Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao xoa chứa thành phần chính lá thuốc bỏng (kalanchoe pinnata (lam ) pers ) trên mô hình động vật thực nghiệm gây bỏng

Kết quả khảo sát mô hình gây bỏng nhiệt nhằm nghiên cứu tác dụng làm lành tổn thương bỏng khi bôi cao xoa chứa thành phần lá Thuốc bỏng trên vết thương bỏng nhiệt .... Nhằm phòng tránh n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.DS Nguyễn Ngọc Quỳnh

Cần Thơ - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào

Tác giả luận văn

Võ Thanh Vy

LỜI CẢM ƠN

"Tôi xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến cố vấn của tôi, Tiến sĩ Dược sĩ

Nguyễn Ngọc Quỳnh - Người đã định hướng, trực tiếp dẫn dắt và cố vấn cho

tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học Xin chân thành

cảm ơn những kiến thức và sự hướng dẫn tận tâm của Cô đã giúp cho tôi mở

mang thêm nhiều kiến thức hữu ích về dược học

Tôi xin chân thành cảm ơn đến PGS TS Nguyễn Trung Kiên – Hiệu

trưởng Đại học Y Dược Cần Thơ đã khai mở tư duy và định hướng cho tôi từ

những ngày đầu thực hiện đề cương nghiên cứu và Tôi cũng gửi lời cảm ơn

đến PGS TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ qua những lần trao đổi về tiêu chuẩn

kiểm nghiệm sản phẩm trước khi đưa vào nghiên cứu giúp đề tài chặt chẽ và

nâng cao tính khoa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS Dương Xuân Chữ -

Trưởng khoa Dược Đại học Y Dược Cần Thơ đã truyền đạt cho tôi những

kiến thức về nghiên cứu độc tính và đánh giá dược lý, kỹ năng cho nhà nghiên

cứu bằng những lần trao đổi thực sự ý nghĩa

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự nhiệt tình của PGS Phạm Thành Suôl –

Trưởng Liên Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, TS.BS Nguyễn Hải Yến –

Trưởng Bộ môn Vi sinh, CN Lương Quốc Bình và DS Phạm Minh Hữu Tiến

đã dành thời gian quý báu để hỗ trợ phòng thực hành, trang thiết bị cho tôi

trong quá trình nghiên cứu Giúp cho quá trình hoàn thành luận văn được

nhanh chóng và hiệu quả nhất

Sau cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ, người thân và bạn bè đồng

nghiệp đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng như

trong thời gian hoàn thành luận văn thạc sĩ

Xin chân thành cảm ơn!”

Võ Thanh Vy

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU……… 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Ứng dụng của cao xoa, công dụng của lá Thuốc bỏng 3

1.2 Đại cương về bỏng nhiệt 5

1.3 Nhiễm khuẩn bỏng 10

1.4 Thử nghiệm độc tính tại chỗ và các mô hình thực nghiệm 12

1.5 Tình hình nghiên cứu 20

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3 Địa điểm nghiên cứu 35

2.4 Xử lý số liệu 35

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu 35

Chương 3: KẾT QUẢ 37

3.1 Kết quả nghiên cứu độc tính tại chỗ (khả năng gây kích ứng da) 37

3.2 Kết quả khảo sát mô hình gây bỏng nhiệt nhằm nghiên cứu tác dụng làm lành tổn thương bỏng khi bôi cao xoa chứa thành phần lá Thuốc bỏng trên vết

thương bỏng nhiệt 38

3.3 Kết quả nghiên cứu tác dụng làm lành tổn thương bỏng khi bôi cao xoa chứa thành phần lá Thuốc bỏng trên vết thương bỏng nhiệt… ……….38

3.4 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của cao xoa trên in vivo 46

Chương 4: BÀN LUẬN 56

4.1 Kết quả nghiên cứu độc tính tại chỗ (khả năng gây kích ứng da) 56

4.2 Tác dụng điều trị tại chỗ tổn thương bỏng của cao xoa lá Thuốc bỏng 56

4.3 Khả khăng kháng khuẩn của Cao xoa lá Thuốc bỏng 65

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC American Type Culture

Collection

Tổ chức thu thập, phân phối, bảo quản các mẫu sinh học

của Mỹ

CFU Colony Forming Units Đơn vị hình thành khuẩn lạc

P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Trực khuẩn mủ xanh

S aureus Staphylococcus aureus Tụ cầu vàng

WHO World Health Organization Tổ chức y tế Thế giới

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Phân loại độ sâu của bỏng 6

Bảng 1.2 Mức độ phản ứng trên da thỏ 13

Bảng 1.3 Phân loại các phản ứng trên da thỏ 14

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.2 Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu đối với động vật nghiên cứu 24

Bảng 2.4 Mức độ phản ứng trên da thỏ 27

Bảng 2.5 Đánh giá mức độ gây độc tính tại chỗ 28

Bảng 3.1 Thay đổi về hình thái chung do kích ứng của dung dịch và cao xoa lá Thuốc bỏng trên da lành của thỏ 37

Bảng 3.2 Tóm tắt các thay đổi ở da do bỏng 38

Bảng 3.3 Thay đổi về hình thái sau khi tiếp xúc với hơi nước trong 3 giây 39

Bảng 3.4 Thay đổi về hình thái sau khi tiếp xúc với hơi nước trong 7 giây 40

Bảng 3.5 Tỷ lệ chuột chết ở các lô sau gây bỏng 41

Bảng 3.6 Tỷ lệ chuột lành tổn thương bỏng sau 14 ngày gây bỏng 41

Bảng 3.7 Diện tích tổn thương bỏng tại các thời điểm 4, 9, 14 ngày nghiên cứu 42

Bảng 3.8: Phần trăm tỷ lệ phục hồi của các lô 43

Bảng 3.9 Kết quả Khảo Sát sau 24h cấy vi khuẩn lên tổn thương bỏng 46

Bảng 3.10 Kết quả phân lập vi khuẩn trên từ tổn thương bỏng đã cấy nhiễm khuẩn ở 3 nồng độ 106 CFU/ml, 107 CFU/ml và 108 CFU/ml 47

Bảng 3.11 Tác dụng loại trừ các tổ chức bỏng bị hoại tử trên chuột thực nghiệm của cao xoa lá Thuốc bỏng 51Bảng 3.12 Đánh giá đại thể sự thay đổi của tổn thương bỏng nhiễm khuẩn trên chuột thực nghiệm 51

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Định vị các vị trí ứng dụng trên da thỏ 27Hình 3.1 Tổn thương bỏng chuột lô mô hình: bôi tá dược 44Hình 3.2 Tổn thương bỏng chuột lô chứng dương: bôi thuốc sufadiazin bạc 1% 44Hình 3.3 Tổn thương bỏng chuột lô bôi cao xoa lá Thuốc bỏng liều thấp 45Hình 3.4 Tổn thương bỏng chuột lô bôi cao xoa lá Thuốc bỏng liều cao 45Hình 3.5 Hình ảnh mô bị hoại tử, áp xe dưới da khi cấy vi khuẩn ở 48nồng độ 108 CFU/ml 48

