Phân Lập Vi Khuẩn Xanthomonas Spp. Gây Bệnh Đốm Lá Trên Cây Hoa Hồng (Rosa Spp.) Và Cây Ớt (Capsicum Spp.) Tại Tỉnh Đồng Tháp Và Tuyển Chọn Vi Khuẩn Đối Kháng Phòng Trị Bệnh.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ UYỂN THANH PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG (Rosa spp ) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp ) TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN V[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ UYỂN THANH

PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp.

GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG

(Rosa spp.) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp.) TẠI

TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÒNG TRỊ BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 62420201

NĂM 2022

MỤC LỤC

Tóm tắt ii

Abstract iv

Chương 1: Đặt vấn đề 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của luận án 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Tính mới của luận án 2

1.5 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 2

1.5.1 Phạm vi nghiên cứu 2

1.5.2 Đối tượng nghiên cứu 3

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.6.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 2: Tổng quan tài liệu 4

2.1 Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật 4

2.1.1 Tác nhân gây bệnh 4

2.1.2 Triệu chứng bệnh 5

2.1.3 Quản lý bệnh 5

2.2 Sơ lược về cây hoa hồng và cây ớt 6

2.2.1 Cây hoa hồng 6

2.2.2 Cây ớt 7

2.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp 7

2.3.1 Tương tác của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp 7

2.3.2 Cộng đồng vi khuẩn trong đất ngập nước 9

2.4 Một số cơ chế kiểm soát bệnh thực vật của các dòng vi khuẩn từ đất 12

2.5 Các nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh đốm lá do Xanthomonas sp trên hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt 12

2.5.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng 12

2.5.2 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt 16

2.6 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát mầm bệnh do Xanthomonas spp gây ra trên cây trồng 18

2.6.1 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát

Xanthomonas citri subsp citri trên cây có múi 19

2.6.2 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv campestris trên cây trồng họ cải 20

2.6.3 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv campestris trên cây cà chua và ớt 22

2.6.4 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát các loài Xanthomonas spp khác 23

2.6.5 Kỹ thuật MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desraction Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry) và MLSA (Multilocus sequence analysis) trong nghiên cứu định danh vi khuẩn 24

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu 28

3.1 Vật liệu 28

3.1.1 Thời gian và địa điểm 28

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị và Môi trường nuôi cấy 28

3.1.3 Mẫu bệnh cây 29

3.1.4 Vật liệu thí nghiệm 29

3.1.4.1 Giống cây 29

3.1.4.2 Mẫu cơ chất hoặc đất 29

3.1.4.3 Vật liệu trồng cây 30

3.2 Phương pháp 30

3.2.1 Nội dung 1: Phân lập và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt 32

3.2.1.1 Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng chuyên canh các loại cây trồng đã được chọn tại tỉnh Đồng Tháp 32

3.2.1.2 Phân lập, tách ròng vi khuẩn Xanthomonas spp từ các mẫu bệnh 32

3.2.1.3 Khảo sát khả năng gây bệnh trên các cây trồng đã chọn của các dòng Xanthomonas spp gây bệnh 33

3.2.1.4 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp dựa vào hình thái và phương pháp sinh hóa 35

3.2.1.5 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp theo phương pháp MALDI-TOF-MS 36

3.2.1.6 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp theo kỹ thuật

Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis –

MLSA) 37

3.2.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có nguồn gốc từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp gây bệnh đã được phân lập 39

3.2.2.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu đất thu được 39

3.2.2.2 Khảo sát khả năng đối kháng in vitro trước các dòng Xanthomonas spp được chọn của những dòng vi khuẩn phân lập được từ mẫu đất 40

3.2.2.3 Định danh một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng 42

3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng 43

3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh (BCA) ở điều kiện ngoài đồng 46

3.2.5 Phương pháp lây nhiễm bệnh 47

3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 47

Chương 4: Kết quả và thảo luận 48

4.1 Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn 48

4.1.1 Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây hoa hồng tại tỉnh Đồng Tháp 48

4.1.1.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp gây bệnh trên cây hoa hồng 48

4.1.1.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây hoa hồng của các dòng Xanthomonas spp được phân lập 48

4.1.1.3 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo phương pháp MALDI-TOF-MS 54

4.1.1.4 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis – MLSA) 55

4.1.2 Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp 59

4.1.2.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp gây bệnh trên cây ớt 59

4.1.2.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây ớt của các dòng Xanthomonas spp được phân lập 60

4.1.2.3 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt theo hình thái,

sinh hóa và sinh học phân tử 664.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với

Xanthomonas spp được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng

sinh thái bản địa 674.2.1 Phân lập vi khuẩn 67

4.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng Xanthomonas spp gây

bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện in vitro 68 4.2.2.1 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây hoa hồng của vi khuẩn phân lập từ cơ chất vùng rễ 68

4.2.2.2 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây hoa hồng của vi khuẩn phân lập từ đất vùng sinh thái

bản địa tỉnh Đồng Tháp 70

4.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng Xanthomonas spp gây

bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện in vitro 73 4.2.3.1 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây ớt của vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ 73

4.2.3.2 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây ớt của vi khuẩn phân lập từ đất vùng sinh thái bản địa 764.2.4 Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng 784.2.4.1 Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng dựa vào kỹ thuật phân

tích MALDI-TOF-MS 784.2.4.2 Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng dựa vào kỹ thuật phân

tích Sinh học phân tử 814.2.5 Khảo sát mật độ đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng triển

vọng đối với Xanthomonas spp XP17 và XR13 84

4.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn

trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng 894.3.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa

hồng trong điều kiện nhà lưới 894.3.1.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa

hồng trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng

triển vọng từ cơ chất vùng rễ 90

4.3.1.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa

hồng trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng

triển vọng từ vùng sinh thái bản địa 944.3.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt

trong điều kiện nhà lưới 994.3.2.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt

trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển

vọng từ cơ chất vùng rễ 994.3.2.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt

trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển

vọng từ vùng sinh thái bản địa 1024.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên

cây hoa hồng và cây ớt ở điều kiện ngoài đồng 1064.4.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa

hồng ở điều kiện ngoài đồng 1064.4.1.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa

hồng ở điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng

triển vọng từ cơ chất vùng rễ 1064.4.1.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa

hồng ở điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng

triển vọng từ vùng sinh thái bản địa 1094.4.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở

điều kiện ngoài đồng 1064.4.2.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở

điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng

từ cơ chất vùng rễ 1064.4.2.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở

điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng

từ vùng sinh thái bản địa 109

Chương 5: Kết luận và đề xuất 120

5.1 Kết luận 120

5.1.1 Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp.

gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng giống hồng lửa (Rosa spp.) và

cây ớt (Capsicum spp.) 120

5.1.2 Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát

bệnh đốm lá vi khuẩn do Xanthomonas spp gây ra 120

5.2 Đề xuất 121

Tài liệu tham khảo 122 Phụ lục

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Các thí nghiệm khảo sát khả năng gây hại trong điều kiện

nhà lưới 34Bảng 3.2: Trình tự các đoạn mồi phục vụ phương pháp phân tích trình

tự đa locus (MLSA) 38Bảng 3.3: Mật độ vi khuẩn đối kháng ban đầu (CFU/mL) trước khi được

pha loãng 42Bảng 3.4: Các thí nghiệm khảo sát khả năng kiểm soát bệnh trong điều

kiện nhà lưới 43Bảng 3.5: Các thí nghiệm khảo sát khả năng kiểm soát bệnh ở điều kiện

ngoài đồng 46Bảng 4.1: Tỷ lệ bệnh (DI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát

gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây hoa hồng trong

điều kiện nhà lưới 49Bảng 4.2: Chỉ số bệnh (SI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát

gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây hoa hồng trong

điều kiện nhà lưới 51

Bảng 4.3: Danh pháp ba dòng Xanthomonas spp (XR9, XR13, XR18)

dựa vào kỹ thuật MALDI-TOF-MS 55

Bảng 4.4: Kết quả BLASTN trình tự sáu gen housekeeping (fusA, gap1,

gltA, gyrB, lacF, lepA) của dòng Xanthomonas sp XR13 gây

bệnh trên cây hoa hồng 56Bảng 4.5: Giá trị ma trận tương đồng (Similarity matrix values - %)

giữa dòng Xanthomonas axonopodis XR13 và các dòng

Xanthomonas spp trong cùng nhánh phát sinh loài 59

Bảng 4.6: Tỷ lệ bệnh (DI) đốm lá vi khuẩn gây ra bởi 20 dòng

Xanthomonas spp trên cây ớt 61

Bảng 4.7: Chỉ số bệnh (SI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát

gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây ớt trong điều

kiện nhà lưới 63

Bảng 4.8: Khả năng đối kháng in vitro của 14 dòng vi khuẩn đối với

ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa

hồng (Rosa spp.) 68

Bảng 4.9: Đường kính vùng ức chế của 17 dòng vi khuẩn đối kháng

triển vọng đối với 3 dòng Xanthomonas spp (XR13, XR9,

XR18) gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng 71Bảng 4.10: Đường kính vùng ức chế của 14 dòng vi khuẩn vùng rễ đối

kháng đối với 3 dòng Xanthomonas spp (XP17, XP7, XP1)

gây bệnh đốm lá trên cây ớt 74Bảng 4.11: Đường kính vùng ức chế của 13 dòng vi khuẩn vùng sinh

thái bản địa đối với 3 dòng Xanthomonas spp (XP17, XP7,

XP1) gây bệnh đốm lá trên cây ớt 77Bảng 4.12: Danh pháp một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng dựa

vào kỹ thuật MALDI-TOF-MS 80Bảng 4.13 : Kết quả BLASTN các trình tự của các dòng vi khuẩn đối

kháng triển vọng 82Bảng 4.14: Đường kính vùng ức chế (mm) do các dòng vi khuẩn đối

kháng đối với Xanthomonas spp XP17 hoặc XR13 85

Bảng 4.15: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây

hoa hồng của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16, BR37,

BR88) sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 91Bảng 4.16: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và AUDPC

khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16, BR37,

BR88) sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 92Bảng 4.17: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây

hoa hồng của vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24)

sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 96Bảng 4.18: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và AUDPC

khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24)

sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 97Bảng 4.19: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây

ớt của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BP11, BP49, BP103)

sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 100Bảng 4.20: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt và AUDPC khi xử

lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (BP11, BP49, BP103)

sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 101Bảng 4.21: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây

ớt của vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) sau 16

NSKLN trong điều kiện nhà lưới 103

Bảng 4.22: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt và AUDPC khi xử

lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) sau 16

NSKLN trong điều kiện nhà lưới 104Bảng 4.23: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây

hoa hồng của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16, BR37,

BR88) ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 107Bảng 4.24: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và AUDPC

khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16, BR37,

BR88) ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 108Bảng 4.25: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây

hoa hồng của vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24)

ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 110Bảng 4.26: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và AUDPC

khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24)

ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 111Bảng 4.27: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây

ớt của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BP11, BP49, BP103)

sau 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 114Bảng 4.28: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt và chỉ số tích lũy

bệnh theo thời gian khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển

vọng (BP11, BP49, BP103) sau 16 NSKLN ở điều kiện ngoài

đồng 115Bảng 4.29: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây

ớt của vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) sau 16

NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 117Bảng 4.30: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt và AUDPC khi xử

lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) sau 16

NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 118

rễ và các quá trình hiếu khí và kỵ khí liên quan đến sự tái sinh

các nguyên tố, cũng như sự phát thải methane từ đất ngập

nước (Paul et al., 2013) 11 Hình 2.4: Những triệu chứng của bệnh đốm lá vi khuẩn trên Rosa

