Khóa Luận Hoàn Thiện Phương Pháp Và Nghiên Cứu Sự Đa Dạng Di Truyền Của Cây Đước Đôi (Rhizophora Apiculata Blume) Ở Khu Dự Trữ Sinh Quyển Rừng Ngập Mặn Cần Giờ Bằng Kỹ Thuật Rapd.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA A[.]

**********

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƯỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA

BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN

CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007

Không ngôn từ nào có thể nói hết tình yêu con dành cho Ba Mẹ, người sẵn sàng hy sinh tất cả vì con

Cảm ơn các anh em, những người luôn tạo động lực cho tôi tiến lên

Em xin chân thành cảm ơn:

Các Thầy Cô trong trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học

Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học

đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận

Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Chị Hưng, chị Dung, chi Trân, anh Thế, anh Phương, anh Khoa cùng các anh chị trong Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu

Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản

lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt bốn năm đại học

Chân thành cảm ơn!

Võ Công Danh

VÕ CÔNG DANH, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 “HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA

CÂY ĐƯỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH

QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”

Cây đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại khu dự trữ sinh quyển rừng

ngập mặn Cần Giờ rất có giá trị về kinh tế và môi trường Việc nghiên cứu đa dạng

di truyền của cây đước đôi là cấp thiết nhằm bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hướng đa dạng sinh học

Những kết quả đạt được Thu thập được 40 mẫu lá đước với những đặc điểm hình thái khác nhau Xác định điều kiện tối ưu để bảo quản mẫu lá đước

Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá đước Xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây đước Kết quả thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên 10 mẫu kết quả thu được 5 band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7% Phân tích kết quả RAPD với phần mềm NTSYSpc cho kết quả như sau: các mẫu đước trồng cùng năm có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00 Các mẫu đước trồng năm 1978 và năm 1980 có hệ số đồng dạng di truyền biến thiên trong khoảng 0,50 – 0,83 Các mẫu đước nguồn gốc tại chỗ được trồng năm 1991 và trồng năm 1996 có hệ số đồng dạng di truyền là 0,50 Những cây đước đôi nguồn giống tại chỗ và nguồn giống Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền khá thấp từ 0,33 đến 0,67

( II )

( III )

VO CONG DANH, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2007

“DEVELOP A METHOD TO ACEESS THE GENETIC DIVERSITY OF

Rhizophora apiculata Blume IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE

BY RAPD-PCR”

Mangrove population (Rhizophora apiculata Blume) in Can Gio swamp

forest eco-conservation area has a high economic and environmental value Researching the genetic diversity of this plant is necessary to preserve and develop this area in a sustainable way

Obtained results were:

Collected 40 samples of Rhizophora apiculata

Found out the best conditions to preserve Rhizophora apiculata

Completed DNA extraction protocol from Rhizophora apiculata

Established RAPD protocol for Rhizophora apiculata

We analysed 10 samples using RAPD with primer OPAC 10 and got 5 polymorphic bands (100 – 600kb) and 1 monomorphic band (170 kb) which made

up 83,3 percents and 16,7 percents of bands

Analyse RAPD data with NTSYSpc software showed following results:

Rhizophora apiculata planted in 1978, 1980 had high similarity from 0,83 to 1,00 Compare R apiculata planted in 1978 with the one planted in 1980 showed a similarity from 0,50 to 0,83 The similarity of local R apiculata and the one planted

in 1991 or in 1996 is 0,50 While the local R apiculata and the one from Camau

plants had long distance from 0,33 to 0,67

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.2.3 Giới hạn đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 3