Hình 3.6 Hình ảnh tụ cầu Staphylococcus aureus trên kính hiển vi phân lập từ

tổn thương bỏng nhiễm khuẩn ở nồng độ 108 CFU/ml 48Hình 3.7 Kết quả phân lập mẫu nhiễm khuẩn từ áp xe trên da chuột nhiễm khuẩn ở nồng độ 108 CFU/ml 49Hình 3.8 Phản ứng catalase dương tính đối với vi khuẩn phân lập từ chuột nhiễm khuẩn ở nồng độ 108 CFU/ml 49Hình 3.9 Phản ứng sinh Coagulase dương tính đối với vi khuẩn phân lập từ chuột nhiễm khuẩn ở nồng độ 108 CFU/ml 50

MỞ ĐẦU

Bỏng là một loại chấn thương do vô ý tiếp xúc với các chất có nhiệt độ cao, bao gồm chất lỏng, rắn nóng và các vật thể tỏa nhiệt năng, gây ra mức độ cao không chỉ đối với người nhà bệnh nhân mà còn đối với hệ thống y tế quốc gia trên toàn cầu [14] Tổng cộng có 8.378.122 trường hợp mới bị bỏng đã được xác định trên toàn cầu trong năm 2019 [14] Bỏng nhiệt là loại bỏng thường gặp nhất, chiếm 84 – 94% tổng số trường hợp bị bỏng [4] Tổn thương bỏng thường xảy ra ở vị trí tiếp xúc trực tiếp với tác nhân gây bỏng; dựa theo đặc điểm tổn thương, gồm: diện tích, độ sâu tổn thương, bỏng được phân thành 4 mức độ [4] Tổ chức Y tế thế giới (WHO) nhận định bỏng là nguyên nhân chấn thương hàng đầu và chịu trách nhiệm cho hơn 300.000 ca tử vong mỗi năm [46],[71] Ở Việt Nam, tai nạn bỏng đứng hàng thứ hai chỉ sau tai nạn giao thông với 800.000 - 850.000 bệnh nhân hàng năm [2]

Mục tiêu quan trọng nhất trong điều trị bỏng là ngăn chặn tình trạng nhiễm khuẩn tại chỗ, thúc đẩy quá trình lành tổn thương bỏng và tránh để lại sẹo sau khi khi phục hồi tổn thương [4] Nhằm phòng tránh nhiễm khuẩn ở vị trí tổn thương bỏng, có nhiều loại thuốc, chất kháng khuẩn được bào chế, ứng dụng trên lâm sàng để điều trị bỏng như: sulfadazin bạc, sulfamlon, nitrat bạc hoặc ceri nitrate Các dược chất kháng khuẩn tại chỗ được sử dụng để điều trị tổn thương bỏng nhằm giảm số lượng trường hợp bội nhiễm, nhiễm khuẩn huyết và tử vong do bỏng [4]

Hiện một số thuốc trị bỏng y học cổ truyền đã được nghiên cứu, dựa trên cơ sở khoa học và được ứng dụng trong lâm sàng như: mỡ Maduxin từ cây Sến, Mật ong, Chitosan; hay các thuốc bôi chứa thành phần Nha đam [4],[16],[25],[81] Các chế phẩm thảo dược có nguồn gốc từ nước ngoài thường có tác dụng tương đối tốt nhưng thường có chi phí cao; khó phù hợp với đa số bệnh nhân trong nước Việc tìm kiếm các thuốc mới từ nguồn

nguyên liệu sẵn có trong nước, có trữ lượng dồi dào, giá thành hợp lý, tác dụng điều trị tổn thương bỏng tại chỗ tốt luôn được đặt ra trong công tác điều trị bỏng

Lá Thuốc bỏng vốn đã được sử dụng từ lâu trên Thế giới [48] Theo đó, cây lá Thuốc bỏng có tác dụng tiêu viêm, giảm đau, tiêu độc, giúp tổn thương bỏng chóng lên da non và vết thương nhanh chóng được chữa lành…[26],[48],[74] Trước đây, lá Thuốc bỏng thường được giã nát, đắp vào

vị trí tổn thương bỏng; và đem lại hiệu quả tốt với các độ bỏng từ 1 đến 2 độ [48] Lá Thuốc bỏng chứa các hoạt chất như acid malix, oxalic isocitric và các hợp chất phenolic, glycosid flavonoic có tác dụng tốt trong giảm đau, giảm viêm, chống phù nề, kháng khuẩn và tăng lành tổn thương bỏng [10], [48],[63] Tuy được sử dụng từ rất lâu trong dân gian để điều trị bỏng, nhưng đến nay, tại Việt Nam vẫn chưa có một nghiên cứu thực nghiệm nào đánh giá

về hiệu quả của lá Thuốc bỏng Trên cơ sở đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành

đề tài “Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao xoa chứa thành phần chính

lá Thuốc bỏng Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers trên mô hình động vật

thực nghiệm gây bỏng” với các mục tiêu sau:

1 Đánh giá độc tính tại chỗ của cao xoa có thành phần lá Thuốc bỏng trên thỏ

2 Khảo sát mô hình gây bỏng và xác định tác dụng làm lành tổn thương bỏng của cao xoa chứa thành phần lá Thuốc bỏng trên mô hình gây bỏng thực nghiệm ở chuột nhắt trắng

3 Khảo sát mô hình gây nhiễm khuẩn Staphylococcus aureus trên tổn thương

bỏng và xác định khả năng kháng khuẩn của cao xoa chứa thành phần lá

Thuốc bỏng đối với tổn thương bỏng nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus trên mô hình thực nghiệm ở chuột nhắt trắng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ứng dụng của cao xoa, công dụng của lá Thuốc bỏng

1.1.1 Cao xoa

1.1.1.1 Định nghĩa cao xoa

Cao xoa hay thuốc mỡ là một dạng chế phẩm thuộc các dạng thuốc mềm dùng trên da và niêm mạc Thể chất của cao xoa mềm, dùng tác dụng tại chỗ hoặc đưa dược chất thấm qua da và niêm mạc, làm trơn hoặc dùng để bảo

vệ Thành phần của cao xoa gồm một hay nhiều dược chất, được hòa tan hay phân tán đồng đều trong một hoặc nhiều hỗn hợp tá dược, thuộc hệ phân tán một hoặc nhiều pha [57]

1.1.1.2 Ứng dụng của cao xoa

Các chế phẩm hấp thu qua da với mục tiêu điều trị và phòng bệnh có ứng dụng rất đa dạng So với đường dùng thuốc qua hệ tiêu hóa, thuốc mềm dùng ngoài da và niêm mạc nói chung và dạng bào chế cao xoa có những ưu điểm như sau: Thuốc hấp thu qua da vì vậy tránh được những yếu tố ảnh hưởng như pH của dịch tiêu hóa, thức ăn trong dạ dày ; Dược chất hấp thu thẳng vào hệ mạch, tránh được những chuyển hóa qua gan lần đầu có thể bị phân hủy hoặc giảm hiệu lực điều trị; Ổn định về mặt lý hóa hơn các dạng bào chế lỏng (dung dịch, hỗn dịch, nhũ tương,…); Phù hợp cho bệnh nhân khó nuốt, hôn mê; Thuốc tác động trực tiếp lên vùng da cần điều trị;… [4]

1.1.2 Nguồn gốc, thành phần và công dụng của lá Thuốc bỏng

1.1.2.1 Nguồn gốc

Tên khoa học và phân loại [8]