RADtko (tráit) and RADrazz (phải) tại Hoa Kỳ (Huang et al.,

2013) 13

Hình 2.5: Sự phát sinh loài của các dòng rosa của chi Xanthomonas dựa

trên các dữ liệu kết nối của các đoạn gen fusA, gap-1, gltA,

gyrB, lacF, và lepA (Huang et al., 2013) 15

Hình 2.6: Các triệu chứng đốm vi khuẩn trên cây ớt và lá cà chua được

dòng dòng vi khuẩn CNUPBL 2039 17Hình 2.7: Sơ đồ hiển thị quy trình hoạt động trong MALDI-TOF-MS 26Hình 3.1: Quy trình thí nghiệm được sử dụng trong đề tài 30Hình 3.2: Hình dạng đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng giống hồng lửa

(A), cây ớt (B) 32Hình 3.3: Hình dạng tiết dịch khuẩn gây bệnh từ vết cắt ngang mẫu

bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng (A), kỹ thuật hộp ria

(Burgess et al 2009) (B) 33

Hình 3.4: Vị trí thu mẫu tại vườn Quốc gia Tràm Chim (A), thu 9 mẫu

(B) 39Hình 3.5: Các thao tác khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn gây

bệnh của dòng vi khuẩn phân lập từ đất 40

Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đốm lá vi khuẩn trên Rosa spp và khuẩn

lạc vi khuẩn gây bệnh 48Hình 4.2: Tỷ lệ bệnh (DI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát

gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây hoa hồng trong

điều kiện nhà lưới 50Hình 4.3: Chỉ số bệnh (SI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát

gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây hoa hồng trong

điều kiện nhà lưới 52

Hình 4.4: Biểu đồ hộp thể hiện tỷ lệ bệnh (A), chỉ số bệnh (B), chỉ số

AUDPC (C) từ các dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới 53Hình 4.5: Khả năng gây bệnh của ba dòng vi khuẩn (XR9, XR13, XR18)

gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới 54

Hình 4.6: Kết quả điện di trình tự sáu gen housekeeping của dòng

Xanthomonas axonopodis XR13 gây bệnh trên cây hoa hồng 57

Hình 4.7: Phát sinh loài của dòng Xanthomonas axonopodis XR13 gây

bệnh trên cây hoa hồng dựa trên trình tự nối của các gen fusA,

gap-1, gltA, gyrB, lacF và lepA 58

Hình 4.8: Đặc điểm của vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên Capsicum spp.

và khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh 60Hình 4.9: Tỷ lệ bệnh (DI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát

gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây ớt trong điều

kiện nhà lưới 62Hình 4.10: Chỉ số bệnh (SI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo

sát gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây ớt trong

điều kiện nhà lưới 64Hình 4.11: Biểu đồ hộp thể hiện tỷ lệ bệnh (A), chỉ số bệnh (B), chỉ số

AUDPC (C) từ các dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới 65Hình 4.12: Khả năng gây bệnh của ba dòng vi khuẩn (XR9, XR13,

XR18) gây bệnh đốm lá trên cây ớt trong điều kiện nhà lưới 66Hình 4.13: Hình 4.13: Đặc điểm triệu chứng bệnh và Gram âm của ba

dòng XP1, XP7, XP17 67Hình 4.14: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn

vùng rễ đối với ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây hoa hồng 69Hình 4.15: Hiệu quả của các dòng vi khuẩn đối kháng (BR16, BR37,

BR88) đối với ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây hoa hồng 70Hình 4.16: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn

vùng sinh thái bản địa đối với ba dòng Xanthomonas spp gây

bệnh đốm lá trên cây hoa hồng 72Hình 4.17: Hiệu quả đối kháng của một số dòng vi khuẩn đối kháng đối

với ba dòng vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas spp 73

Hình 4.18: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn

vùng rễ đối với ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá

trên cây hoa hồng 75Hình 4.19: Hiệu quả đối kháng của vi khuẩn vùng rễ triển vọng (BP11,

BP49, BP103) đối với ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh

đốm lá trên cây ớt 76Hình 4.20: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn

vùng sinh thái bản địa đối với ba dòng Xanthomonas spp gây

bệnh đốm lá trên cây hoa hồng 78Hình 4.21: Hiệu quả đối kháng của vi khuẩn vùng sinh thái bản địa triển

vọng (G24, T11, T188) đối với ba dòng Xanthomonas spp.

(XP17, XP7, XP1) gây bệnh đốm lá trên cây ớt 78Hình 4.22: Kết quả điện di của gen 16S rRNA của một số dòng vi khuẩn

đối kháng triển vọng 81

Hình 4.23: Biểu đồ thể hiện đường kính vùng ức chế Xanthomonas spp.

của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng theo các mật độ

pha loãng khác nhau 86

Hình 4.24: Biểu đồ thể hiện đường kính vùng ức chế Xanthomonas spp.

của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng theo các mật độ

pha loãng khác nhau 88

Hình 4.25: Đường kính vùng ức chế Xanthomonas spp của vi khuẩn

đối kháng triển vọng 89Hình 4.26: Hiệu quả kiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng

triển vọng (BR88) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa

hồng sau 16 NSKLN 93Hình 4.27: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng

(G24) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng sau 16

NSKLN 98Hình 4.28: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng

(BP103) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt sau 16 NSKLN

102Hình 4.29: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng

(G24) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt sau 16 NSKLN

105

Hình 4.30: Hiệu quả kiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng

triển vọng (BR16, BR37, BR88) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn

ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 109Hình 4.31: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng

(X61, T265, G24) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn ở 16 NSKLN

ở điều kiện ngoài đồng 112Hình 4.32: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng

(BP103) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiện

ngoài đồng sau 16 NSKLN 116Hình 4.33: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng

(G24) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiện

ngoài đồng sau 16 NSKLN 119

CBB: Cassava bacterial blight (Bệnh bạc lá do vi khuẩn trên cây sắn)

fusA: translation elongation factor G gene

gap-1: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene

gltA: citrate synthase gene

gyrB: DNA gyrase subunit B gene.

IAA: Indole – 3 – acetic acid

MS: mass spectrometry

MALDI-TOF-MS: Matrix Assisted Laser Desraction Ionization

Time-Of-Flight mass spectrometry

ML: Maximum Composite Likelihood

MLSA: Multilocus sequence analysis

NT: Nghiệm thức

NSKLN: Ngày sau khi lây nhiễm

lacF: ABC transporter sugar permease gene

lepA: GTP binding protein gene

PGPB (Plant Growth Promoting Bacteria)

PMF: peptide mass fingerprint

Xam: X axonopodis pv manihotis

Xap: X axonopodis pv passiflorae

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, sản xuất nông nghiệp phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng thuốc bảo

vệ thực vật nhờ chúng đạt hiệu quả nhanh chóng Thực trạng biến đổi khí hậu ngày càngkhiến canh tác nông nghiệp gặp nhiều khó khăn như cây trồng sinh trưởng phát triểnkhông hiệu quả, dịch bệnh dễ bùng phát, và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càngtrở nên trầm trọng Tại Đồng Tháp, gần đây đã xuất hiện nhiều dịch bệnh nghiêm trọng

Trong đó, bệnh đốm lá vi khuẩn do chi Xanthomonas gây ra trên hai loài cây trồng chủ

lực của tỉnh là cây ớt và cây hoa hồng là đặc biệt nghiêm trọng Đối với các nông hộ thunhập chính từ hai loài cây này, nông dân đã tiến hành canh tác liên tục trong năm đểtăng thu nhập, kết hợp với việc mở rộng không ngừng vùng chuyên canh đã tạo điềukiện thuận lợi cho nhiều mầm bệnh phát triển và gây hại Bên cạnh đó, biện pháp chiếtnhánh cây hoa hồng để giữ giống hoặc sử dụng hạt giống ớt không kiểm soát nguồn gốc

đã giúp bệnh lưu tồn và lây lan từ vụ này sang vụ khác Để đối phó với bệnh đốm lá vikhuẩn, khi bệnh mới phát nên nhổ bỏ ngay cây bệnh và hạn chế tưới nước, nên phunngay các loại thuốc hóa học đặc trị vi khuẩn (Cúc & Thủy, 2014) Tuy nhiên, thuốckháng sinh và thuốc bảo vệ thực vật thường được sử dụng vượt ngưỡng cho phép, gâyngộ độc cho cây, sẽ rất tốn kém, có hại cho thiên địch và các vi sinh vật có lợi, gây ô

nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Robison et al., 2006; Adesemoye et al., 2009) và dễ làm mầm bệnh kháng thuốc Do đó, cần tập trung nghiên

cứu phát triển các phương pháp mới giúp kiểm soát bệnh cây trồng một cách bền vững(Gerhardson, 2002), tiết kiệm chi phí và hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật

Trong trường hợp này, kiểm soát sinh học (biological control) ứng dụng vi khuẩnkiểm soát bệnh (Biological control agent- BCA) là một chiến lược quan trọng trong việc

quản lý canh tác một cách bền vững và giảm các vấn đề về môi trường (Bale et al., 2008; Adesemoye et al., 2009; Hungria et al., 2010; 2013) Các chế phẩm vi sinh vật được sử

dụng hiệu quả nhằm giảm bệnh hại trên lá hoặc sau thu hoạch ở các loại cây ngũ cốc,

rau, cây ăn trái, cây hoa, cây cảnh (Cawoy et al., 2011) Chúng phân tán nhanh hơn vào

môi trường và thường ít độc hơn đối với các loài không phải mục tiêu Ngoài ra, vì sửdụng các phương thức tác động khác với thuốc bảo vệ thực vật thông thường nên chúng

có thể giúp ngăn chặn các mầm bệnh kháng thuốc (Bhattacharyya et al., 2016; Marasco

et al., 2012).

Trước đây, đa số các diện tích ẩm, lầy thấp ở Đồng Tháp được bao phủ bởi rừngrậm, và cây tràm được xem là đặc thù Hiện nay, tại Đồng Tháp rừng đặc dụng đượcphân bổ ở các khu vực được bảo tồn như Vườn Quốc Gia Tràm Chim, Khu di tích XẻoQuýt, Khu du lịch sinh thái Gáo Giồng) Những khu vực này do được bảo tồn khỏi cáchoạt động của con người, đặc biệt là hoạt động nông nghiệp nên hệ vi sinh vật có thể

còn rất đa dạng Bên cạnh vi khuẩn vùng rễ, đây là nguồn tài nguyên quý giá phục vụcho công tác tuyển chọn các dòng vi sinh vật kiểm soát bệnh hiệu quả.

Xuất phát từ những hiện trạng trên, luận án “Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh đồng

tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh” đã được thực hiện

1.2 Mục tiêu của luận án

Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.).

Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi

khuẩn do Xanthomonas spp gây ra.

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây hại và xác định các dòng vi khuẩngây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng giống hồng lửa và cây ớt

Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp.

được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa

Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiệnnhà lưới của những dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng

Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh tiềm năng

ở điều kiện ngoài đồng

1.4 Tính mới của luận án

Nghiên cứu đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây ớt nhờ vào các kỹ thuật sinh hóa,

MALDI-TOF-MS và sinh học phân tử như multilocus sequence analysis (MLSA)

Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận B velezensis (BR16), B subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp (BP11, X32), Enterobacter spp (T11), Serratia spp (X16)

có khả năng đối kháng đáng kể, đặc biệt, nghiên cứu đã tuyển chọn được B.

amyloliquefaciens BR88, B velezensis BP103, B subtilis G24 có khả năng kiểm soát

bệnh đốm lá vi khuẩn hiệu quả nhất dựa trên các thí nghiệm sàng lọc in vitro, nhà lưới,

ngoài đồng, và được xác định danh pháp bằng kỹ thật phân tích MALDI-TOF-MS vàSinh học phân tử Các dòng vi khuẩn này có thể được sử dụng như tác nhân sinh họcphòng trị bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt

1.5 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu

1.5.1 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm khi phân lập vi khuẩn

gây bệnh và tuyển chọn in vitro các dòng vi khuẩn đối kháng.