2.1.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 3

2.1.2 Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5

2.1.3 Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 6

2.2 Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đước đôi 8

2.2.1 Hình thái học 8

2.2.2 Phân bố 9

2.2.3 Vai trò của rừng đước 9

2.3 Quy trình ly trích DNA thực vật 9

2.3.1 Đánh giá chất lượng DNA 11

2.4.2 Nguyên tắc 13

2.4.3 Ứng dụng 13

2.4.4 Ưu và nhược điểm 13

2.5 Đa dạng di truyền 14

2.5.1 Khái niệm 14

2.5.2 Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền 14

2.6 Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) 15

2.6.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 16

2.6.2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 17

2.6.3 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18

2.6.4 Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đước 21

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 22

3.1.1 Thời gian thực hiện 22

3.1.2 Địa điểm thực hiện 22

3.2 Vật liệu thí nghiệm 22

3.1.2 Mẫu đước đôi 22

3.2.2 Hoá chất thí nghiệm 23

3.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm 24

3.3 Phương pháp nghiên cứu 25

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 25

3.3.2 Phương pháp ly trích DNA 25

3.3.3 Kiểm tra kết quả ly trích 28

4.1 Kết quả thu thập mẫu đước tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần

Giờ 36

4.2 Bảo quản mẫu 36

4.3 Hoàn thiện quy trình ly trích DNA 37

4.4 Kết quả phản ứng RAPD – PCR 44

4.4.1 Thí nghiệm 1 44

4.4.2 Thí nghiệm 2 45

4.4.3 Thí nghiệm 3 45

4.4.4 Thí nghiệm 4 46

4.4.5 Thí nghiệm 5 47

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIÊU THAM KHẢO 53

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 53

TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 54 PHỤ LỤC

A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine

bp: Base pair

CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide

dNTP: Deoxynucleotide triphosphate

DNA: Deoxyribonucleic acid

EB: Extraction Buffer

EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid

ng: Nanogram

OD: Optical density

PCR: Polymerase chain reaction

RNA: Ribonucleic acid

RNase: Ribonuclease

RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA

SDS: Sodium Dodecyl Sulfate

SIDA: Swedish Inernaional Devolopment cooperration Agency

TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA

TE: Tris EDTA

Tm: Melting temperature

UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization

UBND: Ủy ban Nhân dân

UV: Ultra Violet

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4

Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 19

Hình 3.1 Lá, hoa, trái của cây đước đôi 23

Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 36

Hình 4.2 DNA tổng số của 4 mẫu đước thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo 3 quy trình ) 40

Hình 4.3 DNA tổng số của 6 mẫu lá đước (Lá già và lá non) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình 3) 40

Hình 4.4 DNA tổng số của 17 mẫu lá đước thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 41

Hình 4.5 DNA tổng số pha loãng của 17 mẫu lá đước thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 41

Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 3 mẫu đước thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 44

Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg2+ ở thí nghiệm 2 45

Hình 4.8 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer OPAC10ở thí nghiệm 3 45

Hình 4.9 Sản phẩm PCR thử nghiệm 2 primer OPAC10 VÀ OPA10 46

Hình 4.10 Sản phẩm PCR của 10 mẫu đước ở thí nghiệm 5 47

Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền của 10 mẫu đước thu thập ở khu dự trữ sinh quyển ngập mặn Cần Giờ 48

( I ) ( II )

Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thước 12

Bảng 2.2 Các loại chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 15

Bảng 3.1 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD 30

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD 31

Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD với primer OPAC10 32

Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD với primer OPAC10 33

Bảng 3.5 Thực hiện phản ứng RAPD với primer OPA10 và OPAC10 33

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất thích hợp sử dụng trong phản ứng RAPD 33

Bảng 4.1 Bảng giá trị OD của 6 mẫu đước (Lá non và lá già) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 10 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RAPD 42

Bảng 4.2 Bảng giá trị OD của 10 mẫu đước dùng để thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RAPD 43

Sơ đồ 4.1 Sơ đồ ly trích DNA từ lá đước đôi theo quy trình 3 39

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Đước đôi hay đước (Rhizophora apiculata Blume) là cây có giá trị về kinh

tế và môi trường Gỗ đước được sử dụng rộng rãi trong xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản Than đước cho nhiệt lượng cao và ít khói [13] Vỏ có nhiều tanin được dùng trong công nghệ thuộc da, công nghệ dược phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo dán Rừng đước sản sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trưng của vùng ven biển, cửa sông Các khu rừng đước có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở và ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển Mặt khác các khu rừng đước là nơi cư trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm [5]

Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập măn Cần Giờ đã bị hủy diệt hoàn toàn bởi hàng chục ngàn tấn bom đạn, hàng triệu lít hóa chất khai quang đã rải xuống gây thiệt hại vô cùng nghiêm trọng về tài nguyên và môi trường sinh thái Từ năm 1978, Thành phố tiến hành khôi phục lại hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ với hầu hết giống đước được thu mua ở Năm Căn (Cà Mau) Qua 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là “Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/01/2000 [5] Trước áp lực là khu dữ trữ sinh quyển thế giới cùng với những vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trường thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đước đôi là vô cùng cấp thiết Trên cơ sở đó, các cơ quan chức năng

sẽ có chiến lược bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hướng đa dạng sinh học Rừng đước trồng thuần rất nhạy cảm và dễ

bị tổn hại khi có những tác động bên ngoài Mặt khác chúng ta cũng có thể tìm ra các chỉ thỉ phân tử nhằm rút ngắn thời gian cho quá trình chọn giống, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng, đảm bảo cho sự phát triển bền vững

Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM, dưới sự hướng dẫn của Thầy Bùi Minh Trí, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA

DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƯỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA

BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG

KỸ THUẬT RAPD”

1.2 Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài

1.2.1 Mục đích

Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây đước đôi

Xác định đa dạng di truyền của cây đước đôi tại khu dữ trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

1.2.2 Yêu cầu

Thành thạo thao tác ly trích DNA tổng số từ mẫu lá đước

Nắm vững kỹ thuật RAPD, hạn chế sai sót khi thực hiện

Hiểu rõ phần mềm NTSYSpc 2.1

1.2.3 Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu đối với quần thể đước tại một số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Chỉ tiến hành kiểm tra 2 primer chọn lọc dùng trong RAPD

Thời gian thực hiện từ ngày 08/05/2007 đến 30/08/2007

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

2.1.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ, được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai - Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh có tọa độ địa lý như sau:

Trước kia rừng ngập mặn Cần Giờ che phủ một vùng khoảng 40.000 ha; Tài nguyên động thực vật, thủy sản nước lợ hết sức phong phú, đa dạng Tán rừng dày

kín, cây rừng cao trung bình trên 20 m, đường kính 25 – 40 cm Đước (Rhziophora apiculata) là loài chiếm ưu thế, cùng với các loài khác như bần trắng (Sonneratia alba), mấm trắng (Avicennia alba), đưng (Rhizophora mucronata), vẹt (Sonneratia alba), xu (Xylocarpus spp.), cóc (Lumnizera spp.), chà là (Phoenix paludosa), giá (Excoecaria aagallocha) Trong thời gian chiến tranh chống Pháp và đặc biệt trong

thời kỳ chống Mỹ , bom đạn cùng các loại chất độc hóa học đã hủy hoại gần như toàn khu rừng này Đến 1978, Thành ủy và UBND Thành phố Hồ Chí Minh chỉ đạo ngành Lâm Nghiệp, UBND huyện Cần Giờ phục hồi lại hệ sinh thái rừng ngập mặn

đa dạng độc đáo này Hiện nay, rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 30.000 ha, chiếm 17% diện tích tự nhiên của toàn Thành phố và 46% diện tích của toàn huyện Cần Giờ.[5]

Thảm thực vật Cần Giờ là môi trường sống cho nhiều loài động vật; Theo thống kê năm 1999 như sau:

Khu hệ động vật thủy sinh không xương sống có trên 700 loài thuộc 44 họ,

19 bộ, 6 lớp, 5 ngành

Khu hệ cá có trên 137 loài thuộc 39 họ và 13 bộ

Ghi chú:

Vùng đệm Vùng lõi

Vùng chuyển tiếp Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Khu hệ động vật có xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài hữu nhũ Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt

Nam như tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus), trăn gấm (Python reticulatus), rắn cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn hổ mang (Naja naja), rắn hổ chúa (Ophiophagus), vích (Chelonia), cá sấu hoa cà (Crocodylus posus) [5]

Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài không phải là chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau

2.1.2 Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Theo báo cáo về diễn biến môi trường Việt Nam năm 2005 của tổ chức SIDA, phần đa dạng sinh học đã đánh giá: “Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ, nằm ở huyện ven biển phía Nam Thành phố Hồ Chí Minh, đã trở thành một trong những điểm phục hồi rừng ngập mặn lớn nhất thế giới Khu này có diện tích 75.740 ha, gồm chủ yếu là rừng ngập mặn, với trên 200 loài động vật và thực vật nước mặn và nước lợ” Tổng diện tích 75.740 ha được phân chia thành 3 vùng: vùng lõi, vùng đệm và vùng chuyển tiếp [5]