* Tên khoa học là Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers

* Tên đồng nghĩa là: Bryophyllum calycinum Salisb.,

Bryophyllum pinnatum (Lam.) Kurz [13], [55]

* Tên khác bao gồm Cây sống đời, diệp sinh căn, đả bất tử, trường sinh, trường sanh lông chim, thuốc phỏng, tầu púa sung (Dao)

Phân bố

Ở châu Á có khoảng 10 loài thuộc chi Kalanchoe Adans, trong đó hầu

hết cũng có mặt ở Việt Nam Cây Thuốc bỏng cũng có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới cổ Hiện nay, cây phân bố ở một số nước châu Á như Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Campuchia, Lào, Việt Nam [8]

1.1.2.2 Thành phần

Loại cây này có nhiều dược tính khác nhau như ức chế miễn dịch, chữa lành vết thương, bảo vệ gan, chống ung thư, chống viêm và chống đái tháo đường, bảo vệ thận, hoạt động chống oxy hóa, hoạt động kháng khuẩn, giảm đau, chống co giật, thần kinh và hạ sốt Các glycosid steroid như bufadienolid, cho thấy hoạt động chữa lành vết thương [76] Lá cây Thuốc bỏng chứa các nhóm hợp chất bufadienolid có hoạt tính sinh học cao, thể hiện một loạt các tác dụng sinh học, bao gồm tác dụng điều hoà tim, chống ung thư, chống virus và các đặc tính khác Các bryophylin (bryotoxin) A, B, C có

sự tương đồng về cấu trúc và tác dụng với hai glycosid tim là digoxin và digitoxin [73]

Chứa các thành phần đã được phân lập: flavonoid, phenol và

phenylpropanoid, triterpenoid và steroid [41],[73]

1.1.2.3 Công dụng của lá Thuốc bỏng

Các chất bufadienolid của Kalanchoe như bryotoxin A, B, C có cấu trúc

và hoạt tính tương tự như hai glycoside tim khác, digoxin và digitoxin và đã được chứng minh trong nghiên cứu lâm sàng là có tác dụng kháng khuẩn, chống khối u, ngăn ngừa ung thư và diệt côn trùng [66] Sự hiện diện của các

hợp chất phenolic, triterpenoids cho thấy cây có hoạt tính chống vi khuẩn [72] Đã từ lâu, lá tươi của cây Thuốc bỏng được dùng để chữa bỏng, vết thương, đau mắt đỏ, lở ngứa, sưng, mặt sưng đỏ, chảy máu, ngộ độc, viêm loét dạ dày, viêm ruột, trĩ nội đi ngoài ra máu, lợi tiểu, giảm đau, sốt, đau dây thần kinh, thiếu dinh dưỡng Thành phần trong Thuốc bỏng giúp làm giảm các gốc tự do oxy hóa có hại cho cơ thể [69] Ngoài ra, trong y học Ấn Độ, lá Thuốc bỏng được dùng đắp trị vết thương bầm tím, nhọt, vết cắn của côn trùng độc, kích thích tạo nhú mau lành chỗ rách da Thuốc bỏng còn có tác dụng kháng viêm nhờ vào các thành phần hoạt chất chính flavonoid [32] Dạng thuốc đắp và bột rắc có tác dụng chữa vết loét Lá Thuốc bỏng cũng được dùng dưới dạng dịch ép trị tiêu chảy và bệnh sởi Ở Đông Nam Á, công dụng chủ yếu của Thuốc bỏng là điều trị nhọt, vết thương bỏng, chốc đầu, nhiễm khuẩn đường ruột, kích thích tăng sinh tế bào [8], [73]

1.2 Đại cương về bỏng nhiệt

Bỏng có thể do nhiều nguyên nhân gây ra như do nhiệt, hóa chất, điện hay bức xạ… trong đó bỏng do nhiệt là loại hay gặp nhất (84-94%) [4]

1.2.1 Tác nhân gây bỏng nhiệt

Bỏng do nhiệt được chia thành 3 loại là bỏng nhiệt khô, bỏng nhiệt ướt

và bỏng do các nguyên nhân khác

1.2.1.1 Bỏng do nhiệt khô

Bỏng do nhiệt khô là chấn thương bỏng có nguyên nhân gây ra do tiếp xúc với lửa, tiếp xúc trực tiếp với kim loại nóng hoặc tia lửa điện Nhiệt độ gây bỏng có thể bắt đầu từ vài trăm đến hàng nghìn độ Tổn thương bỏng do nhiệt khô gây ra thường cso khả năng bị nặng và sâu, khó hồi phục [19]

1.2.1.2 Bỏng do nhiệt ướt

Bỏng do nhiệt ướt có nhiệt độ gây bỏng thường không cao như bỏng do nhiệt khô Các trường hợp bỏng ướt như: bỏng do nước sôi ở 100 oC, bỏng do

thức ăn nóng sôi ở nhiệt độ từ 50 đến100 oC, dầu mỡ sôi ở 180 oC, hơi nước nóng phun ra từ các nồi áp suất, nồi hấp… Tuy nhiệt độ không quá cao nhưng nếu tác dụng kéo dài trên da cũng sẽ gây bỏng sâu và nặng

Đối với trẻ nhỏ, bỏng do nhiệt ướt là chủ yếu (67%) Còn đối với người lớn, bỏng do nhiệt khô lại chiếm phần lớn (64,7%) [19], [43]

1.2.1.3 Bỏng do nhiệt phối hợp tác nhân khác

- Bỏng do hoá chất: acid mạnh, kiềm mạnh…

- Bỏng do bức xạ nhiệt: tia cực tím, tia laser…

1.2.2 Mức độ tổn thương do bỏng

Mức độ tổn thương do bỏng gây ra sẽ tùy thuộc vào nhiệt độ, thời gian tiếp xúc và diện tích tiếp xúc với nhiệt Nhiệt độ càng cao, diện tích tiếp xúc bỏng càng rộng và thời gian tiếp xúc càng lâu thì tổn thương bỏng càng nặng

1.2.2.1 Phân loại độ sâu bỏng

Độ sâu của bỏng được phân ra 4 mức [1]

Bảng 1.1 Phân loại độ sâu của bỏng

độ lan rộng theo chiều sâu khác nhau đối với vùng chân bì ở dưới

Bỏng tác động tới toàn bộ chiều sâu của da: Tác động phá huỷ thượng bì và chân bì, với mức

độ lan rộng tới tổ chức dưới da;

không đau, không trắng khi ép mạnh Bỏng độ 3 có thể biểu hiện dưới dạng màu xanh hay trắng hoặc có thể cứng hay cháy thành than

Lan rộng tới

tổ chức dưới da, cân cơ hay xương

Tùy theo mức độ tổn thương bỏng: diện tích bỏng, độ sâu bỏng, vị trí bị bỏng và trạng thái cơ thể (người cao tuổi, trẻ em, phụ nữ có thai, bệnh kết hợp, chấn thương kèm theo…) mà có biểu hiện phản ứng tại chỗ và toàn thân khác nhau

1.2.3 Sinh lý bệnh bỏng

1.2.3.1 Ảnh hưởng lên toàn thân của bỏng

Bỏng gây tổn thương trực tiếp các tế bào và tổ chức, dẫn đến rối loạn chức năng ở các bộ phận, gây ra sự phản ứng toàn thân để tự bảo vệ và phục hồi Bỏng diễn biến qua nhiều thời kỳ, thường được chia thành 4 thời kỳ [4]:

* Thời kỳ sốc bỏng: xuất hiện 48 giờ đầu sau khi bị bỏng, gồm các phản ứng bệnh lý cấp Sốc bỏng là kết quả của sự tác động lẫn nhau của tổn thương

mô trực tiếp, giảm thể tích tuần hoàn và giải phóng nhiều chất trung gian gây viêm, có ảnh hưởng đến cả vi tuần hoàn và chức năng của tim và phổi [4],[64] Các chất trung gian gây viêm và hoạt mạch như histamin, prostaglandin và cytokine được giải phóng gây ra rò rỉ mao mạch hệ thống, mất dịch nội mạch và dịch chuyển lớn [80]

* Thời kỳ nhiễm độc cấp tính: xuất hiện từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 15 sau khi bị bỏng do hấp thu các chất độc từ tổn thương bỏng, do hoại tử tan rã

tổ chức Thời kỳ này có tỉ lệ biến chứng và tử vong cao nhất

* Thời kỳ nhiễm trùng: do hàng rào da bị mất rộng, giai đoạn này kéo dài từ ngày 11 cho đến khi toàn bộ chỗ mất da được vá xong Nếu không được vá da thì bệnh nhân sẽ bị sốt, gầy mòn, kém ăn, mất ngủ Tổn thương bỏng có tổ chức hạt phù nề, nhiễm khuẩn

* Thời kỳ hôì phục: tổn thương bỏng lành sẹo, các chức năng dần được phục hồi

Trên thực tế lâm sàng, các hội chứng bệnh lý thường chồng chéo, ảnh hưởng lẫn nhau nên không có một thời kỳ nào diễn ra riêng rẽ và biểu hiện thành hội chứng rõ rệt [39], [47]

1.2.3.2 Quá trình lành vết thương da

Quá trình lành vết thương bỏng là một quá trình sinh học phức tạp, gồm

ba giai đoạn chồng gối lên nhau là giai đoạn viêm cấp, giai đoạn tăng sinh sửa chữa vết thương và giai đoạn hình thành sẹo [39], [47]

Giai đoạn viêm cấp

Đặc trưng của giai đoạn này là các hiện tượng viêm cấp, xuất tiết, viêm nhiễm khuẩn có mủ, rụng hoại tử, hoạt hóa tiểu cầu và hệ thống đông máu [42], [45], [47]

Giai đoạn tăng sinh

Đặc trưng bởi sự tăng sinh mạch máu, hình thành mô mới Hiện tượng biểu mô hóa từ các tế bào biểu mô của lớp biểu bì tăng sinh sẽ lan phủ, che kín diện tích mô hạt và tổn thương bỏng hình thành sẹo [39]

Giai đoạn sửa chữa vết thương

Là giai đoạn dài nhất của quá trình lành vết thương Một số phương pháp được sử dụng để đánh giá quá trình phục hồi của vết thương như quan sát bằng mắt thường (đánh giá sự thu hẹp diện tích tổn thương bỏng, tình trạng tổn thương bỏng: tiết dịch, loét hay khô) và quan sát trên kính hiển vi về

Một số yếu tố toàn thân

- Vitamin: vitamin C cần cho quá trình tổng hợp collagen Vitamin A cần cho sự tổng hợp glycoprotein và proteoglycan, giúp tăng cường miễn dịch Thiếu vitamin A làm giảm quá trình tạo kháng thể do đó sẽ làm tăng khả năng nhiễm trùng [61], [65]

- Protein: thiếu sẽ dẫn đến suy giảm miễn dịch, giảm tổng hợp collagen

- Yếu tố đông máu XIII: thiếu yếu tố này sẽ giảm hình thành mạng lưới fibrin ổn định

- Tình trạng thiếu máu và áp lực oxy thấp ở mô kéo dài sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình lành vết thương [39]

1.2.4 Các thuốc điều trị vết thương bỏng

Hiện nay có các nhóm thuốc điều trị bỏng như sau:

- Nhóm dịch truyền nhằm bù chất điện giải, được dùng trong trường hợp bỏng sâu, diện rộng

- Nhóm thuốc kháng sinh, dùng khi nhiễm khuẩn nặng, nhiễm khuẩn toàn thân

- Nhóm thuốc điều trị tại chỗ vết thương bỏng

- Nhóm thuốc điều trị bỏng theo kinh nghiệm dân gian

- Nhóm thuốc điều trị tại chỗ tổn thương bỏng gồm các thuốc sau:

1.2.4.1 Thuốc làm rụng hoại tử

Giúp loại trừ nhanh mô hoại tử, hạn chế nhiễm khuẩn Nhóm này gồm các enzym tiêu huỷ protein Các enzym có nguồn gốc từ động vật (như pepsin, Chymotripsin), từ thực vật (như men paparin từ mủ quả đu đủ), từ vi sinh vật (như streptokinase) [50]

1.2.4.2 Thuốc kháng khuẩn, sát khuẩn

Nhóm này gồm các thuốc điển hình như: mỡ mudaxin, acid boric, bạc

nitrat, kem Chitosan 2%

Thuốc kháng khuẩn tại chỗ được sử dụng phổ biến nhất trong vết thương bỏng là bạc sulfadiazin 1% Đây là một tác nhân có phổ rộng, có hiệu quả chống lại cả vi khuẩn gram dương và gram âm.Ion bạc liên kết với DNA của vi khuẩn, giải phóng sulfonamide cản trở chất trung gian và con đường

trao đổi chất của vi khuẩn Nó có hiệu quả chống lại Pseudomonas aeruginosa và vi khuẩn đường ruột, và có hiệu quả tương đương với khả năng kháng lại Candida albicans và Staphylococcus aureus [19], [68]

1.2.4.3 Thuốc kích thích tái tạo tổn thương bỏng

Kích thích biểu mô, tái tạo mô hạt Trong nhóm thuốc này có nhiều loại thuốc như: các thuốc mỡ (dầu gan cá thu, dầu gấc có chứa các vitamin A, D), thuốc mỡ chế từ rau má, thuốc kem nghệ [61]

1.2.4.4 Thuốc làm se khô, tạo màng che phủ

Thành phần của thuốc có tannin tác dụng làm đông dịch vết thương, kết tủa protein, liên kết các tơ collagen tạo thành màng

Hiện nay, tại Việt Nam sulfadiazin bạc 1% đang được dùng khá phổ biến Nó là sự kết hợp của ion bạc với sulfadiazin, được sản xuất từ năm 1960 dưới dạng kem 1%, có phổ kháng khuẩn rộng với nhiều loại vi khuẩn như

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và nấm Candida [3] Thuốc có nhược điểm là ít thấm sâu vào mô hoại tử nên khó

kiểm soát được nhiễm khuẩn ở vết bỏng sâu [3], hơn nữa do dùng phổ biến và kéo dài nên đã có thông báo về hiện tượng nhờn thuốc của một số vi khuẩn với loại thuốc này Ở tổn thương bỏng thuốc có thể tách làm 2 pha, bạc và sulfadiazin, phần bạc có thể tích luỹ ở gan, thận, niêm mạc gây nhiễm độc [3]