Nghiên cứu đánh giá khả năng gây hại của các dòng Xanthomonas spp và đánh

giá hiệu quả kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn đối kháng được thực hiện ở điềukiện nhà lưới và ngoài đồng

1.5.2 Đối tượng nghiên cứu

Giống cây hoa hồng giống hồng lửa và cây ớt chỉ thiên được sử dụng trong thínghiệm, đây là giống cây được người dân trồng phổ biến tại tỉnh Đồng Tháp và đượcngười dân đánh giá là giống có tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất Bên cạnh đó, vi khuẩn gâybệnh và vi khuẩn đối kháng được phân lập từ tỉnh Đồng Tháp

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Việc phân tích khả năng gây hại của mầm bệnh và khả năng đối kháng của cácdòng vi khuẩn được phân lập trên cơ sở các kết quả đã được xử lý bằng các phân tíchkhoa học trên phần mềm đã được công nhận đã cung cấp một nguồn thông tin khoa học,tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo

1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học hướng đến sử dụng các dòng vi khuẩnđối kháng triển vọng trong kiểm soát bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt trongđiều kiện sản xuất thực tế, phục vụ sự phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật

2.1.1 Tác nhân gây bệnh

Bệnh do vi khuẩn gây ra là một trong những trở ngại khó kiểm soát và dễ tái phátnhất đối với các vụ mùa trên khắp thế giới Nguyên nhân là do sự tăng sinh nhanh chóng,

sự khó khăn trong quản lý, các vấn đề phát sinh khi kiểm soát bằng thuốc hóa học, và

sự thiệt hại nghiêm trọng của các trang trại bị nhiễm bệnh (Sundin et al., 2016).

Xanthomonas là một chi vi khuẩn lớn gây bệnh trên thực vật, có phản ứng gram âm,

hình que và sắc tố vàng Chi này gây bệnh trên 400 loài vật phân bố trên toàn thế giới

và là tác nhân gây bệnh cho một số cây trồng quan trọng về kinh tế như: lúa (rice), camquýt (citrus), sắn (cassava), cà chua (tomato), mía đường (sugar cane), chanh dây

(passionfruit), chuối (banana) (Ryan et al., 2011; Rodriguez et al., 2012) Vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas có thể tương tác với cây chủ bằng nhiều phương thức, chúng có

thể tồn tại trong đất, hạt giống, tàn tích cây trồng, tương tác với côn trùng và đặc biệt là

có thể sống độc lập với cây chủ Những hình thức sinh tồn này tạo điều kiện cho sự pháttriển của dịch bệnh (Marcuzzo, 2009)

Một số Xanthomonas spp gây bệnh cho các loài cây thuộc họ Rosaceae đã được báo cáo, như Xanthomonas fragariae trên dâu tây (Roberts et al., 1997), X pruni trên đào (Wert et al., 2006) Tuy nhiên, rất ít báo cáo về Xanthomonas spp gây bệnh về hoa hồng (Rosa spp.), một thành viên của họ Rosaceae, bước đầu ghi nhận dòng vi khuẩn này trên cây hoa hồng thuộc loài Xanthomonas euvesicatoria (Huang et al 2013; Barak

et al., 2016).

Trên họ Solanaceae, Jones et al (2004) đã ghi nhận rằng tất cả vi khuẩn thuộc

Xanthomonas gây bệnh đốm lá vi khuẩn (bacterial spot Xanthomonas – BSX) được phân

thành 4 loài là X euvesicatoria, X vesicatoria, X perforans, và X gardneri Trong đó,

X euvesicatoria và X vesicatoria gây bệnh trên cả ớt và cà chua (Jones et al., 2004).

Trong khi, một số loài Xanthomonas spp chỉ gây bệnh trên cà chua như X perforans and X gardneri Tuy nhiên, gần đây Potnis et al (2015) lại ghi nhận X perforans đã xuất hiện trên ớt Tại Hàn Quốc, Myung et al (2015) và Kyeon et al (2016) đã ghi nhận

Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh trên ớt (Capsicum sp.).

Các vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas lây nhiễm và gây bệnh trên nhiều loài thực

vật nhờ vào các nhân tố lây nhiễm như các polysaccharide bề mặt, các chất có khả năngkết dính, các hệ thống tiết và phản ứng siêu nhạy cảm khác nhau, các chất độc, các chứcnăng liên quan làm mất tác dụng các hợp chất kháng khuẩn của cây trồng tiết ra, và khảnăng thu nhận chất dinh dưỡng (Agrios, 2005)

2.1.2 Triệu chứng bệnh

Những triệu chứng bệnh điển hình của bệnh đốm lá vi khuẩn như: dưới dạng nhữngđốm nhỏ, ngấm nước, phát triển thành những đốm hoại tử bất thường và có góc cạnh,thường có đường kính từ 1,58 mm (1/16 inch) đến 6,35 mm (1/4 inch) Những đốm này

có trung tâm màu xám nhạt và mép nâu tối, được bao quanh bởi các vòng màu vàng hẹp

(Lowell et al., 1991; Agrios, 2005; Nguyễn Thị Thu Cúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014).

Mô ở trung tâm của đốm có thể khô và rụi đi, tạo ra một “lỗ hỏng” (shot–hole) Trongđiều kiện ẩm ướt và mưa liên tục, các vết thương sẽ lan rất nhanh, giữ màu xanh đậm,

và bị ngấm nước Nhiều đốm có thể kết hợp lại và gây ra vết hoại tử lớn Cuối cùng, lá

biến màu vàng và rụng sớm (Myung et al., 2009; Huang et al., 2013).

Hình 2.1: Mẫu bệnh đốm lá vi khuẩn trên lá hoa hồng (A), ớt (B).

Các dòng vi khuẩn này thường không lưu tồn trong đất nhưng có thể tồn tại trongmột năm hoặc lâu hơn trên trong hạt Cây con có thể bị nhiễm bởi gió hoặc nước bắnlên từ các cây bệnh lân cận Các cây ghép bị nhiễm bệnh được đưa vào cánh đồng cóthể đóng vai trò như nguồn gốc ban đầu của bệnh Vi khuẩn này cũng có thể sống trêntàn dư cây ớt và cà chua từ vụ mùa trước hoặc tồn tại trên cỏ dại (Agrios, 2005; NguyễnThị Thu Cúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014) Tưới phun một cách thường xuyên, trongđiều kiện ấm áp, hoặc mưa to và kéo dài sẽ gây ra sự bùng phát bệnh nghiêm trọng Tất

cả các tác nhân như gió, giọt mưa rơi, hoặc nước tưới, sự chuyển động của thiết bị xịt

áp suất, và cả việc xử lý cây ướt đều hỗ trợ sự lây lan của vi khuẩn trên đồng ruộng Sựlan truyền bệnh trong một cánh đồng thường có thể tương quan với hướng gió thổi Sựlây nhiễm xảy ra thông qua các lỗ tự nhiên (stomates) hoặc thông qua các vết thươngtrên lá và thân cây do côn trùng gây ra hoặc do cọ xát (Nguyễn Thị Thu Cúc và TrầnThị Thu Thủy, 2014) Bệnh phát triển mạnh khi ở điều kiện độ ẩm cao và kéo dài, nhiệt

độ cao dao động từ 200C đến 350C Nhiệt độ ban đêm từ 240C đến 280C giúp phát triểnbệnh tật trong khi nhiệt độ ban đêm thấp (160C) ngăn chặn sự phát triển của bệnh bất kểnhiệt độ ban ngày Nồng độ nitơ cao thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn trên cây Cácdòng khác nhau của vi khuẩn có thể được xác định dựa trên phạm vi và các triệu chứngcủa ký chủ

2.1.3 Quản lý bệnh

Bệnh do các loài Xanthomonas spp thường bắt đầu với hạt giống bị nhiễm, mặc

dù mầm bệnh có thể được truyền sang cây khỏe mạnh bằng các hoạt động canh tác trong

nông nghiệp như cắt tỉa và phun sương cho luống trồng, nước mưa, nhiễm trong đất và

có thể do côn trùng (Ryan et al., 2011) Nhìn chung, việc kiểm soát sự lây nhiễm trùng

do các mầm bệnh khác nhau của chi Xanthomonas được thực hiện bằng cách sử dụng

các loài hoặc giống ít nhiễm bệnh hơn, sử dụng các tấm chắn gió, khử trùng thiết bị vàdụng cụ canh tác, bổ sung các hóa chất gốc đồng và loại bỏ các cây bị nhiễm bệnh (Liu

et al., 2016) Tuy nhiên, những biện pháp này là chưa thật sự hiệu quả, do sự tích tụ của

chất hóa học trong môi trường, khả năng nhiễm bệnh của các giống được cho là kháng

bệnh và những tổn thất về diện tích cây trồng (Pernezny et al., 2012; Dewdney &

Graham, 2017)

Tại Đồng Tháp, khi vi khẩn gây bệnh đã xâm nhập được vào ruộng ớt hoặc hoahồng thì cực kỳ khó kiểm soát Do đó, việc ngăn ngừa lây nhiễm mầm bệnh từ các câyghép hoặc cây trung gian là rất quan trọng Khi mua cây con cần đảm bảo được nguồngốc và được kiểm tra, chứng nhận là không bị bệnh Luân canh với cây trồng khác họ.Tiêu hủy những tàn dư trước khi vào mùa vụ tiếp theo Kiểm soát cỏ dại bên trong vàxung quanh các cánh đồng Thiết lập và duy trì một chương trình sinh sản cân bằng đất

(Burgess et al., 2009, Cúc & Thủy, 2014) Ngoài ra, tránh tình trạng sinh trưởng quá

mức, đặc biệt là trước khi ra quả, vì điều này có thể dẫn đến việc có quá nhiều lá và tăngmức độ nghiêm trọng của bệnh Hạn chế tưới phun Sau khi trồng cây có thể sử dụngcác hợp chất chứa đồng như dung dịch Bordeaux trước khi xuất hiện bệnh Tiếp tụcphun lên lá theo lịch trình từ 7 đến 10 ngày Thuốc xịt áp dụng cho cây trồng trước khimưa hoặc tưới tiêu là có lợi nhất Ngoài ra còn có thể sử dụng các chế phẩm vi sinh vàoviệc quản lý, cũng như quản lý dịch hại tổng hợp (Agrios, 2005)

2.2 Sơ lược về cây hoa hồng và cây ớt

2.2.1 Cây hoa hồng

Cây hoa hồng (Rosa spp.) thuộc họ Rosaceae Cây có xuất xứ từ ôn đới và bán

nhiệt đới Ở nước ta, cây hoa hồng được trồng ở nhiều vùng trên cả nước Theo NguyễnXuân Linh (1998), hoa hồng gồm hơn 300 loài được phân bố ở khắp bán cầu Hoa hồngđược trồng đầu tiên ở Trung Quốc và sau đó du nhập qua Châu Âu, và chính nơi đây,chúng được lai tạo thành các giống hoa hồng như ngày nay

Cây hoa hồng có rễ thuộc rễ chùm, chiều ngang tương đối rộng và khi bộ rễ lớn sẽphát sinh nhiều rễ phụ Thân cây thuộc nhóm cây thân gỗ, cây bụi thấp, thẳng, có nhiềucành và gai cong Cây ưa khí hậu ôn hòa, nhiệt độ sinh trưởng phát triển tốt là vàokhoảng 18 – 250C Đất trồng loài cây này phải cao ráo, thoát nước tốt, pH từ 5,6 – 6,5(Phạm Văn Duệ, 2005; Nguyễn Xuân Linh, 1998) Yêu cầu ẩm độ đất khoảng 60 – 70%,

độ ẩm không khí vào khoảng 80- 85%

Tại Đồng Tháp, cây hoa hồng được trồng chủ yếu ở Làng hoa Sa Đéc với nhiềugiống như hồng nhung, hồng lửa (hay hồng Pháp), hồng tỉ muội, hồng tường vi,… Trong

đó, hồng nhung và hồng lửa chiếm đa số và mang lại giá trị kinh tế cao cho người nôngdân Tuy nhiên, việc trồng hoa thâm canh và ngày càng mở rộng đã tạo điều kiện chonhiều loại sâu bệnh có cơ hội phát sinh, phát triển, lây lan và gây hại (Nguyễn Thị ThuCúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014)

