn

Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ 3-5 khuẩn lạc có hình thái giống nhau nghiền đều vào ống nước muối sinh lý 5mL, lắc đều trên máy lắc để có huyền dịch đồng nhất

So sánh độ đục của huyền dịch vi khuẩn với độ đục của ống McFarland 0,5 (tương đương nồng độ 108 CFU/mL)

Cấy trải 100µL huyền dịch vi khuẩn trên toàn bộ mặt đĩa thạch sao cho

vi khuẩn được dàn đều lên trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch

2.2.1.3 Định tính khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch khuẩn đã chuẩn bị, ép que trên thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch

Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60o

Để hộp mở nắp trong tủ ấm 3 – 5 phút cho ráo mặt

Đục lỗ đường kính 8mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng Mỗi đĩa đục 5 lỗ: 4 lỗ cho chất thử, 1 lỗ chứng âm là DMSO

Chất thử là mẫu cao đặc vỏ hột xoài và nhân hột xoài pha thành dãy nồng

độ 200mg/mL, 100mg/mL, 50mg/mL và 25mg/mL với dung môi là DMSO

Lượng chất thử và chứng âm cho vào mỗi lỗ thạch là 60μL

Mẫu chứng dương là levofloxacin được hòa tan trong DMSO và nhỏ vào

lỗ lượng 5µg/lỗ trong đĩa riêng

Để nắp mở khoảng 3-5 phút, nhưng không quá 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch Ủ hộp thạch ở 300C trong 48 giờ

Nếu có tác dụng kháng khuẩn, mẫu thử sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn trên bản thạch Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn tại các vị trí tương ứng, so sánh với chất đối chiếu

là levofloxacin và trimethoprim/sulfamethoxazole (cotrimoxazol) đối với vi

khuẩn P acnes

Cách đọc kết quả: Chất thử có khả năng kháng khuẩn khi xung quang lỗ

có vòng kháng khuẩn trên 10mm

Hình 2.2 Cách đọc kết quả kháng khuẩn

2.2.1.4 Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trong thạch

Nguyên tắc: Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ từ thấp tới cao theo cấp số nhân trong môi trường nuôi cấy Mỗi nồng độ chất thử được cấy một lượng vi khuẩn nhất định và được nuôi cấy trong vòng 18 – 24 tiếng Nồng độ chất thử thấp nhất mà ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (môi

trường không đục hoặc vi khuẩn không mọc trên mặt đĩa thạch) được ghi nhận

Cho chất thử vào môi trường đã để nguội về 45 - 500C, lắc đều

Chuẩn bị vi khuẩn: Chuẩn bị các chủng vi khuẩn trong môi trường thạch thích hợp (như đã trình bày ở mục 2.2.1.1)

- Tiến hành:

Làm khô mặt đĩa thạch có chất thử và đĩa chứng không có chất thử

Cấy lần lượt 10 – 20µl huyền phù dịch vi khuẩn Staphylococcus aureus

và Escherichia coli lên hai điểm trên bề mặt mỗi đĩa thạch

Để yên khoảng 15 phút để vết cấy khô

Lật ngược đĩa thạch đã cấy và ủ ở 370C trong 16 – 18 giờ

- Đọc kết quả:

Kết quả chỉ có giá trị khi vi khuẩn trong đĩa chứng mọc bình thường Đặt đĩa thạch trên một bề mặt sẫm màu, không phản xạ ánh sáng, quan sát sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển, nồng độ của đĩa thạch đó chính là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm

Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn nhưng lại bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể đã bị nhiễm nên thử nghiệm phải thực hiện lại để đảm bảo

kết quả thu được là chính xác

2.2.2 Khảo sát và so sánh hoạt tính kháng viêm của cao vỏ hột và cao nhân hột Xoài bằng phương pháp gây phù bàn chân chuột

2.2.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm

Chuột trong mỗi lô được cho uống cao chiết dược liệu, diclofenac và dung môi pha mẫu trong cùng 1 thời điểm trong ngày, cho uống liên tục 5 ngày trước khi tiến hành gây viêm thực nghiệm Thể tích dịch cho mỗi lần uống là 0.15mL, nồng độ mẫu pha được xác định theo công thức phụ thuộc vào liều dùng như sau:

𝐶 = 𝑚 × 𝐴

10000 × 0.15

Trong đó:

C (mg/mL): nồng độ mẫu cho uống

m (g): cân nặng trung bình của chuột trong một lô

A (mg/g): liều dùng

Chuột trong từng lô được cân và xác định khối lượng trung bình, thể tích dịch cho mỗi con trong cùng 1 lô được điều chỉnh dựa trên khối lượng của từng con so với khối lượng trung bình cả lô thử nghiệm

Do các mẫu cao hột Xoài khó tan trong nước cất nên mẫu cho uống được trợ tan một phần bằng dimethyl sulfoxide để đảm bảo các mẫu cao uống có thể chất đồng đều nhau, tránh hiện tượng khác biệt hấp thu bằng đường uống giữa các lô thử nghiệm

Bảng 2.4 Các cao thuốc và thuốc dùng trong thử nghiệm kháng viêm

Pha dịch treo carragenan 1%: Cân chính xác 200mg bột carragenan cho vào cối Thấm ướt từ từ khối bột khô bằng nước muối sinh lý 0.9%, dùng chày đảo đều và nghiền kỹ khối bột Cho tiếp đến đủ 20mL nước muối sinh lý, khuấy trộn đều, để yên cho trương nở hoàn toàn trong vòng 3 giờ

2.2.2.2 Tiến hành thí nghiệm

Để đánh giá tác dụng kháng viêm cấp có nhiều mô hình được áp dụng như: mô hình gây viêm bằng nhiệt, hóa học, vi khuẩn nhưng mô hình gây viêm cấp bằng carrageenan được nhiều nhà khoa học trên thế giới áp dụng vì

Liều (mg/kg cân nặng)

Dung môi pha mẫu

Dạng dùng

1 Thử nghiệm 1 Cao vỏ hột 500 Dung dịch

Dung dịch DMSO 1% Dung dịch

carrageenan gây được các phản ứng viêm gần giống như cơ chế bệnh sinh của viêm [2], [37]

Tác dụng kháng viêm cấp nghiên cứu trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan Mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan tiến hành dựa trên mô hình nghiên cứu của Winter và cộng sự vào năm 1962, đây là một mô hình đã được rất nhiều nhà nghiên cứu áp dụng từ trước đến nay

và đã được cải tiến ít nhiều so với mô hình ban đầu Tuy nhiên về cơ bản, các công trình nghiên cứu hiện nay vẫn áp dụng mô hình này và chưa có phiên bản nào chính thức được cập nhật [41], mô hình gây viêm bằng tác nhân carrageenan đã được nghiên cứu thực hiện tại phòng thí nghiệm-bộ môn Dược

lý - Dược lâm sàng, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ: Chuột được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô có 8 chuột, như sau:

- Lô sinh lí: không gây viêm, uống nước cất

- Lô chứng bệnh: gây viêm, uống dung môi pha mẫu

- Lô đối chứng: gây viêm, uống diclofenac với liều 10 mg/kg thể trọng chuột

- Lô thử nghiệm 1: gây viêm, uống cao vỏ hột Xoài với liều 500mg/kg

- Lô thử nghiệm 2: gây viêm, uống cao vỏ hột Xoài với liều 750mg/kg

- Lô thử nghiệm 3: gây viêm, uống cao nhân hột Xoài với liều 500mg/kg

- Lô thử nghiệm 4: gây viêm, uống cao nhân hột Xoài với liều 750mg/kg

Hình 2.3 Chuột sau khi được tiêm carrageenan vào gan bàn chân

Trước khi tiến hành gây viêm, thể tích chân chuột bình thường (Vo) được tiến hành đo trên máy Plethysmosmeter Chân trái của chuột nhúng vào dung dịch chống thấm tới vị trí đánh dấu cách khuỷu chân 0,5cm, ghi nhận số thể tích hiển thị trên máy

Chuột được cho uống dung môi pha mẫu, diclofenac hoặc cao thử với thể tích 0.15mL, 1 lần vào 1 giờ nhất định trong ngày

Cho uống trong 3 ngày liên tục với liều không thay đổi Sau 1 giờ ở lần cho uống cuối cùng, chuột ở các lô từ 2 đến 7 được gây viêm bằng cách tiêm 0,05mL dịch treo carrageenan 1% [41]