2.1.2.1 Vùng lõi

Tổng diện tích: 4.721 ha gồm các tiểu khu 3, 4b, 6, 11, 12, 13 với sự đa dạng cao về thực vật, động vật và các dạng sinh cảnh của rừng ngập mặn

Các chức năng chính:

Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn cả rừng trồng và rừng tự nhiên

Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn và các môi trưòng sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nước

Bảo tồn thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên

cả các loài thực vật lẫn động vật

Nghiên cứu khoa học

Du lịch sinh thái (Phải có giới hạn) [5]

Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển

Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hoá nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái

Các mô hình lâm ngư kết hợp thân thiện với môi trường cũng được ứng dụng trong vùng này cho cư dân địa phương

2.1.2.3 Vùng chuyển tiếp

Tổng diện tích: 29.310 ha bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ

cả các khu lúa nước và vườn cây ăn trái cùng thảm cỏ biển dọc theo ven biển Cần Thạnh, Long Hoà, Lý Nhơn

Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu mở rộng không gian có sẵn như môi trường sống cho các loài thú hoang dã từ vùng đệm [5]

2.1.3 Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là “lá phổi” vừa là “quả thận” có chức năng làm sạch không khí và nước thải từ các Thành phố công nghiệp

từ thượng nguồng sông Đồng Nai – Sài Gòn trước khi ra Biển Đông Tán cây rừng dày kín là một nhà máy khổng lồ hấp thụ CO2 và cung cấp nguồn O2 quan trọng cho Thành phố, được gió mùa Đông Nam góp phần thổi từ biển vào Nội thành nơi đang

bị ô nhiễm trầm trọng Theo số liệu khoa học của đề tài nghiên cứu “Phát triển mảng xanh đô thị Thành phố Hồ Chí Minh Đến 2010”, tính trên diện tích 20.000 ha rừng trồng ở Cần Giờ trong suốt 25 năm qua, lượng CO2 do cây rừng hấp thu được

là 10.164.440 tấn, lượng O2 sinh ra là 6.776.296 tấn.[5]

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là môi trường lý tưởng lọc nước thải từ Thành phố Hồ Chí Minh, các khu công nghiệp Bình Dương, Biên Hòa đưa xuống trước khi ra biển Số lượng nước thải hàng năm đưa xuống rừng Cần Giờ

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là môi trường cung cấp thức

ăn và bảo vệ các loài thuỷ sản sinh sôi, phát triển Cây rừng có tác dụng điều hoà nhiệt độ nước và không khí Nguồn lợi thủy sản xuất khẩu của Cần Giờ mang lại là rất lớn Hàng năm đạt từ 400 - 500 tỷ đồng, góp phần quan trọng nâng cao đời sống nhân dân vùng rừng Cần Giờ [5]

Sau khi rừng Cần Giờ được công nhận là khu dự trữ sinh quyển của thế giới, lượng du khách đến tham quan, nghỉ ngơi, học tập và nghiên cứu khoa học ngày càng tăng và số tiền thu được mỗi năm hàng chục tỷ đồng Các hoạt động du lịch

sinh thái đã và đang tăng lên, tạo ra thêm nhiều công ăn việc làm nâng cao đời sống người dân [5]

2.2 Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đước đôi

Lá: lá hình bầu dục và dài 15cm, rộng 6 cm, đầu nhọn, gân chính Cuống lá màu đỏ dài từ 1,5 – 3 cm, lá phụ màu hồng hay hơi đỏ dài từ 4 – 8 cm có tác dụng bảo vệ lá non

Hoa: hoa tự tán mọc ở nách lá, hoa không cuống kích thước từ 3 – 4 mm xuất phát từ các búp hình noãn dài 15 – 20 mm, lá nhỏ cong lên đầy thịt có kẻ hở hình răng bao vòng phần dưới của hoa Đài hoa có cánh cong vào trong, nhọn, dài 10 –

14 mm, rộng từ 6 – 8 mm Cánh đài hơi nhọn, mỏng không có lông, xoay quanh một nhuỵ đối diện dài 8 – 11 mm Nhụy có 4 ở ngoài cánh hoa và 4 ngoài đài hoa không cuống nhọn, dài từ 6 – 7,5 mm, bầu noãn bán hạ phần trên cao hơn mặt đĩa từ 1,5 – 2,5 m, vòi nhuỵ dài từ 0,5 – 1 mm đầu bị chẻ đôi Đước trổ bông sau 5 – 6 năm vào tháng 4 – 5 đầu mùa mưa [9]