2.2.2 Cây ớt

Cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, bắt nguồn từ một sốloài hoang dại, được thuần hóa và trồng ở Châu Âu, Ấn Độ cách đây hơn 500 năm Cây

ớt được chia hai nhóm phổ biến là ớt (Capsicum frutescens L.) và ớt ngọt (Capsicum

annuum L.) (Glushenkova, 2012) Trong đó, cây ớt có dạng thân thảo, thân dưới hóa gỗ,

có nhiều cành, nhẵn; lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn; hoa mọc đơn độc ở kẽ lá

Ở nước ta, cây ớt được trồng ở nhiều nơi, thuộc nhóm cây gia vị có tiềm năng phát triểnrất lớn ở nước ta Cây ớt phát triển tốt ở đất thịt nhẹ, đất pha cát dễ thoát nước Hạt ớtnảy mầm ở 25-300C

Đồng Tháp (ĐT) là một trong những tỉnh có diện tích trồng ớt lớn nhất đòng bằngSông Cửu Long Năm 2013, diện tích trồng ớt của Đồng Tháp là 2.766 ha (chiếm hơn50% diện tích trồng ớt ở ĐBSCL và sản lượng đạt 30.428 tấn Đồng Tháp có điều kiện

tự nhiên phù hợp cho cây ớt phát triển và chất lượng cao, nhất là đất cồn ở huyện ThanhBình, năng suất trung bình 11 tấn/ha (giảm 26,7% so với năm 2012) Tuy nhiên, gần đâydiện tích và sản lượng ớt bị giảm do tình hình thời tiết bất lợi (ảnh hưởng biến đổi khíhậu) dẫn đến dịch bệnh xuất hiện thường xuyên trên cây ớt, đặc biệt là bọ trĩ, bệnh thánthư, bệnh do virus, bệnh héo xanh, đốm lá vi khuẩn, Dịch bệnh gây thiệt hại lớn vềnăng suất và chất lượng ớt, đến nay chưa có một quy trình quản lý dịch bệnh trên ớt hiệuquả, nông dân sử dụng thuốc hóa học là giải pháp phổ biến Hơn nữa, do thâm canh liêntục nhiều vụ, đất đai bị bạc màu trong khi nông dân không có tập quán sử dụng phânhữu cơ Điều này dẫn đến độ phì tự nhiên của đất giảm làm hạn chế năng suất của ớt(Võ Thị Thanh Lộc, 2015)

2.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp

2.3.1 Tương tác của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp

Một trong những thách thức chính trong thế kỷ XXI là làm sao canh tác cây trồngmột cách bền vững Những vi sinh vật liên quan đến cây trồng giữ chức năng sinh tháiquan trọng đối với đất và cây trồng Chức năng này bao gồm những ảnh hưởng củachúng lên sự sinh trưởng và sức sống; nâng cao được khả năng chịu đựng stress, hỗ trợkhả năng kháng bệnh; hỗ trợ sự hấp thu những dinh dưỡng có ích của cây trồng, và thúcđẩy đa dạng sinh học (Maheshwari, 2012) Hơn 150 năm qua, nhiều nghiên cứu đã chứngminh rằng vi khuẩn và nấm có một sự tương tác mật thiết với cây trồng, có thể kích thích

sự sinh trưởng, và ngăn chặn mầm bệnh cho cây trồng (Whipps, 2001)

Trong đó, vi khuẩn là một trong những sinh vật thích nghi nhất Sự tiến hóa củachúng trong suốt thời gian dài, và khả năng thích nghi đa dạng cao và trước các môitrường bất lợi, kết hợp với chọn lọc tự nhiên đã làm cho những vi sinh vật này có thểphục hồi tốt nhất trong các dạng sống trên hành tinh này Vì vậy, vi khuẩn trong đất đã

có những đóng góp thiết yếu trong việc duy trì sự cân bằng sinh thái Một trong những

sự phát triển đáng chú ý nhất của vi sinh vật trong thế kỷ XX là phát hiện vi khuẩn kíchthích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB), chúng cung cấpmột loạt các đặc tính có lợi cho cây trồng, qua đó tạo thuận lợi cho việc tăng năng suấtcây trồng một cách bền vững

Các loại đất tự nhiên có sự hiện diện của những quần thể vi sinh vật trong trạngthái cân bằng động Ước tính có khoảng 7,7 kg nấm và 18,1 kg vi khuẩn tồn tại trên mỗimẫu Anh (khoảng 0,4 hecta) Các vi sinh vật đất cạnh tranh với nhau về nguồn dinhdưỡng và không gian sống (Maheshwari, 2012) Chúng đóng vai trò trung tâm trongviệc điều khiển cách thức mà các hệ sinh thái trên mặt đất phản ứng với sự thay đổi khíhậu toàn cầu Cây trồng thường đáp ứng với nồng độ CO2 cao bằng cách tăng tạo rễ vàtiết dịch (Korner, 2000) Đa số các vi khuẩn có trong đất mang lại lợi ích cho cây trồng

bằng các con đường như: (i) Liên kết trực tiếp với rễ (mycorrhizae, vi khuẩn hình thành nốt); (ii) Phân hủy và giải phóng các chất khoáng từ các chất hữu cơ có trong đất làm tăng hàm lượng các chất sẳn có cho cây sử dụng; (iii) Ký sinh hoặc gây hại cho bệnh cây; (iv) Ức chế sự tăng trưởng, sinh sản, và hoạt động gây hại của bệnh hại nhờ vào các

tương tác ức chế hóa học của các vi sinh vật Các loại nấm và vi khuẩn này thường cótrong tất cả các loại đất tự nhiên

Tất cả các môi trường ảnh hưởng đến cây trồng ở mức vi mô, đặc biệt là vùng rễ

(rhizosphere) đều hiện diện một lượng lớn vi sinh vật (Berg et al., 2005) Khi kiểm tra

những dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường sống của cây trồng ghi nhận khoảng1% đến 35% dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng ức chế sự phát triển của các mầm

bệnh (Berg et al., 2002, 2006) Trong các dòng vi khuẩn được phân lập, tỷ lệ dòng vi

khuẩn biểu hiện đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật (PGPB) cao hơn nhiều và có

thể lên đến 2/3 quần thể (Furnkranz et al., 2009) Sự kích thích tăng trưởng thực vật có

thể đạt được bằng sự tương tác trực tiếp giữa các vi khuẩn có lợi và cây chủ và gián tiếp

do hoạt động chống lại mầm bệnh thực vật Phương thức hoạt động và khả năng sử dụng,tiềm năng cho các ứng dụng công nghệ sinh học được thể hiện trong hình 2.2

Hình 2.2: Sự tương tác giữa cây trồng và vi sinh vật kích thích sự sinh trưởng và sức

khoẻ cây trồng (Berg & Smalla, 2009)

Các vi khuẩn có lợi có thể được phân loại theo chức năng như: (i) kích thích sự tăng trưởng thực vật (plant–growth–promoting bacteria–PGPB); (ii) tác nhân kiểm soát

sinh học (biological control agents – BCA) Tác động trực tiếp của PGPB hoặc PGPR(plant–growth–promoting rhizobacteria) là kích thích tăng trưởng thực vật, trong khiảnh hưởng trực tiếp của BCA là để kiểm soát mầm bệnh, lần lượt cải thiện năng suấtcây trồng

Tuy nhiên, theo Avis et al (2008), PGPR và BCA có thể có tác dụng thứ cấp ở các cây trồng có quan hệ gần Ví dụ như chi Sinorhizobium (PGPB) nổi tiếng nhất với vai

trò chính là cố định đạm, và vì thế cải thiện sự sinh trưởng của cây trồng; Tuy nhiên,

loài Sinorhizobium cũng có liên quan đến sự ức chế bệnh bằng cách kích thích tăng tổng

hợp các hợp chất bảo vệ thực vật, dẫn đến kiểm soát mầm bệnh và kích kháng lưu dẫn

2.3.2 Cộng đồng vi khuẩn trong đất ngập nước

Các vùng đất ngập nước là một trong những hệ sinh thái quan trọng nhất trên tráiđất Hiện nay, sự đa dạng sinh học và khả năng sản xuất của hệ sinh thái này có giá trịlớn đối với cuộc sống trên hành tinh của chúng ta Tuy nhiên, tính đa dạng và chức năngcủa các cộng đồng vi sinh vật trong các hệ thống đất ngập nước rất ít được khảo sát so

với đất trên cạn và các hệ sinh thái dưới nước (Paul et al., 2013).

Sự phát triển quan trọng của vi sinh vật trong đất ngập nước ở thập kỷ đầu tiên củathế kỷ 21 đã được đánh giá bước đầu Trong đó, sự chuyển hóa của vi sinh vật ở vùng

đất ngập nước được đánh giá bởi Lamers et al (2012), cho thấy tác động của các hoạt

động vi sinh vật đối với sự sinh trưởng và năng suất thực vật Nhiều chuyển hóa sinhhọc được xúc tác bởi các vi khuẩn có thể kiểm soát thành phần thực vật ở vùng đất ngậpnước, đặc biệt là chuyển đổi nitrogen, lưu huỳnh và chuyển hóa sắt, như tác nhân làm

giảm sulfate (Pester et al., 2012), cố định nitrogen - diazotrophs (Lovell & Davis, 2012),

Giảm khí methan CH4 (methanotrophs) và khử dinitrogen monoxide N2O - denitrifiers(Kolb and Horn, 2012)

Theo Pester et al (2012), mặc dù hình thành như một quần thể nhỏ, những tác

nhân khử sulfate trong vùng đất ngập nước ngọt có khả năng xúc tác giảm sulfate đáng

kể và tương tác đáng kể với các vi khuẩn trong các chu trình khác Nhìn chung, các khuđất ngập nước nội địa (nước ngọt) có một cộng đồng vi khuẩn rất đa dạng có khả nănggiảm thiểu sulfate Bên cạnh đó, vai trò quan trọng của các vi khuẩn cố định đạm trongmôi trường hạn chế dinh dưỡng được đánh giá bởi Lovell & Davis (2012), ghi nhận rằngcộng đồng vi khuẩn này rất đa dạng thậm chí khác nhau giữa các loài thực vật

Sự ngập nước thường xuyên hoặc định kỳ tạo ra một số đặc điểm đặc trưng về lý,hóa học và sinh học cho môi trường (Ponnamperuma, 1984) Sự phân tầng quan trọngnhất giữa nước và đất bị ngập là sự xâm nhập của oxy trong khí quyển Sự khuếch tánoxy trong nước chậm hơn 10.000 lần so với không khí Oxygen nhanh chóng cạn kiệt ởtầng trên của đất ngập do các quá trình oxy hóa hóa học và sinh học, dẫn đến một cấu

trúc đất ở đó sự hiện diện của oxy được giới hạn ở các milimet trên (Frenzel et al., 1992).

Các loài cây trong vùng đất ngập nước đã phát triển các cơ chế để có thể tồn tại và tăngtrưởng trong đất và trầm tích bị thiếu oxygen Còn được gọi là mô không khí, các mônày hiện diện trên chồi và rễ tạo điều kiện vận chuyển oxy từ khí quyển đến rễ, do đócung cấp nguồn oxygen cho quá trình hô hấp

Cây trồng ở vùng đất ngập nước là nơi giao diện giữa hiện diện oxygen và yếmkhí (thiếu oxygen), và do đó cung cấp môi trường sống cho cả vi khuẩn hiếu khí và kỵkhí, tạo điều kiện cho việc tái sản xuất chất dinh dưỡng (Hình 2.3) Bên cạnh oxygen,các loài thực vật tại đây thải ra các hợp chất cacbon hữu cơ cung cấp cho vi sinh vậttrong vùng rễ (rhizosphere) là nguồn năng lượng cần thiết giúp vi sinh vật thực hiện cácphản ứng sinh học khác nhau

Hình 2.3: Sơ đồ trình bày sự tương tác giữa sự phóng thích oxygen của rễ và các quá trình hiếu khí và kỵ khí liên quan đến sự tái sinh các nguyên tố, cũng như sự phát thải

methane từ đất ngập nước (Paul et al., 2013).