1.3 Nhiễm khuẩn bỏng

1.3.1 Nhiễm khuẩn tại vết thương bỏng

Nhiễm khuẩn là một trong những biến chứng chủ yếu tại tổn thương bỏng, từ đó dẫn đến chậm quá trình lành vết thương Diễn biến tại chỗ của vết thương bỏng cũng như trạng thái toàn thân của bệnh nhân có liên quan chặt chẽ với số lượng và chủng loại vi khuẩn có mặt tại vết thương bỏng Mặc dù

hiện nay đã có nhiều tiến bộ trong công tác điều trị bệnh nhân bỏng, nhưng nhiễm khuẩn huyết vẫn là một trong những biến chứng nặng nhất của bệnh bỏng và là nguyên nhân tử vong cao [4], [19], [54]

1.3.1.1 Điều kiện phát sinh nhiễm khuẩn bỏng

* Điều kiện phát sinh tại chỗ

Vết thương bỏng làm mất hàng rào bảo vệ của da [4],[43] Khi da mất hàng rào bảo vệ thì sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn đang sinh sống trên da hoặc

vi khuẩn từ môi trường bên ngoài vào [47], [54] Đặc biệt là vi khuẩn ở môi trường bệnh viện xâm nhập vào cơ thể khi bệnh nhân chữa trị bỏng nặng tại bệnh viện [29], [43] Trong các vi khuẩn có mặt tại vết thương bỏng,

Pseudomonas aeruginosa có khả năng xâm nhập sâu và nhanh vào cơ thể,

khó trị [4], [29]

* Điều kiện phát sinh toàn thân

Sự suy giảm miễn dịch sau bỏng làm giảm sự chống đỡ của cơ thể, tạo điều kiện thuận lợi cho nhiễm khuẩn bỏng phát triển và lan rộng gây hậu quả nặng nề [54], [47] Có nhiều nguyên nhân gây tình trạng suy giảm miễn dịch sau bỏng như glucocorticoid, prostaglandin E2 tăng cao trong máu, nội độc tố của vi khuẩn…[47]

1.3.1.2 Các loài vi khuẩn chủ yếu gây nhiễm khuẩn bỏng

Thường gặp là trực khuẩn mủ xanh, tụ cầu vàng và các trực khuẩn đường ruột

* Tụ cầu vàng (S aureus) : vi khuẩn chủ yếu được phân lập từ tổn thương bỏng là Staphylococcus aureus, là nguyên nhân thường gặp nhất trong

các tác nhân gây nhiễm khuẩn bỏng, tỉ lệ phân lập được tại tổn thương bỏng dao động khoảng 33,85% [37], [54]

* Trực khuẩn mủ xanh (P.aeruginosa) : là nguyên nhân gây nhiễm

khuẩn bệnh viện hàng đầu Những nhiễm khuẩn này rất khó điều trị vì trực khuẩn mủ xanh kháng lại hầu hết các kháng sinh thông thường với mức độ

kháng rất cao [29], [4] Tỉ lệ phân lập tại tổn thương bỏng khoảng 18,46% [54]

* Các trực khuẩn đường ruột gây nhiễm khuẩn bỏng thường gặp là

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae có tỉ lệ phân lập tại tổn thương bỏng

khoảng 13,85% [54], [60]

1.4 Các mô hình thực nghiệm

1.4.1 Các phương pháp đánh giá độc tính tại chỗ

Dành cho các sản phẩm dùng ngoài da

1.4.1.1 Đánh giá độc tính tại chỗ theo hướng dẫn của Bộ Y tế, Quyết định

số 3113/1999/QĐ-BYT

Nguyên tắc

Thử kích ứng trên da là một phương pháp sinh học dựa vào mức độ phản ứng của da thỏ với chất thử so với phần da kế bên không đắp chất thử Phép thử không áp dụng cho các chất acid hoặc kiềm mạnh (pH < 2 hoặc pH>11,5) và các chất đã biết là có kích ứng trên da

Dụng cụ , hoá chất thí nghiệm

- Tông đơ điện hoặc một thiết bị thích hợp để làm sạch lông thỏ

- Kéo, panh

Động vật và điều kiện thí nghiệm

Sử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái (không sử dụng thỏ có chửa hoặc đang cho con bú), khoẻ mạnh, cân nặng không dưới 2kg Thỏ được nhốt riêng từng con và nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thử

Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng 25 ± 30C, độ ẩm tương đối 30-70%, ánh sáng đảm bảo 12 giờ tối, 12 giờ sáng hàng ngày

- Chất rắn: có thể dùng trực tiếp hoặc tán thành bột mịn rồi làm thành dạng bột ẩm với dung môi thích hợp để đảm bảo chất thử được tiếp xúc tốt với da

- Dung môi dùng để pha loãng, làm ẩm hoặc chiết xuất là các chất không gây kích ứng

* Đặt mẫu thử theo hướng dẫn

* Quan sát và ghi điểm

Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt chất thử so với da kề bên không đặt chất thử ở các thời điểm 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử Có thể kéo dài hơn thời gian quan sát khi có tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không hồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày

Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo qui định ở Bảng 1

- Ban đỏ nghiêm trọng (đỏ tấy) đến tạo thành vẩy để ngăn ngừa sự

Gây phù nề

- Phù nề nhận thấy rõ (viền phù nề phồng lên rõ) 2

- Phù nề nghiêm trọng (da phồng lên trên 1mm và có lan rộng ra

Những thay đổi khác trên da cần theo dõi và ghi chép đầy đủ

* Đánh giá kết quả

Bảng 1.3 Phân loại các phản ứng trên da thỏ

* Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả cần ghi đầy đủ các thông tin về mẫu thử, động vật thử (loài, số lượng) Ghi chi tiết cách chuẩn bị mẫu thử và cách đặt mẫu trên da, điểm của các lần quan sát, những nhận xét thêm nếu có và đánh giá kết quả Ghi chú:

- Đánh giá mức độ kích ứng trên da không nên chỉ dựa vào số điểm kích ứng mà còn căn cứ vào những mô tả sự thay đổi tình trạng da đã quan sát được

- Việc kết luận mẫu thử đạt chất lượng về chỉ tiêu kích ứng da hay không phải phụ thuộc vào yêu cầu riêng của từng sản phẩm

1.4.1.2 Thử nghiệm về độc tính tại chỗ theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”

Áp dụng với các thuốc có khả năng gây mẫn cảm da

Các chế phẩm thuốc dùng trị bệnh ngoài da cần phải thử

Bao gồm: các chế phẩm rắn (chuẩn bị để thử nghiệm bằng cách làm ướt chế phẩm với nước hay một dung môi thích hợp để có một dạng đồng nhất khi đắp vào da), chế phẩm mềm, chế phẩm lỏng

- Thử nghiệm với trợ chất Freund toàn bộ

- Thử nghiệm trên da mở (open epicutaneous test)

Đánh giá các kết quả thử nghiệm

Phản ứng da của động vật thử nghiệm được đánh giá theo quy chuẩn của từng phương pháp nghiên cứu đã dùng