Trái: màu xanh, khi già có màu nâu hoặc hồng dài từ 20 – 25 cm, phần dưới phình ra, phần trên được bao bởi một ống trùm lên lá non phủ xuống 2 – 3 cm Đầu

chóp có một mũi tà màu hơi hồng khi trái chín., mùa rụng trái thường xảy ra từ tháng 7 – 9 hàng năm Thời gian bắt đầu ra hoa đến lúc trái thuần thục thường kéo dài 36 tháng, có khoảng 40 – 50 trái/kg Trái nảy mầm trong một tuần lễ sau khi trồng

2.2.2 Phân bố

Đước (Rhizophra apiculata) là loài cây mọc chủ yếu ở rừng ngập mặn, vùng

cửa sông ven biển khu vực nhiệt đới Rừng ngập mặn phồn thịnh nhất là ở Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Thailand, Nam Việt Nam, Campuchia, Philippin

Đước thích mọc trên đất phù sa cận sinh đã được bần (Sonneratia alba), mấm (Avicennia alba) cố định

2.2.3 Vai trò của rừng đước

Đước là loài cây có sinh khối lớn, gỗ đước được sử dụng rộng rãi để xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản Than đước cho nhiệt lượng cao và ít khói Vỏ có nhiều tanin được dùng trong công nghệ thuộc da, công nghệ dược phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo dán Đước sau khi trồng 15 năm có thể thu được 15 tấn gỗ/ha [13] Rừng đước sản sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trưng của vùng ven biển, cửa sông Các khu rừng đước có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở, sa mạc hóa, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển Hơn thế nữa các khu rừng đước là nơi cư trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm

2.3 Quy trình ly trích DNA thực vật

Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số như quy trình của Scott O.Rogers

và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997) Mỗi phương pháp đều có ưu và khuyết điểm riêng Chúng ta có thể dựa vào đối tượng được cũng như yêu cầu về chất lượng, số lượng DNA cần thu để chọn phương pháp cho thích hợp Ngoài ra, giá thành cũng

là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phương pháp tách chiết thích hợp

Phương pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bước:

Bước 1: phá màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp cơ học (nghiền) Thông thường người ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào

và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thủy phân nội bào, người ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-1980C) Sau đó sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (Phá vỡ hóa học)

Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (Nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan (Chloroform, nước) Mẫu được lắc nhẹ trong dung dịch chloroform/iso amylalcohol (tỉ lệ 24/1) Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha chloroform Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại

Bước 3: tủa nucleic acid Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhưng thông thường người ta dùng isopropanol Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn [3]

Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:

DNA bị phân hủy hoặc bị gãy

Có lẫn tạp RNA trong mẫu DNA

Có lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA

Có lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA

2.3.1.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Phương pháp này dựa trên một đặc tính của acid nucleic là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodiester của các sợi acid nucleic Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt chúng vào điện trường Kỹ thuật này được tiến hành trên một giá thể bán rắn gọi

là gel có tác dụng phân tách các phân tử acid nucleic theo kích thước Các phân tử acid nucleic đi qua những lỗ nhỏ trong gel, kích thước phân tử càng lớn thì di chuyển càng chậm trong gel Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các

lỗ có trong gel Tùy theo kích thước các phân tử cần phân tích người ta sử dụng 1 trong 2 loại gel:

Polyacryamid: phân tích DNA sợi đơn kích thước dưới 500 bp Gel được đổ giữa 2 tấm thuỷ tinh và phương điện di là phương thẳng đứng Các phân tử DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng và nhận biết vị trí bằng phương pháp phóng xạ

tự ghi, hoặc nhuộm bằng chất nhuộm chuyển biệt như bạc, khi đó các băng sẽ có

màu tím đỏ dưới ánh sáng ban ngày bình thường [8]

Agarose: phân tích DNA sợi đôi, kích thước từ 0,5 – 2kb Gel được đổ trên

giá thể nằm ngang và điện di theo phương nằm ngang Để phát hiện DNA trên gel

người ta dùng chất nhuộm ethidium bromide, chúng có khả năng xen vào giữa các

base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại, acid nucleic sẽ hiện ra

dưới dạng các vạch màu đỏ cam có thể chụp ảnh và ghi nhận lại.[8]