Ghi chú: các mũi tên liên tục chỉ các quy trình vi sinh vật, mũi tên chấm chấm mô tả quá trình khuếch tán.

Do yêu cầu phải thích ứng với môi trường vùng rễ của vùng đất ngập nước chothấy rằng có thể có sự hiện diện đa dạng các loài vi khuẩn Sự đa dạng vi khuẩn này,đặc biệt là trong môi trường đất, thường đi kèm với sự đa dạng về chức năng, và đượcxem là có ý nghĩa quan trọng trong việc duy trì các chức năng địa sinh học(biogeochemical) dưới sự thay đổi môi trường Vùng rễ (rhizosphere) của các khu đấtngập nước là nơi cư ngụ của một nhóm các vi khuẩn sống tự do và đa dạng có khả năng

cố định nitrogen Cộng đồng vi khuẩn này được duy trì với sự đa dạng cao và ổn định

trước những biến đổi về môi trường (Paul et al., 2006) Ngoài ra, còn có sự hiện diện

của các nhóm vi khuẩn chuyên biệt (vi khuẩn chuyển hóa sắt), chúng thường liên quanđến những phản ứng quan trọng về sinh học và môi trường Trong vùng rễ của khu đấtngập nước, nơi có sự giao nhau đặc trưng giữa hiện diện oxygen và yếm khí, những vikhuẩn hiếu khí và kỵ khí bắt buộc phải hoạt động gần nhau, qua đó tạo điều kiện cho sựtuần hoàn vật chất

Các vùng đất ngập nước nội địa như U Minh, Đồng Tháp Mười và các hệ thốngsông suối, hồ là những nơi chứa đựng nhiều loài động vật, thực vật đặc hữu hoặc nhữngloài có tầm quan trọng về đa dạng sinh học toàn cầu Tuy nhiên, hiện nay, các nghiêncứu về cộng đồng vi khuẩn trên các vùng đất ngập nước này chưa được ghi nhận nhiều,

và đặc biệt là những khả năng có thể ứng dụng cộng đồng này hiện còn chưa được nghiêncứu và khai thác Chính vì vậy, việc nghiên cứu này có thể sử dụng cộng đồng vi khuẩn

nhằm phục vụ con người, và đồng thời nhằm bảo tồn nguồn gen quý hiếm là vô cùngcần thiết.

2.4 Một số cơ chế kiểm soát bệnh thực vật của các dòng vi khuẩn từ đất

Các dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng và kiểm soát bệnh có tiềm năng rất lớnvào việc phát triển các hệ thống nông nghiệp bền vững Chúng thực hiện theo ba cách

khác nhau: (i) Tổng hợp các hợp chất đặc biệt cho cây trồng; (ii) Tạo thuận lợi cho việc hấp thu một số chất dinh dưỡng từ đất; (iii) Ngăn ngừa bệnh cây (Kumar and Dubey,

2012) Nhìn chung, cơ chế gián tiếp liên quan đến khả năng giảm các tác động có hại docác sinh vật gây bệnh trên cây trồng Các dòng BCA gián tiếp giúp kích thích sinh trưởngcây trồng thông qua sự ức chế các mầm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau, chẳng hạnnhư khả năng tổng hợp siderophores cạnh tranh nguồn sắt với các tác nhân gây bệnh

(Pandey et al, 2005), khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa chống nấm và vi khuẩn như kháng sinh (Kang et al., 2004), sự biểu hiện của các enzyme phân giải tế bào nấm

β – 1, 3 – glucanase, cellulase, chitinase, trên cả nấm và vi khuẩn như Protease (Szekeres

et al., 2004) và khả năng tổng hợp hydro cynide (Senthilkumar et al., 2009), những chất

này ức chế sự phát triển của các dòng vi sinh vật gây bệnh Do đó, các dòng BCA đãthành công trong việc cạnh tranh với các mầm bệnh về chất dinh dưỡng và không giansống

2.5 Các nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh đốm lá do Xanthomonas sp trên hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt

2.5.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng

Bệnh đốm vi khuẩn trên hoa hồng (Rosa sp.) đã được ghi nhận ở các bang miền nam Hoa Kỳ như Florida và Texas, trong đó các dòng thuộc chi Xanthomonas đã được

phân lập và cho thấy có khả năng gây bệnh Phân tích trình tự Multilocus và trình tựrRNA 16S cùng với cấu hình axit béo ghi nhận các dòng gây bệnh trên hoa hồng này rất

giống với X alfalfae subsp citrumelonis Kết quả nghiên cứu này được Huang et al.

(2013) tiến hành Nhóm tác giả tiến hành khảo sát trên các cây hoa hồng tại Bang Texas

và Florida trong khoảng thời gian giữa năm 2004 đến 2010 Mười dòng vi khuẩn đạidiện được thu thập và được sử dụng để xác định vị trí phân loại Các dòng này được lâybệnh nhân tạo, ghi nhận các tổn thương qua những vết ngấm nước, sau đó tiếp tục pháttriển thành những đốm hoại tử và vết cháy lá trên phần lớn các cây chủ Sự khác biệt về

kiểu hình này có thể được liên kết với tính đa dạng di truyền (Huang et al., 2013).

Hình 2.4: Những triệu chứng của bệnh đốm lá vi khuẩn trên Rosa RADtko (tráit) and

RADrazz (phải) tại Hoa Kỳ (Huang et al., 2013).

Nhóm tác giả đã sử dụng một số phương pháp như phân tích axit béo (Fatty acidmethyl ester analysis), trình tự gen rRNA trong việc định danh, phân loại các dòng vikhuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng Kết quả đã xác nhận rằng các dòng vi khuẩn

gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng là thành viên của chi Xanthomonas (Huang et al.,

2013)

Ngoài ra, nhóm còn sử dụng kỹ thuật phân tích phát sinh loài dựa vào kết quả phântích và đánh dấu trình tự đa locus (MLSA) nhằm mô tả thêm các dòng vi khuẩn gây

bệnh trên hoa hồng Trình tự không liên tục của các gen fusA, gapA, gltA, gyrB, lacF,

và lepA của các dòng vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas đã được tải xuống từ PAMDB.org (Almeida et al., 2010) được sử dụng cho các phân tích so sánh với các

trình tự của các dòng vi khuẩn gây bệnh trong nghiên cứu này Tiến hành phương phápMLSA (phương pháp phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự của các locus nhiễm

sắc thể khác nhau giữa các sinh vật có quan hệ gần gũi) dựa trên các gen fusA (translation elongation factor G gene), gap1 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene),

gltA (citrate synthase gene), gyrB (DNA gyrase subunit B gene), lacF (ABC transporter

sugar permease gene), và lepA (GTP binding protein gene) Việc phân tích được thực

hiện bằng cách sử dụng phần mềm Clustal X phiên bản 2.0.6 và điều chỉnh (bằng mắt)bằng cách sử dụng phiên bản Se-Al 2.0a10 Trước khi phân tích phát sinh loài, sự đadạng trình tự, bao gồm số lượng các kiểu haplotype, số lượng các vị trí đa hình(polymorphic) và đa dạng nucleotide (nuclear diversity) được xác định trong tất cả các

dòng gây bệnh trên hoa hồng thuộc chi Xanthomonas bằng cách sử dụng phần mềm

DnaSP phiên bản 5 Phân tích chi tiết cây phát sinh loài được tiến hành bằng phần mềmMEGA 5

Kết quả ghi nhận những dòng vi khuẩn này ít có sự biến đổi di truyền đáng kể, chỉ

có hai haplotype, và rơi vào X axonopodis phân nhóm 9.2 (hình 2.5) Tác nhân gây bệnh này được đánh giá là một mầm bệnh mới Cách đặt tên mầm bệnh rosa được đề xuất

theo quyết định danh pháp được mô tả trước đây Các dòng vi khuẩn gây bệnh trên câyhoa hồng có ít đa dạng di truyền vì chúng hiện diện chỉ có hai haplotype và hiển thị 25

vị trí đa hình (polymorphic) chỉ trong trình tự gapA 25 đột biến trong gapA có lẽ được

tạo ra được do sự tái tổ hợp từ dòng khác Phân tích trên các dòng gây bệnh trên hoa

hồng trong loài X axonopodis phân nhóm 9.2 (phân nhóm này bao gồm hơn 50 mầm bệnh) xác định cùng với X alfalfae, X euvesicatoria, và X perforans dựa trên các phát sinh loài gyrB Các thành viên của phân nhóm được xem là gây bệnh cho một loạt các chi thực vật khác Trong đó, các mầm bệnh (rosa) trên cây hoa hồng này là loài gây hại

nghiêm trọng trên hoa hồng Những phát hiện này cho thấy đặc điểm cây chủ cụ thể, hỗtrợ các cho đặt danh pháp cho các mầm bệnh này

Trong 10 dòng vi khuẩn này, các dòng R07, R09, HDRA, X1808, X1811, X1847,X1850, Tx11 và Tx12 chia sẻ cùng kiểu haplotype, dòng HDRB là một mẫu haplotype

độc nhất Hai haplotypes khác nhau bởi 25 nucleotide (nt) trong chuỗi 444-nt gapA, với

giá trị về đa dạng nucleotide đạt 0.01126 Mười dòng vi khuẩn gây bệnh trên hoa hồngnày tạo thành hai nhánh nhỏ trong phân nhóm 9.2 dựa trên các kết quả phân tích

“maximum parsimony”, nhưng kết quả phân tích xác suất sau Bayesian của 2 nhánh nàychưa ổn định Các giá trị khởi động đối với nhóm 9,2 là 55 và 65%, nhưng phân tích xácsuất sau Bayesian là 100% cho phân lớp, giúp phân lớp trở nên đáng tin cậy Các dòng

vi khuẩn này đã được phân tích phát sinh loài cho thấy có quan hệ gần với X alfalfae subsp citrumelonis, X alfalfae subsp alfalfae, và X perforans của phân lớp 9,2 hơn so với các dòng Xanthomonas spp khác Giá trị tương đồng trong nội bộ dòng vi khuẩn

gây bệnh trên hoa hồng là 99,1% Các giá trị tương tự cho các dòng còn lại thuộc phân

lớp 9,2 là 98,3 đến 99,7%, với giá trị thấp nhất giữa hoa hồng và HDRB với X alfalfae subsp alfalfae Nhìn chung, các dòng vi khuẩn gây bệnh trên hoa hồng này có giá trị tương đồng cao nhất (98,8 đến 99,7%) với phân họ X alfalfae subsp citrumelonis Nhìn

chung, kết quả MLSA và lây bệnh nhân tạo cho thấy rằng đây là một mầm bệnh mới

(Xanthomonas sp pv rosa) thuộc chi Xanthomonas là tác nhân gây đốm lá vi khuẩn

trên hoa hồng Mặc dù mầm bệnh này có mức độ tương đồng cao về trình tự DNA với

các thành viên khác của X axonopodis phân nhóm 9.2, nó hiển thị một kiểu hình độc

khác biệt với các mầm bệnh khác tương tự của các phân nhóm được sử dụng trongnghiên cứu này

Hình 2.5: Sự phát sinh loài của các dòng rosa của chi Xanthomonas dựa trên các dữ liệu kết nối của các đoạn gen fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF, và lepA (Huang et al., 2013) Phát sinh loài của những dòng gây bệnh trên cây hoa hồng của Xanthomonas dựa trên bộ dữ liệu nối các đoạn của các gen fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF, và lepA Các trình tự các gen này thuộc Xanthomonas được tải về

từ PAMDB Số trên các nốt (node) đại diện cho các giá trị hỗ trợ bootstrap cho độ phân cực tối đa – maximum parsimony (phía trước), khả năng tối đa – maximum likelihood (trung bình) và xác suất sau Bayesian trình bày như là tỷ lệ phần trăm – Bayesian posterior được trình bày dưới dạng phần trăm (điểm cuối) Các giá trị được biểu thị bởi dấu hoa thị (*) dưới 50% bootstrap hoặc 90% đối với xác suất sau của Bayesian Các số từ 9,1 đến 9,6 là các nhóm do Rademaker và cộng sự mô tả trong Xanthomonas axonopodis (2005).