1.4.1.3 Phương pháp đánh giá độc tính tại chỗ theo ISO 10993-10

Vật liệu thử

Nếu vật liệu thử dạng rắn hoặc dạng lỏng thì vật liệu phải được chuẩn

bị như quy định trong Phụ lục A

Nên bổ sung một đối chứng dương tính trên mỗi động vật ngoài đối chứng âm tính

vị trí thử) Khi dùng dung dịch trắng hoặc đối chứng âm tính, tính điểm số kích thích cơ bản cho đối chứng rồi trừ đi điểm số dùng vật liệu thử để nhận được điểm số kích thích cơ bản Cộng các điểm số cho mỗi động vật rồi chia tổng này cho số lượng động vật Giá trị này chính là chỉ số kích thích cơ bản

1.4.1.4 Đánh giá độc tính tại chỗ theo hướng dẫn của OECD (the Organisation for Economic Cooperation and Development )

Nguyên tắc

Chất thử nghiệm được bôi một liều duy nhất lên da động vật thí nghiệm Có đối chứng

Mức độ kích ứng được quan sát và ghi ở các khoảng thời gian cụ thể Những con vật có dấu hiệu đau đớn liên tục và / hoặc đau đớn ở bất kỳ giai đoạn nào của thử nghiệm phải được bị giết một cách nhân đạo

Chuẩn bị và thực hiện

Thỏ bạch trưởng thành khỏe mạnh là động vật thích hợp được sử dụng Khoảng 24 giờ trước khi thử nghiệm, nên loại bỏ lông bằng cách cạo sát vùng lưng của động vật Cần cẩn thận để tránh mài mòn và tổn thương da và chỉ nên dùng những động vật có da lành, nguyên vẹn

Động vật nên được nuôi riêng lẻ Nhiệt độ của phòng động vật thí nghiệm nên để ở 20 °C (± 3 °C) đối với thỏ Mặc dù độ ẩm tương đối nên ít nhất là 30% và tốt hơn là không vượt quá 70%, ngoại trừ trong quá trình dọn phòng, mục tiêu phải là 50-60% Ánh sáng phải là nhân tạo, trình tự là 12 giờ sáng, 12 giờ tối Để cho ăn, có thể sử dụng chế độ ăn thông thường trong phòng thí nghiệm với nguồn cung cấp nước uống không hạn chế

Vào cuối thời gian tiếp xúc, thường là 4 giờ, chất thử còn lại sẽ là loại

bỏ, sử dụng nước hoặc dung môi thích hợp mà không làm thay đổi phản ứng hiện có hoặc sự toàn vẹn của lớp biểu bì

Mức liều là 0,5 mL chất lỏng hoặc 0,5 g chất rắn/bột nhão

Con vật sẽ được quan sát trong 14 ngày, trừ khi sự kích ứng phát triển ở một thời điểm sớm hơn

Quan sát

Tất cả các động vật phải được kiểm tra các dấu hiệu ban đỏ và phù nề Các phản ứng được ghi ở 60 phút, sau đó ở 24, 48 và 72 giờ sau khi gỡ bỏ băng gạc Nếu có tổn thương trên da mà không thể xác định được do kích ứng hoặc ăn mòn ở 72 giờ, có thể cần quan sát cho đến ngày 14 để xác định khả

năng thay đổi của các phản ứng Ngoài việc quan sát kích ứng, tất cả các tác dụng độc hại tại chỗ, chẳng hạn như làm tan mỡ da, và bất kỳ tác dụng phụ toàn thân nào (ví dụ, ảnh hưởng đến các dấu hiệu nhiễm độc lâm sàng và cơ thể trọng lượng), cần được mô tả và ghi lại đầy đủ

1.4.2 Mô hình gây tổn thương bỏng

Với mong muốn phát triển một mô hình có thể tái tạo lại quá trình bỏng thử nghiệm, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm thiết kế mô hình gây bỏng

để tiến hành đánh giá hiệu quả của hoạt chất trị bỏng hoặc nhằm theo dõi diễn tiến của quá trình bỏng trong quy mô nhỏ ở động vật trước khi tiến hành những đánh giá lâm sàng trên người

1.4.2.1 Mô hình bỏng do hơi nước thử nghiệm ở chuột của Vlad Porumb

Hệ thống được phát triển để da chuột tiếp xúc với hơi nước dựa trên một thiết

kế mới, tích hợp với điều khiển bằng máy tính Mô hình thử nghiệm động vật gồm ba nhóm chuột được cho tiếp xúc với hơi nước trong 1, 3 và 7 giây Các tổn thương được đánh giá sau 20 phút, 48 giờ và 72 giờ sau khi bắt đầu tiếp xúc Kết quả tiếp xúc hơi nước trong một giây tạo ra tổn thương bỏng độ hai; tiếp xúc ba giây gây bỏng độ hai sâu; tiếp xúc bảy giây dẫn đến bỏng độ

ba [82]

1.4.2.2 Mô hình thực nghiệm bỏng trên thỏ của Raluca L Sobec

Sử dụng 24 thỏ đực New Zealand làm mô hình thử nghiệm Vật gây bỏng là thiết bị bằng đồng được nung ở nhiệt độ từ 43-48 độ C, vết bỏng được gây ra với thời gian tiếp xúc là 3, 4, 5 và 7 giây Kết quả tạo vết bỏng sâu độ 2 ở 43

°C trong 4 giây [67]

1.4.2.3 Mô hình gây bỏng trên da lợn

Mô hình có thể tái tạo được về tổn thương bỏng ở lợn Trắng Lớn chưa trưởng thành Vết bỏng do tiếp xúc được tạo ra bằng cách sử dụng nước ở 92 °C tác động lên da trong 15 giây [44]

1.4.3 Mô hình nhiễm khuẩn bỏng

1.4.3.1 Mô hình gây nhiễm khuẩn trên vết thương bỏng ở da lợn

Sử dụng thiết bị kim loại (Đồng thau, không gỉ) được làm nóng đến ≥100

° C và áp lên da trong một khoảng thời gian xác định tùy thuộc vào độ sâu vết bỏng cần thiết Sau đó, vi khuẩn được bôi tại chỗ lên vết thương để gây nhiễm trùng Mô hình tạo vết thương bỏng này đã được sử dụng rộng rãi để nghiên

cứu sự hình thành màng sinh học ở một loạt các loài bao gồm S aureus, P aeruginosa, A baumannii, Bacillus subtilis và Enterococcus faecalis Mô

hình màng sinh học vết thương bỏng ở lợn đã cung cấp một số dữ liệu quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị và băng bó vết bỏng thử nghiệm Nó cũng cung cấp một cái nhìn sâu sắc về tác động của sự hình thành

màng sinh học S aureus đối với quá trình tái tạo do giảm sản xuất collagen

Mặc dù có tất cả những ưu điểm đã đề cập ở trên, điều quan trọng là phải xem xét rằng thủ thuật chấn thương bỏng và nhiễm trùng đồng thời là một thủ tục cực kỳ xâm nhập và gây đau đớn cho động vật Mô hình lợn cũng là một mô hình tốn kém và bảo trì cực kỳ cao Ngoài ra, kích thước của con vật khiến chúng có nguy cơ cao bị nhiễm trùng vết thương không mong muốn, có nghĩa

là cần phải cẩn thận hơn khi xử lý mô hình này [30]