Dựa vào kết quả điện di: so sánh các băng với băng chuẩn có thể biết chất

lượng DNA ly trích như gãy, lẫn tạp

Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thước [8]

(Lê Đình Lương, 2001)

(Lê Đình Lương, 2001) (Lê Đình Lương, 2001)

2.4 PCR (Polymerase chain reaction)

2.4.1 Khái niệm

Đây là phương pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một

cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lượng

DNA mẫu rất nhỏ Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất

hiệu quả Bằng kỹ thuật PCR, hàng tỉ bản sao DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được

thu nhận từ DNA mẫu [6]

Loại gel Phạm vi phân tách (bp) 0,3% agarose 50.000 đến 1000

0,7% agarose 20000 đến 300 1,4% agarose 6000 đến 300 4% acrylamid 1000 đến 100 10% acrylamid 500 đến 25 20% acrylamid 50 đến 1

Kéo dài: 720

C, 60 – 90 giây Đây là bước kéo dài primer nhờ hoạt động

của Taq polymerase Nhiệt độ 720C là tối ưu cho hoạt động của Taq

polymerase

Sau 25 - 35 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 720C trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR

2.4.3 Ứng dụng

Đánh giá mức độ biến dị di truyền trong một loài sinh vật thông qua mức

độ biểu hiện đa hình

Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các giống, giữa quần thể khác loài Thiết lập bản đồ di truyền thông qua các phương pháp phân tích các kỹ thuật trong sinh học phân tử như RAPD, STS, SSR, AFLP

Nghiên cứu và phân tích gia phả của sinh vật

Kiểm tra và xác định nguồn gốc con lai

Thiết lập hệ thống phân loại phân tử thông qua các kỹ thuật sinh học phân

tử có liên quan

Giải trình tự DNA

Ứng dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen

Chẩn đoán bệnh trong y khoa, chẩn đoán nhóm máu, phát hiện các bệnh trong y khoa

Phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng triệu năm [6]

2.5 Đa dạng di truyền

2.5.1.Khái niệm

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gene giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gene có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể [18]

2.5.2 Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền

Việc nghiên cứu đa dạng di truyền có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến lược quản lý, bảo vệ và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ

Kết quả quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ luôn luôn là

kế hoạch dài hạn Từ 1978 – 1983 trồng phủ xanh bằng cây đước (Rhizophora apiculata), từ 1984 – 1999 trồng đa dạng loài để đạt đa dạng sinh học Từ năm 2000

trở đi, quan sát động lực phát triển và mối quan hệ với các hệ sinh thái tiếp giáp, theo dõi độ tăng đa dạng sinh học.[5]

Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đước để tìm hiểu hệ số đồng dạng di truyền, nhằm điều chỉnh kịp thời độ đa dạng di truyền của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Bởi vì khi hệ số đồng dạng di truyền cao thì ảnh hưởng của các tác nhân như sâu bệnh là rất lớn và thiệt hai nếu xẩy ra là vô cùng nghiêm trọng

2.6 Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker)

Là những chỉ thị được tạo ra nhờ phương pháp cắt DNA bằng enzym giới hạn (Restriction enzyme) hoặc qua PCR Các chỉ thị phân tử này có thể liên kết với một gen nào đó nằm trên nhiễm sắc thể

Các chỉ thị phân tử có nguồn gốc từ hai nhóm:

Chỉ thị phân tử dựa vào phương pháp lai DNA: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), minisatelite

Chỉ thị phân tử dựa vào phương pháp PCR: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequense Repeats/microsatellite repeats), STS (Sequence

Tagged Sites), DAF (DNA Amplification Fingerprinting) [7]

Bảng 2.2 Các loại chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền [2]

(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Tên đầy đủ AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD Random Amplified Polymorphic DNA DAF DNA Amplification Fingerprinting ALP Amplicon Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism AP-PCR Arbitrary Primer-PCR

SNP Single Nucleotide Polymorphism STS Sequence – Tagged Sites

2.6.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

2.6.1.1 Định nghĩa

RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác.[9]

2.6.1.2 Phương pháp

Phương pháp này cho phép so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn - nhằm tìm hiểu xem có hay không đột biến điểm (Làm mất hoặc xuất hiện vị trí giới hạn) hoặc có hay không sự thay đổi một đoạn trình tự DNA