Trong một nghiên cứu gần đây, Barak et al (2016) đã so sánh toàn bộ trình tự bộ

gen của dòng GEV-Rose-07, một trong những dòng gây bệnh trên hoa hồng, với các

dòng Xanthomonas có liên quan chặt chẽ khác Dựa trên phân tích toàn bộ trình tự bộ

gen, GEV-Rose-07 có liên quan chặt chẽ với nhóm phân loại Rademaker 9.2, bao gồm

X euvesicatoria (Xe) 85-10, X perforans (Xp) 91-118, X euvesicatoria pv allii (Xea)

CFBP 6369, X alfalfae subsp citrumelonis (Xac) F1, và X dieffenbachiae (Xd) LMG 12,749 (Rademaker et al., 2005) Với giá trị phân tích tương đồng nucleotide theo cặp lớn hơn 97% (> 97%) với X euvesicatoria, dòng GEV-Rose-07 được đề xuất là mầm bệnh thuộc loài X euvesicatoria; và thuộc phân loài rosa với tên đầy đủ là X.

euvesicatoria pv rosa (Xer) (Barak et al., 2016) Tên X euvesicatoria pv rose cũng

được công nhận và sử dụng để nghiên cứu về vi khuẩn Xanthomonas gây bệnh hoa hồng (Fan et al., 2022).

2.5.2 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt

Myung et al (2009) đã tiến hành ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh đốm lá trên cây ớt trong

một nhà kính thương mại ở Jinju, Hàn Quốc vào năm 2014, kết quả cho thấy có tỷ lệmắc bệnh đốm lá là 35%, với các triệu chứng đốm lá điển hình trên cây con đã được ghi

nhận trên giống ớt ngọt (Capsicum annuum L.) Cụ thể như sau: Các triệu chứng gây

bệnh như: những đốm hoại tử tròn, bất thường, đen, với cạnh ngấm nước Các lá bị ảnhhưởng chuyển sang màu nâu sẫm và dễ dàng rụng đi Bảy dòng vi khuẩn được phân lập(BC3707 đến BC3713) đã được tái phân lập trên môi trường đậu nành trypticase(trypticase soy agar) từ các vị trí lá bệnh sau khi được khử trùng bề mặt trong cồn ethyl70% trong 20 giây

Đặc điểm hình thái đã được ghi nhận cho thấy các dòng vi khuẩn được phân lậpnày có Gram âm, roi chuyển động với một sợi cực duy nhất Trên môi trường peptonesucrose agar, khuẩn lạc có màu vàng và nhô lên với rìa mịn Đặc điểm sinh hóa được

kiểm tra dựa trên hướng dẫn phân biệt các loài thuộc chi Xanthomonas (Schaad et al., 2001) và chi Xanthomonas liên quan đến bệnh đốm vi khuẩn ở cà chua và ớt (Jones et

al., 2004) Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn này có kết quả dương tính trong phản

ứng catalase, và âm tính đối với oxidase

Xác định tác nhân gây bệnh và khả năng gây bệnh được thực hiện bằng cách phunhuyền phù tế bào vi khuẩn chứa 107 CFU/ml lên cây ớt (C annuum) 3 tuần tuổi và cây giống cà chua 2 tuần tuổi (Solanum lycopersicun) trong nhà kính duy trì ở 27 ± 20C Cácdòng gây ra các triệu chứng tương tự như những biểu hiện bệnh ban đầu trên cây ớt

(Capsicum spp cv Wangdaebak) và ớt chuông (C spp var angulosum cv Red), và

làm lá ớt và lá cà chua rụng sau 1 tuần chủng mầm bệnh Không có triệu chứng nàođược ghi nhận trên cây đối chứng và cây cà chua khi phun bằng nước cất tiệt trùng

Một nghiên cứu khác của Kyeon et al (2016) với 72 mẫu bệnh trên cây ớt trên

khắp Hàn Quốc được sử dụng để xác định tác nhân gây bệnh 3 kiểu hình của các mầmbệnh trên ớt tại Hàn Quốc được so sánh với các dòng BSX (bacterial spot – causing

Xanthomonas) tham khảo để định danh chính xác Ba đặc điểm chính được sử dụng để

tách 4 loài BSX được dựa theo Jones et al (2004) Tất cả các mầm gây bệnh trên ớt ở

Hàn Quốc đều âm tính đối với hoạt tính pectolytic, và ngoại trừ 5 dòng, những dòng cònlại ghi nhận kết quả âm tính đối với hoạt tính amylolytic Những đặc điểm này giống hệt

như của X euvesicatoria và X gardneri Năm dòng được phân lập cho kết quả dương tính với hoạt tính amylolytic không thuộc các dòng của X euvesicatoria hoặc X.

perforans.

Hình 2.6: Các triệu chứng đốm vi khuẩn trên cây ớt và lá cà chua được chủng dòng vi

khuẩn CNUPBL 2039 (Kyeon et al., 2016)

A: Tổn thương trên lớp biểu bì mặt trên của lá ớt; B: Tổn thương trên lớp biểu bì mặt dưới lá ớt; C: Tổn thương trên lớp biểu bì mặt trên của lá cà chua; D: Tổn thương trên lớp biểu bì mặt dưới của lá cà chua.

Gần đây, Stoyanova et al (2014) lập luận rằng để tách thành phần loài của nhóm

BSX thì việc sử dụng một số đặc điểm kiểu sinh hóa như hoạt tính amylolytic và việc

sử dụng cis-aconitic acid là chưa đủ Bên cạnh đó, tất cả các mầm bệnh này trên ớt ở Hàn Quốc có một protein 32 kDa Đây là loại protein chỉ duy nhất có ở X euvesicatoria.

Nhằm đảm bảo xác định chính xác danh pháp của các dòng gây bệnh trên ớt được

thu thập, Kyeon et al (2016) đã tiến hành phân tích một số đặc điểm kiểu hình và kiểu

gen đã được sử dụng như: khả năng phân giải amylo (amylolytic activity), khả năngphân giải pecto (pectolytic activity), sự hiện diện vết protein độc nhất khi điện di trêngel sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE), Phân tích Restriction

fragment length polymorphism – RFLP dựa trên gen rpoB, Phân tích phát sinh loài với

16S rRNA và trình tự 3 gen houskeeping Cụ thể như sau:

Kết quả về phân tích 3 đặc điểm kiểu hình cho thấy tất cả các mầm bệnh trên ớt

này ở Hàn Quốc đều là X euvesicatoria Kết quả của RFLP dựa trên gen rpoB cho thấy rằng tất cả các mầm bệnh trên ớt này đều có vạch (band) trùng với mẫu của X.

euvesicatoria và X perforans Một cây phát sinh dựa trên trình tự 16S rRNA cũng cho

thấy rằng tất cả các mầm bệnh trên ớt ở Hàn Quốc được nhóm lại cùng với X.

euvesicatoria và X perforans Các kết quả này cho thấy dựa gen rpoB theo phương pháp

RFLP và chuỗi 16S RNA là chưa đủ để tách biệt 2 loài BSX (X euvesicatoria và X.

perforans) Những kết quả này cũng chỉ ra rằng loài thứ 2 có liên hệ chặt chẽ với loài

gyrB, và lepA cho thấy tất cả các dòng gây bệnh trên ớt ở Hàn Quốc được phân thành

cùng nhóm giống như X euvesicatoria.

2.6 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát mầm bệnh do

Xanthomonas spp gây ra trên cây trồng

Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh đối với cây trồng thay đổi theocác thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, nhà kính và trên đồng ruộng Vì đất là một môitrường không ổn định và đôi khi rất khó đạt được kết quả như dự kiến Biến đổi khí hậucũng có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của các dòng vi khuẩn này Nhưng đôi khi, nhữngđiều kiện ngoài đồng ruộng không thuận lợi cho sinh trưởng của các dòng vi khuẩn

(Zaidi et al., 2009) Môi trường sống trong hệ sinh thái tự nhiên và môi trường đất được

kiểm soát đã giúp gia tăng đáng kể năng suất của các cây trồng (Ahemad & Kibret,2014) Các dòng vi khuẩn này có thể là một phương tiện thuận lợi nhằm kiểm soát bệnhcây trồng Việc áp dụng rộng rãi các dòng vi khuẩn này có thể giúp giảm sự phụ thuộccủa thế giới vào các hóa chất nông nghiệp Hơn thế nữa, đây là một công nghệ mà nông

dân ở cả các nước phát triển và đang phát triển dễ tiếp cận (Gamalero et al., 2009).

Những phát triển gần đây trong công nghệ sinh học có thể giúp thúc đẩy các nghiên

cứu liên quan đến việc kiểm soát sinh học các dòng Xanthomonas spp gây bệnh trên cây trồng Trong đó, Bacillus velezensis là một ví dụ về chi Bacillus có khả năng kiểm

soát bệnh sinh học Do sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng, loài vi khuẩn nàyđang nhận được nhiều quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại cây

trồng và kích thích sinh trưởng cho cây Với mười lăm dòng B velezensis phân lập được

ở các vùng Hoàng Liên, Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo đã được

phát hiện có hoạt tính kháng các loại nấm hại cây là Fusarium oxysporum, Sclerotium

hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici và vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Xanthomonas oryzae (Trung et al., 2017) Hơn nữa, các dòng vi khuẩn này còn có khả

năng phân giải phosphate khó tan, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA và sảnsinh nhiều enzyme thủy phân như lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase vàchitinase Với khả năng sinh các loại enzyme thủy phân và sinh các chất có lợi cho cây

trồng, các dòng B velezensis này có tiềm năng ứng dụng để tạo chế phẩm làm phân bón

hữu cơ sinh học

Bệnh bạc lá lúa là một trong những bệnh phổ biến ở Việt Nam Các phương pháp

nghiên cứu dựa trên 6 dòng Xanthomonas oryzae pv oryzae và các dòng vi sinh vật

thích hợp để sản xuất chế phẩm vi sinh Khảo nghiệm trên cây lúa tại HTX Mộc Bắc,huyện Duy Tiên, tỉnh Hà Nam đã đánh giá được sự sinh trưởng, xác định tính đối kháng,khả năng đồng sinh trưởng, hiệu quả của sản phẩm, đánh giá độc tính của chế phẩm, của các vi sinh được chọn Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng vi sinh vật thuộc nhóm

xạ khuẩn Streptomyces sp., Bacillus spp có khả năng đối kháng với vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây bệnh bạc lá lúa, với 4 dòng vi khuẩn thuộc

chi Bacillus spp PD17, PD13.1, KND, KXT1 và 2 dòng xạ khuẩn XKBL2, XKBL3

(Oanh, 2020)

Kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng vi sinh vật và các sản phẩm của chúng đã

được chứng minh là đạt hiệu quả trong việc kiểm soát các loài thuộc chi Xanthomonas (Lanna Filho et al., 2010; Murate et al., 2015; Daungfu et al., 2018; Príncipe et al.,

2018) Vì vậy, những nghiên cứu gần đây trong việc tìm kiếm các vi sinh vật để kiểm

soát sinh học của một số loài Xanthomonas quan trọng đối với nền kinh tế thế giới ngày

càng được quan tâm

2.6.1 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas citri subsp citri trên cây có múi

Mầm bệnh cây (phytopathogen) có tầm quan trọng trên toàn thế giới là

Xanthomonas citri subsp citri (Xac) Đây là tác nhân gây bệnh xì mủ trên cây có múi