1.4.3.2 Mô hình tạo vết thương bỏng nhiễm khuẩn ở Galleria mellonella

Galleria mellonella là một loài bướm đêm Việc chữa lành vết thương ở

loài động vật không xương sống này đã được chứng minh là xảy ra thông qua quá trình tái biểu mô hóa như đã thấy ở người Mô hình này đã được chứng minh là thể hiện nhiều đặc điểm của chấn thương vết bỏng và nhiễm trùng được thấy ở các mô hình động vật có vú như mối tương quan giữa kích thước vết thương và tiên lượng sống sót, lợi ích sống sót của liệu pháp bù nước và tỷ

lệ tử vong tăng mạnh sau khi bôi nhiễm trùng vết bỏng Vết thương bỏng có thể được gây ra bằng cách nung một dụng cụ kim loại (thép không gỉ) đến >

100 °C và áp dụng cụ vào lưng ấu trùng trong khoảng 4 giây Sau đó bôi vi khuẩn lên vết thương để gây nhiễm trùng Mô hình này đã được thử nghiệm

với P aeruginosa, S aureus và A baumannii Mỗi tác nhân gây bệnh này

đều làm giảm tỷ lệ sống sót của ấu trùng bị nhiễm bệnh So với mô hình Sinh vật nhân chuẩn cao hơn, mô hình này có một số hạn chế, một trong số đó là thiếu hệ thống miễn dịch thích ứng Tuy nhiên, hệ thống miễn dịch bẩm sinh

của G mellonella tương tự như hệ thống miễn dịch của động vật có vú và

điều này đã cho phép nó ngày càng phổ biến trong một loạt các lĩnh vực nghiên cứu Một hạn chế khác là da có cấu trúc khác với da của con người với một lớp biểu bì duy nhất được bao phủ bởi lớp nội bì và lớp ngoại bì [30]

1.5 Tình hình nghiên cứu

1.5.1 Tình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có các công trình nghiên cứu về bỏng, như nghiên cứu

điều trị và chữa bỏng của Matthew P Rowan và cộng sự (2015) [50] Nghiên

cứu về tác dụng của lá Kalanchoe pinanta trong điều trị nhiễm trùng bàn chân

do bệnh tiểu đường của S Cawich, P.Harnarayan và cộng sự (2014), kết quả cho thấy có giá trị trong việc sử dụng lá Thuốc bỏng tại chỗ để điều trị nhiễm trùng bàn chân do tiểu đường[70] Nghiên cứu của Davood Mehrabani và cộng sự (2014) với nội dung “Tác dụng làm lành vết thương của Curcumin

đối với vết thương bỏng ở chuột”, kết quả cho thấy curcumin giảm kích thước

của vết thương bỏng sau 14 ngày [20] Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu về

tác dụng chữa bỏng của dược phẩm chứa thành phần Kalanchoe pinanta trên thực nghiệm

1.5.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Các công trình nghiên cứu chế phẩm trị bỏng đã xuất hiện tại Việt Nam như nghiên cứu của Đỗ Thị Hoàng Dung vào năm 1997 với nội dung “ Điều trị bỏng thực nghiệm bằng cao Xoan trà, mỡ Rau má, mỡ Mã đề, kem Nghệ” được thực hiện trong Luận án phó tiến sỹ khoa học y dược, Học viện quân y, tại Hà Nội [2] Nghiên cứu của Lê Bách Quang (2006) có tên là “ Hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc mỡ Maduxin từ lá cây sến mật (Madhuca pasquieri)

để điều trị tổn thương bỏng, vết thương [5] Nghiên cứu của Nguyễn Thanh Chung với nội dung “Nghiên cứu tác dụng điều trị tại chỗ của gel ceri nitrat 2,2% trên vết thương bỏng do nhiệt” được đăng trên tạp chí Y dược học quân

sự, số 1 năm 2021 [6] Tuy nhiên vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về tác dụng làm lành tổn thương bỏng của dược phẩm chứa thành phần lá Thuốc bỏng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1 Nguyên liệu

Cao xoa chứa thành phần lá Thuốc bỏng Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers

được bào chế theo công thức trong luận văn của tác giả Đào Bùi Linh Chi (2020 ), trường Đại học Y Dược Cần Thơ

Tiến hành bào chế cao xoa theo quy trình được mô tả tại PL.2

2.1.1.3 Chủng vi khuẩn mẫu quốc tế dùng trong nghiên cứu

Chủng vi khuẩn chuẩn: Staphylococus aureus ATCC 29213, chủng này được

nhập, bảo quản, nuôi cấy tại khoa Vi sinh trường Đại học Y Dược Cần Thơ

2.1.1.4 Phương tiện

Hóa chất, dung môi, thuốc thử

Hóa chất trình bày tại Bảng 2.2

Bảng 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

STT Hóa chất, dung môi Tiêu chuẩn Nguồn gốc

- Thuốc gây mê cho động vật: Ketamine HCl 1000mg/10ml dạng tiêm, sản xuất bởi Auromedics Pharma LLC, Mỹ

- Thuốc giảm đau sau bỏng cho động vật: Morphin HCL (biệt dược là Norspan) do công ty Mundipharma sản xuất

- Thuốc chứng: Sulfadiazin- bạc 1% (biệt dược Silvadene®) dạng kem bôi 1% sản phẩm của Công ty Pfizer U.S

- Chất bù dịch cho động vật: Ringer lactat

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn S aureus: Blood agar, sản xuất bởi

Merck, Đức

Thuốc Ketamin và Morphin được quản lý theo thông tư số BYT của Bộ Y tế qui định chi tiết một số điều của Luật Dược và Nghị định số 54/2017/NĐ-CP về thuốc và nguyên liệu làm thuốc phải kiểm soát đặc biệt

20/2017/TT-Thiết bị dụng cụ

Bảng 2.2 Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

3 Cân phân tích Kern ABJ 220 – 4NM, độ Đức

Một số dụng cụ thường quy khác trong phòng thí nghiệm

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Cao xoa đạt tiêu chuẩn cơ sở theo phụ lục 1

Động vật nghiên cứu được chọn theo bảng 2.4

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu đối với động vật nghiên cứu

Nghiên cứu Đối tƣợng Tiêu chuẩn chọn mẫu

Độc tính tại chỗ Thỏ trắng

Cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng > 2 kg

Tác dụng điều trị bỏng

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino

Cả 2 giống, khỏe mạnh, cân nặng 20-28gram Tác dụng kháng khuẩn

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Cao xoa không đạt tiêu chuẩn cơ sở tại phụ lục 1

Thỏ chết trong quá trình thử nghiệm

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Liên Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng và Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Y Dược Cần Thơ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các bước nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ nghiên cứu sau:

Sơ đồ 2.1 Quy trình nghiên cứu

2.2.1.Thiết kế nghiên cứu (loại hình nghiên cứu)

Bào chế cao xoa chứa thành phần

Đánh giá độc tính tại chỗ của cao xoa có thành phần lá Thuốc bỏng trên thỏ bỏng đối với vết thương Tạo mô hình gây bỏng

thương bỏng của cao xoa

Xác định khả năng kháng khuẩn in vivo

của cao xoa khuStaphylococcus aureus trên mô hình thực nghiệm ở

Nghiên cứu thực nghiệm

2.2.2 Cỡ mẫu

Nghiên cứu độc tính tại chỗ sử dụng 3 thỏ

Khảo sát mô hình gây bỏng nhiệt bằng hơi nước sử dụng tổng cộng 18 chuột Chia thành 03 lô, mỗi lô 06 chuột [82]