Trường hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy các band DNA giống nhau hoàn toàn về số lượng và kích thước Ngược lại, nếu có đột biến điểm hoặc có thay đổi một đoạn trình tự DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các band DNA

Sự giống nhau hoặc khác nhau về các band DNA này được nhận biết qua ảnh phóng xạ tự ghi hoặc đánh dấu probe

2.6.1.3 Ứng dụng

Chỉ thị phân tử RFLP có thể được sử dụng trong một số nghiên cứu như:

Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể (Ghi nhận qua sự đa hình DNA)

Phân tích tương quan di truyền giữa các cá thể

Lập bản đồ di truyền (Genetic map) phục vụ công tác chọn tạo giống (Thí

dụ như một số chỉ thị phân tử RFLP liên kết với gen quy định tính trạng số lượng) [2]

2.6.2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

2.6.2.1 Định nghĩa

AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt [1]

2.6.2.2 Phương pháp

Gồm các giai đoạn:

Tách chiết DNA

Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn Thông thường, enzyme cắt giới hạn

sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thường xuyên (Tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thường xuyên (Nhằm hạn chế số lượng các đoạn cắt)

Nối trình tự DNA với các adaptor (Trình tự tiếp hợp) Sau khi cắt bằng cặp enzyme một trình tự nối mạch đôi Adaptor sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi

và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide

Khuếch đại đoạn cắt giới hạn Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích

Chạy điện di các đoạn được khuếch đại trên gel polyacrylamide

Tạo nhiều băng khuếch đại - khả năng đa hình cao

Kết quả có độ tin cậy cao, có khă năng lặp lại

Không cần biết trước trình tự DNA genome

 Nhược điểm

Cần DNA có độ tinh sạch cao, không làm tạp nuclease hoặc ức chế nó AFLP là chỉ thị di truyền trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp

2.6.3 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

2.6.3.1 Phương pháp

Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb Các đoạn với kích thước khác nhau này được nhận biết bằng điện di Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể được dùng như những chỉ thị để xác định sự đa dạng di truyền RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình

trên thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình phản ứng PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao

Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD như sau:

Các mũi tên biểu thị cho các primer (Các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 là các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào Sản phẩm PCR được tạo thành:

Sản phẩm A: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5

Sản phẩm B: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 3 và 6

Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hướng vào nhau [17]

Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước cơ bản:

Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR

Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid

Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thường gặp phải một số vấn đề:

Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên gel điện di

Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng

PCR buffer thường được cung cấp theo Taq polymerase và có thể có hoặc

phải chính xác và được xác định qua thực nghiệm

Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf

Không đòi hỏi chất lượng DNA mẫu cao, lượng DNA mẫu cần ít

Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản

Thời gian thực hiện nhanh Khả năng nhân bản cao

Chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

 Nhược điểm

Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định

Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp

và có độ tin cậy không cao

2.6.4 Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đước

2.6.4.1 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1997, Madasamy Parani và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD và

RFLP để nghiên cứu mối quan hệ giữa cây đước đôi (Rhizophora apiculata Blume)

và cây đưng (Rhizophora mucronata) Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối quan hệ rất gần giữa cây đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) và cây đưng (Rhizophora mucronata) [14]

Năm 2002, Mukkamala Lakshmi và cộng sự đã sử dụng RAPD và RFLP nghiên cứu mối quan hệ giữa các cây thuộc họ đước (Rhizophoreae) tại Ấn Độ Kết quả nghiên cứu cho thấy mối quan hệ di truyền của 10 loài thuộc họ đước trong

rừng ngập mặn Ấn Độ [15]

2.6.4.1 Nghiên cứu trong nước

Có rất nhiều nghiên cứu về cây đước tuy nhiên hầu hết liên quan đến đặc điểm hình thái, các tính trạng nông học như: tăng trưởng đường kính của Đước tại huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam, 1995) Nghiên cứu sinh khối và năng suất sơ cấp rừng Đước trồng tại Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Sở Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn (Viên Ngọc Nam và Nnk, 1996)

Về nghiên cứu đa dạng di của truyền Lâm Vỹ Nguyên (2006) đã nghiên cứu

sự đa dạng di truyền của cây đước đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ

sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Thời gian và điạ điểm thực hiện