(citrus canker), được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới, chủ yếu ở những vùng sản xuấtcây có múi có tầm quan trọng về kinh tế và những vùng bệnh lây lan rộng Bệnh xì mủcam quýt xuất hiện ở Brazil, Mỹ và Mexico và là loài đặc hữu ở Ấn Độ, Nhật Bản vàcác nước châu Á khác (Gade & Lad, 2018) Đối với bệnh hại cây có múi, các nghiêncứu về tác nhân phòng trừ sinh học còn khá ít, nhưng đã đạt được một số kết quả khả

quan Các thí nghiệm sử dụng các dòng Pseudomonas sp., Erwinia herbicola, Bacillus

subtilis đã ghi nhận rằng một số vi sinh vật biểu sinh trên cây cam quýt có thể đối kháng

với vi khuẩn Xac trong điều kiện in vitro, nhưng vẫn còn gặp nhiều khó khăn khi tìm

kiếm dòng vi khuẩn hoặc nấm có khả năng tồn tại bền vững ở điều kiện ngoài đồng.Những loài được nghiên cứu nhiều trong việc kích thích sinh trưởng và tạo ra các cơ chế

phòng vệ thuộc chi Bacillus cũng là tác nhân kiểm soát sinh học sản xuất nhiều loại phân

tử kháng khuẩn (Fira et al., 2018), là nhóm vi khuẩn triển vọng trong việc kiểm soát

sinh học đối với các mầm bệnh thực vật

Một nghiên cứu khảo sát tiềm năng của Bacillus spp bản địa trong việc kiểm soát sinh học chống lại Xac ở Đài Loan Các dòng được khảo sát bao gồm các dòng vi khuẩn

được phân lập từ hỗn hợp cơ chất của bầu cây, phân hữu cơ, và đất Trong 326 dòng vikhuẩn được phân lập, 7 dòng được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu phát triển thuốc trừbệnh sinh học nhằm phát huy khả năng đối kháng vượt trội Định danh về mặt di truyền

cho thấy các dòng được chọn là họ hàng gần của Bacillus subtilis và dường như tách ra

từ nhóm B cereus Hai trong số bảy dòng trực khuẩn được phân lập đã được thử nghiệm

để kiểm tra sự phát triển các triệu chứng của bệnh trên cây cam quýt Sau khi thử nghiệm

bằng huyền phù của dòng TKS1-1 (B subtilis) và WG6-14 (B amyloliquefaciens), sự

phát triển các triệu chứng giảm xuống, có thể do có sự giảm xâm nhập của mầm bệnh

và sự hình thành màng sinh học của các tế bào vi khuẩn Kết quả là, từ việc áp dụng

công thức nội bào tử từ B subtilis, tỷ lệ bệnh trên bề mặt lá cũng giảm (Huang et al.,

2012)

Các thử nghiệm về kiểm soát sinh học dòng X citri subsp citri dựa vào Bacillus

subtilis tiến hành ở điều kiện ngoài đồng tại Ấn Độ trong giai đoạn 2009–2010 (Das et al., 2014) Thử nghiệm tiến hành phun huyền phù vi khuẩn thuộc dòng S-12 lên cây có

múi (lime orchard) trong vườn Kết quả ghi nhận rằng sau một lần phun vi khuẩn tronggiai đoạn cao điểm của dịch bệnh đã giúp giảm bệnh 5,21%, rõ rệt so với đối chứng ở

20 ngày sau khi thử nghiệm Cũng giống như chi Bacillus, việc ức chế mầm bệnh và khả năng tạo ra các hợp chất có khả năng kháng khuẩn của các loài thuộc chi Pseudomonas

đã được ghi nhận (Haas & Défago, 2005; Weller, 2007) Chúng tạo ra các chất chuyểnhóa thứ cấp và các phân tử khác có hoạt tính kháng khuẩn, có thể được sử dụng để kiểm

soát bệnh xì mủ (citrus canker) trên cây có múi Pseudomonas spp từ các cây có múi ở

miền Nam Iran đã được Viện Nghiên cứu Bảo vệ Thực vật Iran đánh giá trong các thửnghiệm cả trong ống nghiệm và trong điều kiện nhà kính đối với một số dòng được phânlập Sau khi nuôi cấy, hoạt tính đối kháng từ vi khuẩn được đánh giá thông qua việc đocác quầng ức chế trong đĩa Petri Huyền phù của 5 dòng vi khuẩn phân lập được chọnphun riêng lẻ lên các lá non và sau đó cây được chủng mầm bệnh Kết quả ghi nhận tất

cả 20 dòng Pseudomonas đều ức chế sự phát triển của Xac ở mức độ từ thấp đến cao Trong điều kiện in vitro, hai dòng nổi bật là P fuorescent và P putida, trong khi trong điều kiện in vivo, tất cả các dòng đều có hoạt tính đối kháng và hai dòng P fuorescent

có hoạt tính cao nhất (Khodakaramian et al., 2008).

Việc sàng lọc 500 dòng vi khuẩn phân lập từ đất và từ các bộ phận bị nhiễm vàkhông bị nhiễm bệnh của cây có múi ở Iran nhờ thử nghiệm ức chế trên đĩa Kết quả ghi

nhận 2 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của hai dòng Xac (Gholami et

al., 2015) Phân tích đặc điểm sinh hóa và sinh học phân tử đã xác định hai dòng vi

khuẩn này thuộc chi Cronobacter và Enterobacter Việc phân lập và xác định chất được

tiết ra có thể kiểm soát mầm bệnh trên cây trồng là hai bacteriocin

2.6.2 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv campestris trên cây trồng họ cải

X campestris pv campestris (Xcc) là nguyên nhân gây ra bệnh thối đen (black

rot), một bệnh lây lan trên toàn thế giới và được đánh giá là bệnh lý gây hại nặng nề

nhất, với thiệt hại kinh tế đáng kể đối với các loại rau họ cải (Monteiro et al., 2005).

Mặc dù chủ yếu ảnh hưởng đến họ Brassica như: bắp cải (cabbage), bông cải xanh

(broccoli), súp lơ trắng (cauliflower), cải xoăn (kale) và các loại cải khác (Qian et al.,

2005), ngoài ra còn có một số trường hợp được ghi nhận trên cỏ dại (weeds) và cây cảnh(ornamental plants) Bệnh thối đen gây ra hiện tượng đen sạm ở các mô mạch và các tổnthương trên lá, từ úa lá đến hoại tử, dẫn đến thối rữa trên cây rau và không còn sử dụngđược (Alvarez, 2000)

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus được biết đến như một tác nhân kiểm soát sinh học (Fira et al., 2018) Các dòng B subtilis và Pseudomonas fluorescens đều được phân lập

từ các mẫu súp lơ (cauliflower), thể hiện đặc tính đối kháng với Xcc (Singh et al., 2010).

Các dòng vi khuẩn đối kháng này được thử nghiệm riêng biệt và trong hỗn hợp (với tỷ

lệ 1:1) và với các mật số khác nhau Trong thử nghiệm in vitro, sự ức chế thay đổi tùy

theo mật số mầm bệnh và vi khuẩn đối kháng, cả hai vi khuẩn đối kháng không thể hìnhthành quầng ức chế ở nồng độ thấp hơn 106 CFU/mL Các thử nghiệm sau đó được thựchiện trên cây súp lơ bằng cách phun lên cây với nồng độ tương tự như trong ống nghiệm,chỉ thay đổi thời gian sử dụng chất đối kháng Kết quả ghi nhận rằng hỗn hợp của cả hai

vi khuẩn được phun xử lý một tuần trước khi xử lý Xcc làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh xuống

thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng xử lý bằng streptomycin Điều này cho thấy tiềmnăng của cả hai dòng vi khuẩn như là tác nhân bảo vệ trong kiểm soát sinh học

Mishra & Arora (2012) đánh giá bốn mươi dòng vi khuẩn được phân lập từ vùng

rễ của loài Brassica campestris về khả năng đối kháng với Xcc Hai dòng KA19 và SE tương ứng P aeruginosa và B thuringiensis được ghi nhận rất tiềm năng với quầng ức

chế rộng hơn 11 mm Sau đó, thử nghiệm riêng rẽ và kết hợp trong điều kiện nhà kínhcóthể kiểm soát bệnh thối đen bằng cách sử dụng kỹ thuật phun lá hoặc ngâm hạt và trộnđất Kết quả càng khả quan hơn khi được sử dụng phối hợp hai dòng này

Trong một nghiên cứu khác, Liu et al (2016) đã thử nghiệm 23 dòng vi khuẩn

vùng rễ (rhizobacteria) có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật nhằm đối kháng với

Xcc, với thử nghiệm in vitro và in vivo Thử nghiệm in vitro trên đĩa ghi nhận 18 trong

số 23 dòng tạo ra quầng ức chế, tất cả chúng đều được xác định là B velezensis Tám

dòng này đã được chọn để thử nghiệm trong nhà kính phun trên cây bắp cải Tất cả cácdòng được thử nghiệm đều làm giảm bệnh tới 40% Bốn dòng đối kháng nhất đã đượcchọn để nghiên cứu dạng riêng lẻ, và dạng phối hợp chung 4 dòng với một hỗn hợp khác

là vi khuẩn kích thích sinh trưởng cây trồng Tất cả các phương pháp điều trị đạt kết quảkhả quan, đặc biệt dạng hỗn hợp có kết hợp với vi khuẩn kích thích sinh trưởng, là hỗnhợp hiệu quả nhất, làm giảm đáng kể các triệu chứng bệnh và thúc đẩy sự phát triển củacây

Ghazalibiglar et al (2015) đã sàng lọc và ghi nhận 14 dòng có khả năng đối kháng chống lại 6 dòng Xcc trong số 24 dòng Paenibacillus Trong đó, bảy dòng được chọn

cho thử nghiệm trong chậu, trong đó dòng P16 làm giảm tỷ lệ bệnh thối đen do hai dòng

Xcc được sử dụng trong thí nghiệm in vivo Ngoài ra, dòng P16 có thể kích kháng ở cây

bắp cải (Ghazalibiglar et al., 2016).

2.6.3 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv campestris trên cây cà chua và ớt

Cây cà chua và ớt là loại cây trồng rất quan trọng đối với nền kinh tế thế giới, vìthế bệnh đốm lá vi khuẩn (BLS- Bacterial leaf spot) trên hai loại cây này đã gây ra thiệthại đáng kể (Abbasi & Weselowski, 2015) Các mầm bệnh đã biết gây ra hiện tượng này

là X vesicatoria, X euvesicatoria, X perforans và X gardneri (Jones et al., 2004; Potnis

et al., 2015) Việc sử dụng các giống kháng và ứng dụng các hợp chất hóa học làm thuốc

diệt vi khuẩn là các phương pháp kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn thông thường (Peitl et

al., 2017) Tuy nhiên, những kỹ thuật này đã được chứng minh là không thể kiểm soát

căn bệnh này (Pernezny et al., 2012) Do đó, nhiều nghiên cứu liên quan đến kiểm soát

sinh học đối với bệnh đốm vi khuẩn trên cây cà chua và ớt đã được phát triển

(El-Hendawy et al., 2005; Obradovic et al., 2005; Ji et al., 2008;) Trong đó, vi khuẩn thuộc chi Bacillus đã thể hiện tiềm năng như một tác nhân kiểm soát sinh học ức chế một số loài Xanthomonas spp gây ra (Mirik et al., 2008; Lanna Filho et al., 2010) Nghiên cứu được thực hiện bởi Mirik et al (2008) đã tìm thấy ba dòng Bacillus spp., được phân lập

từ vùng rễ cây ớt, có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn X vesicatoria Kết quả

trong các thí nghiệm trong nhà kính và trồng cây trên cây ớt cho thấy bệnh đốm lá do vikhuẩn giảm khi được xử lý ba dòng này dạng đơn lẻ hoặc kết hợp

Trong một nghiên cứu khác (Lanna Filho et al., 2010), Bacillus pumilus và

Paenibacillus macerans, từ cây cà chua khỏe mạnh, đã ức chế sự phát triển của X vesicatoria trong thử nghiệm kháng khuẩn và bảo vệ cây cà chua chống lại các

phytopathogens này Gần đây hơn, cùng các tác giả đã chứng minh rằng các phân đoạn

protein từ Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus pumilus, được phân lập từ thân cà chua, có khả năng thúc đẩy sự cảm ứng của cây cà chua kháng lại X vesicatoria (Lanna Filho et al., 2013) Pseudomonas spp được coi là một trong những tác nhân kiểm soát

sinh học quan trọng, đã được ghi nhận là có vai trò kiểm soát nhiều bệnh thực vật do vi

khuẩn, nấm và tuyến trùng gây ra (Obradovic et al., 2004) Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh tác dụng của những vi khuẩn này chống lại X vesicatoria (Abo-Elyousr & El-Hendaw, 2008; Príncipe et al., 2018) Trong nghiên cứu của Abo-Elyousr & El- Hendaw (2008), Pseudomonas fuorescens được phân lập từ vùng rễ của cây cà chua đã hạn chế sự phát triển của X vesicatoria in vitro, trên hạt cà chua, trong điều kiện phòng

thí nghiệm, chúng đã cải thiện khả năng nảy mầm của hạt và sức sống của cây con vàtrong điều kiện nhà kính và ngoài đồng làm giảm đáng kể chỉ số bệnh của bệnh đốm vikhuẩn trên cà chua

Liu et al (2018) đã chứng minh trong các thí nghiệm trên cây cà chua trong nhà kính rằng hỗn hợp của hai dòng PGPR riêng lẻ (B velezensis AP197 + AP298) và (B.

altitudinis AP69 + B velezensis AP199) thể hiện khả năng kiểm soát sinh học chống lại

mầm bệnh vi khuẩn lá (X axonopodis pv vesicatoria) tốt hơn các dòng riêng lẻ.