3.1.1 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ 08/05/2007 đến 30/08/2007

3.1.2 Địa điểm thực hiện

Mẫu lá đước được thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Mẫu lá được ly trích DNA và thực hiện phản ứng RAPD tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường

Lấy mẫu đước theo đường chéo, cách 1500m lấy 1 mẫu

Sử dụng xe gắn máy đối với đường bộ và ghe đối với đường sông để thu thập lá của cây đước đôi (Lá già, lá non)

Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt như: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng lá khác lạ Ghi nhận nguồn gốc và xác định một số tính trạng về kiểu hình: hình dáng

lá, hoa, trái của cây

Chọn mẫu lá từ trên những cây đước đôi có năm tuổi khác nhau

Mỗi mẫu lấy khoảng 15 - 20 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh

để bảo quản độ tươi của lá Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây được lấy mẫu theo phiếu thu thâ ̣p (Tham khảo phụ lục 5)

Xác định được vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trêm bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System)

Ký hiệu tên mẫu: AXY, BXY với A là đường chéo thứ nhất, B là đường chéo thứ hai, XY là số thứ tự của mẫu

Cách bảo quản mẫu đưa về phòng thí nghiệm: Mẫu sau khi lấy được cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời Sau đó chuyển về phòng thí nghiệm trữ mẫu ở nhiệt độ -200C

3.2.2 Hoá chất thí nghiệm

3.2.2.1 Các hoá chất dùng ly trích DNA

Ethanol 100% Mercaptro Ethanol

Ethanol 70% Sodium Acetate 3M

Chloroform NaCl 5M Chloroform

Tris-HCl 1M Isoamyl Alcohol

Polyvidon

Hình 3.1 Lá, hoa và trái đước đôi

3.2.2.2 Hóa chất dùng trong kiểm tra định lượng DNA

Primer: OPAC10 và OPA10

Nước cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV

3.2.2.4 Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả

Máy Vortex (IKA - Đức)

Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh)

Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức)

Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản)

Lò Viba (Electrolux)

Tủ sấy (Jencons-Anh)

Máy điện di (Biorad)

Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển)

Đầu tuýp các loại (Đức)

Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản)

Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ)

Máy PCR (BioRad – Thụy Điển)

Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu đước đôi thu được

Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Định lượng DNA bằng quang phổ kế

 Giai đoạn 2: tối ưu hóa kỹ thuật RAPD với các mẫu DNA thu được

Khảo sát nồng độ Mg2+

Khảo sát nồng độ primer

 Giai đoạn 3: thực hiện phản ứng RAPD với các mẫu đước thu được

 Giai đoạn 4: phương pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc

3.3.2 Phương pháp ly trích DNA

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng

số trên 3 quy trình:

Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tươi của Doyle và Doyle (1988) [9]

Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến [9]

Quy trình 3: Quy trình cải tiến từ quy trình 1 và quy trình 2

o Bước 3: chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 2

o Bước 4: chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 l RNase, ủ ở 370

C trong 1 giờ

o Bước 5: thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh Để tủa ở –200C

khoảng 30 phút (Nên để qua đêm)

o Bước 6: li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 100

C Đổ bỏ dịch trong

o Bước 7: cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 1giờ

o Bước 8: thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để -200C trong 30 phút

o Bước 12: bảo quản mẫu ở 40C

3.3.2.2 Quy trình 2 [9]

Mẫu lá được ly trích theo quy trình ly trích mẫu tươi của Doyle và Doyle,

1988 được cải tiến bởi Lâm Vỹ Nguyên, 2006

o Bước 1: lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf

o Bước 2: thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600-800 vòng/phút) Ủ qua đêm ở 550C

o Bước 3: ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C Thu dịch nổi

o Bước 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C Thu dịch nổi

o Bước 5: lập lại bước 4 Thu được V l dịch nổi

o Bước 6: thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh Đảo trộn kỹ Ủ -200C trong 90 phút

o Bước 7: ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa

o Bước 8: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C Đổ bỏ dịch trong

o Bước 9: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C Đổ bỏ dịch trong

o Bước 10: phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng

o Bước 11: hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C đến khi kết tủa tan hoàn toàn (Có thể ủ qua đêm)

o Bước 12: bảo quản mẫu ở -200C

3.3.2.3 Quy trình 3