2.6.4 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát các loài Xanthomonas

spp khác

Giống như các loài Xanhomonas spp đã nêu ở trên, các loài khác thuộc chi

Xanthomonas này cũng rất quan trọng trong nông nghiệp và khó kiểm soát Tuy nhiên,

có rất ít nghiên cứu kiểm soát sinh học đối với các loài này Dòng X axonopodis pv.

manihotis (Xam) là tác nhân gây bệnh bạc lá vi khuẩn trên cây sắn (CBB- Cassava

bacterial blight) Ở Indonesia, một nghiên cứu đã phân lập 20 vi khuẩn nội sinh

(endophytic) từ thân cây sắn, được xác định đều là Pseudomonas sp Một nghiên cứu được thực hiện vào năm 2015 (Halfeld-Vieira et al., 2015) ghi nhận có sự giảm chỉ số bệnh bạc lá vi khuẩn trên cây chanh dây (passionfruit bacterial blight) do ba dòng X.

axonopodis pv passiflorae (Xap) gây ra khi sử dụng chín dòng vi khuẩn từ bề mặt lá

cây chanh leo bản địa (thuộc các chi: Arthrobacter, Curtobacterium, Enterobacter,

Microbacterium, Pseudomonas và Stenotrophomonas), sự cạnh tranh đối với các hợp

chất sắt và nitrogenate trên lá giải thích khả năng kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩnkiểm soát bệnh này

Gần đây, Ribeiro et al (2017) ghi nhận sự xâm nhiễm của một dòng Pseudomonas

sp có chứa pyoverdine ức chế X axonopodis pv passiforae, và giảm chỉ số bệnh bạc lá

vi khuẩn chanh dây Dịch chiết chứa pyoverdine làm giảm số lượng tế bào của X.

axonopodis pv passiforae in vitro và làm giảm đáng kể chỉ số bệnh của bệnh bạc lá vi

khuẩn in vivo.

Bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra là bệnh hại lúa trên toàn thế giới Ji et al (2008) ghi nhận một dòng Lysobacter antibioticus, được

phân lập từ vùng rễ cây lúa, đã ức chế đáng kể sự phát triển mầm bệnh này trong các thí

nghiệm nhà kính và ngoài đồng Chithrashree et al (2011) cũng ghi nhận vi khuẩn vùng

rễ kích thích sinh trưởng thực vật thuộc Bacillus spp có thể làm giảm tỷ lệ bệnh cháy

bìa lá lúa, chiều dài vết bệnh và héo cây

Sự canh tác cây Hồng môn (Anthurium) trên toàn thế giới đã bị ảnh hưởng bởi

bệnh bạc lá do X axonopodis pv dieffenbachiae Dòng Bacillus amyloliquefaciens

B014, được phân lập từ cây khỏe mạnh đã được ghi nhận có khả năng ức chế bệnh này

(Li et al., 2012).

Xanthomonas campestris pv cucurbitae gây bệnh đốm vi khuẩn trên dưa chuột,

bầu bí (gourds), bí đỏ (pumpkins) và bí đao (squash) Hai dòng Bacillus subtilis (UMAF6614 và UMAF6639) được Zeriouh et al (2011) ghi nhận khả năng kháng khuẩn cao đối với mầm bệnh này in vitro và trong lá dưa (melon) Khả năng kiểm soát

sinh học này có thể liên quan đến chất iturin lipopeptides

Một số vi khuẩn đã thể hiện khả năng chống lại các loài Xanthomonas spp trong điều kiện in vitro và in vivo và cải thiện sức khỏe cây trồng thông qua nhiều cơ chế Một

số vi sinh vật này có các gen sinh tổng hợp cụ thể liên quan đến việc sản xuất các nhómkháng sinh Vi khuẩn vùng rễ đối kháng, kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR), vi

khuẩn nội sinh đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc chống lại Xanthomonas spp Đặc biệt vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Pseudomonas có thể được đánh dấu là tác

nhân kiểm soát sinh học tiềm năng đối với các mầm bệnh khác nhau thuộc chi

Xanthomonas Sự kết hợp của một số dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh cũng là một sự thay

thế rất hiệu quả và đáng tin cậy Nhìn chung, chúng ta có thể nói rằng các vi sinh vật có

tiềm năng lớn để kiểm soát Xanthomonas spp và chúng đã được quan tâm nhiều để ứng dụng thương mại Một số chế phẩm phòng trừ sinh học đối với Xanthomonas sp có sẵn trên thị trường như Serenade® OPTI (BAYER) chứa một dòng Bacillus subtilis (dòng QST 713) duy nhất có thể được sử dụng để chống lại Xanthomonas sp gây ra đốm vi khuẩn trên cà chua, ớt, cà tím và khoai tây và vi khuẩn Xanthomonas arboricola gây ra

các bệnh chính trên cây ăn quả có hạt

2.6.5 Kỹ thuật MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desraction Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry) và MLSA (Multilocus sequence analysis) trong nghiên cứu định danh vi khuẩn

2.6.5.1 Kỹ thuật MALDI-TOF-MS

Việc phát hiện và xác định các loài vi khuẩn một cách nhanh chóng và đáng tincậy là vô cùng cần thiết nhằm chẩn đoán và điều trị hiệu quả Trong thời gian qua, việcxác định vi khuẩn trong các phòng thí nghiệm lâm sàng thường chủ yếu dựa vào các kỹthuật xác định trình tự gen, hình thái, sinh hóa Việc xác định chính xác vi khuẩn rấtquan trọng trong trường hợp bùng phát các bệnh truyền nhiễm và đóng vai trò quantrọng trong việc chẩn đoán và điều trị hiệu quả Tuy nhiên, việc xác định vi khuẩn kỵkhí, vi khuẩn khó nuôi cấy, vi khuẩn sinh trưởng chậm bằng các phương pháp thôngthường rất tốn thời gian, tốn kém và phức tạp Gần đây, các nhà nghiên cứu đã tập trung

sự chú ý vào việc sử dụng khối phổ (mass spectrometry - MS) để xác định vi khuẩn, đặcbiệt là phương pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và nănglượng laser theo thời gian bay (MALDI-TOF) Trong kỹ thuật MALDI-TOF-MS, vikhuẩn được xác định bằng cách sử dụng tế bào nguyên vẹn hoặc chiết xuất tế bào Việcxác định vi sinh vật được thực hiện bằng cách so sánh dấu vân tay khối lượng peptide(peptide mass fingerprint – PMF) của sinh vật chưa biết với PMF có trong cơ sở dữ liệuhoặc bằng cách so sánh khối lượng dấu ấn sinh học của sinh vật chưa biết với cơ sở dữliệu proteome Quá trình này diễn ra nhanh chóng, chính xác và tiết kiệm cả về công laođộng và chi phí liên quan Công nghệ này đã được các nhà vi sinh vật học sử dụng chomột số mục đích như: xác định vi sinh vật, nghiên cứu dịch tễ học, phát hiện tác nhângây chiến tranh sinh học, phát hiện mầm bệnh truyền qua nước và thực phẩm, phát hiện

sự kháng kháng sinh và phát hiện các mầm bệnh trong máu và đường tiết niệu (Neelja

et al., 2015) Việc sử dụng MALDI-TOF-MS có thể xác định thành công các nhóm vi

khuẩn khó nuôi cấy Đây là một phương pháp xác định vi khuẩn nhanh chóng, chính xác

và tiết kiệm chi phí so với các kỹ thuật hình thái thông thường hoặc sinh học phân tử, làmột công nghệ mới để xác định thường quy vi khuẩn trong các phòng thí nghiệm vi sinhlâm sàng Định danh vi sinh vật bằng khối phổ, trong đó kỹ thuật MALDI-TOF làphương pháp được nghiên cứu, ứng dụng và giải quyết các hạn chế trên MALDI-TOF

ít tốn kém, thời gian trả kết quả ngắn chỉ mất một vài phút cho một kết quả đáng tin cậy.Năng suất của phương pháp này khá cao với khả năng xác định đến hàng trăm mẫu trênmỗi lần chạy Hiệu năng định danh của MALDI-TOF cao, cho kết quả đủ thông tin vàgiao diện dễ đọc đồng thời hỗ trợ truy xuất nguồn gốc và có phần mềm thân thiện vớingười dùng Tất cả các công đoạn của phương pháp này từ chuẩn bị mẫu đến đo và xemxét kết quả đều được máy móc đảm nhiệm tự động khép kín Chính vì thế, không chỉgiảm sức lao động, tiết kiệm nhân lực, MALDI-TOF còn cho kết quả chính xác, thờigian ra kết quả nhanh, bảo quản kết quả dễ dàng và tiện lợi

Máy phân tích khối phổ MALDI-TOF dựa trên kỹ thuật ion hóa bằng cách giải hấphợp chất ra khỏi chất mang bằng tia laser Các ion khác nhau sẽ được phân tách nhờ sựkhác nhau về thời gian bay (TOF-time of flight) Cụ thể, các ion đơn được tạo ra bằng

kỹ thuật MALDI sẽ có sự khác biệt về khối lượng Vì vậy, những ion có khối lượng lớnhơn sẽ có tốc lực nhỏ hơn, nên mất nhiều thời gian hơn để bay qua cùng một khoảngđường dài Các ion sau khi được tăng tốc, bay ngang qua một vùng trường tĩnh điện, nơiđây chúng sẽ được tách riêng nhau ra tùy theo giá trị khối lượng trên điện tích (m/z) củachúng, và được tập trung tại bộ phận thu nhận tín hiệu

Mẫu để phân tích bằng MALDI-TOF-MS được chuẩn bị bằng cách trộn hoặc phủvới dung dịch của một hợp chất hữu cơ, hấp thụ năng lượng được gọi là chất nền Khichất nền kết tinh khi làm khô, mẫu được bao bọc trong chất nền cũng đồng thời kết tinh.Mẫu trong chất nền được ion hóa tự động bằng chùm tia lazer Quá trình khử hấp thụ vàion hóa bằng chùm tia laser tạo ra các ion đơn lẻ được proton hóa từ chất phân tích trongmẫu Các ion proton hóa sau đó được tăng tốc ở một thế cố định, tại đó các ion này táchkhỏi nhau dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích của chúng (m/z) Sau đó, các chất phântích tích điện được phát hiện và đo bằng cách sử dụng loại máy phân tích khối lượngnhư máy phân tích thời gian bay (TOF) Trong quá trình phân tích MALDI-TOF, tỷ lệm/z của một ion được đo bằng cách xác định thời gian cần thiết để nó di chuyển theochiều dài của ống bay Một số máy phân tích TOF tích hợp một gương ion ở cuối phíasau của ống bay, có nhiệm vụ phản xạ ngược các ion qua ống bay tới một máy dò Dựatrên thông tin TOF, một phổ đặc trưng được gọi là dấu vân tay khối lượng peptide (PMF)được tạo ra cho các chất phân tích trong mẫu (Hình 2.7)