Nghiên cứu tác dụng điều trị bỏng sử dụng tổng cộng 30 chuột Chia thành 05 lô, mỗi lô 06 chuột [82]

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu

Chọn mẫu ngẫu nhiên

- Chọn mẫu khi khảo sát mô hình bỏng và mô hình nhiễm khuẩn bỏng: đánh số thứ tự chuột cái từ 1 đến 9 và từ 10 đến 18 ở chuột đực, sau đó bốc thăm riêng chuột đực và chuột cái, chia ngẫu nhiên 06 con chuột vào 3 lô Mỗi lô gồm 3 con chuột đực và 3 con chuột cái

- Chọn mẫu khi xác định khả năng làm lành tổn thương bỏng và khả

năng kháng khuẩn S aureus trên tổn thương bỏng: đánh số thứ tự chuột cái từ

1 đến 15 và từ 16 đến 30 ở chuột đực, sau đó bốc thăm riêng chuột đực và chuột cái, chia ngẫu nhiên 06 con chuột vào 5 lô Mỗi lô gồm 3 con chuột đực

và 3 con chuột cái

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

2.2.4.1 Đánh giá độc tính tại chỗ (khả năng gây kích ứng da)

Nghiên cứu khả năng gây kích ứng da của cao xoa lá Thuốc bỏng tiến hành dựa trên hướng dẫn của OECD 404 và QĐ 3113/1999 của Bộ Y tế về việc đánh giá kích ứng da dành cho các sản phẩm dùng ngoài da

Phương pháp thu thập số liệu

Trước ngày thí nghiệm, làm sạch lông thỏ ở vùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng để đặt các mẫu thử và đối chứng (khoảng 10cm

x 15cm) Mỗi mẫu được thử trên 03 thỏ Lấy 0,5g thuốc thử trải trên lên

miếng gạc vô khuẩn 2,5 cm x 2,5 cm đắp lên da theo các vị trí như Hình 2.1

Cố định miếng gạc bằng băng dính trong 4 giờ Sau đó bỏ gạc và băng dính, chất thử còn lại được làm sạch bằng nước ấm

Hình 2.1 Định vị các vị trí ứng dụng trên da thỏ

Quan sát và ghi điểm phản ứng các thời điểm 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo Bảng 2.4

- Ban đỏ vừa phải đến nặng

- Ban đỏ nghiêm trọng (đỏ tấy) đến tạo thành vẩy để

ngăn ngừa sự tiến triển của ban đỏ

Điểm đặt mẫu đối chứng

2 Gây phù nề

- Không phù nề

- Phù nề rất nhẹ (vừa đủ nhận thấy)

- Phù nề nhận thấy rõ (viền phù nề nặng lên rõ)

- Phù nề vừa phải (da phồng lên khoảng 1 mm)

- Phù nề nghiêm trọng (da phồng lên trên 1 mm và có

lan rộng ra vùng xung quanh)

Tổng số điểm kích ứng tối đa có thể của mẫu thử 8

Đánh giá kết quả: Trên mỗi thỏ, điểm phản ứng được tính bằng tổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát Điểm kích ứng của mẫu thử được lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử Điểm phản ứng của mẫu thử được trừ đi số điểm của mẫu đối chứng Chỉ sử dụng các điểm ở những thời gian quan sát ở 1h, 24h, 48h và 72h để tính kết quả theo Bảng 2.5

Bảng 2.5 Đánh giá mức độ gây độc tính tại chỗ

Đánh giá các điểm kích ứng trên da thỏ bằng phần mềm ImageJ:

+ B1: Chụp ảnh vùng da thử nghiệm của thỏ bằng máy ảnh: yêu cầu rõ vùng da đã được cạo lông và bôi cao xoa lá Thuốc bỏng

+ B2: Đếm số điểm kích ứng bằng phần mềm ImageJ:

- Chuyển đổi hình ảnh màu đã quét của vùng kích ứng sang thang độ xám: Image → Type → 8-bit

- Sử dụng công cụ crop để xác định vùng tổn thương: Image → crop

- Xác định phạm vi các điểm kích ứng: Process → Binary → Make Binary

- Đếm số điểm kích ứng: Analyze → Analyze Particles

mô hình của Durmus AS và cộng sự [27]

- Chuột được chia ngẫu nhiên thành ba lô bằng nhau, mỗi lô chứa 06 con chuột và được dán nhãn lần lượt là Nhóm 1, Nhóm 2 và Nhóm 3

- Gây mê bằng ketamine với liều 100mg/Kg [36]

- Cạo lông vùng lưng chuột Đặt vuông góc thiết bị tạo hơi nước nóng với vùng da tiếp xúc

- Nhóm 1 tiếp xúc với hơi nước nóng trong một giây, nhóm 2 tiếp xúc trong ba giây và nhóm 3 tiếp xúc trong bảy giây

- Bổ sung ringer lactat cho chuột ngay sau khi gây bỏng với thể tích 1 ml/100g để tránh sốc do mất dịch

- Giảm đau sau bỏng bằng cách tiêm dưới da Morphin hydroclorid 10mg/kg x 1 lần/ngày trong 1 ngày đầu tiên hoặc cho đến khi hy sinh [78]

Trong suốt quá trình khảo sát, quan sát trạng thái da thay đổi dựa trên các tình trạng sau: sưng, đỏ, phồng rộp, phù nề, đóng vảy, tiết dịch, mô hạt,

chảy máu, mô sẹo, và các biến chứng hoặc nhiễm trùng tại chỗ được ghi lại bằng máy ảnh kỹ thuật số

 Tiến hành nghiên cứu tác dụng điều trị bỏng của cao xoa chứa thành phần lá Thuốc bỏng trên vết thương bỏng nhiệt

Mô hình tổn thương bỏng độ 2 được thực hiện dựa trên kết quả khảo sát mô hình bên trên

Phương pháp thu thập số liệu

Quy trình thực hiện

Chuột nhắt trắng được gây bỏng nhiệt ở độ 2 bằng hơi nước theo phương pháp Vlad Porumb và cộng sự kết hợp với mô hình của Durmus AS

và cộng sự đã được mô tả trong mục 2.2.4.2 [82], [27]

Chuột được chia thành 5 lô, mỗi lô 06 con:

- Lô 1 (chứng sinh học): không gây tổn thương bỏng

- Lô 2 (mô hình): gây bỏng trên da Bôi tá dược 4 lần/ngày

- Lô 3 (chứng dương): gây bỏng trên da Bôi sulfadiazin - bạc 4 lần/ngày

- Lô 4 (cao xoa liều thấp): gây bỏng trên da

Bôi cao xoa với liều 0,1g x 4 lần/ngày

- Lô 5 (cao xoa liều cao): gây bỏng trên da

Bôi cao xoa với liều 0,1 g x 6 lần/ngày

Cách thức bôi thuốc

Tá dược, sulfadiazin - bạc và cao xoa được dùng 0,1g/1 tổn thương bỏng, sau đó xoa đều 5 lần/1tổn thương bỏng trong 15 giây, đảm bảo phủ kín tổn thương bỏng Khoảng cách giữa các lần bôi cách nhau 2 giờ

Tỷ lệ chết của chuột sau khi gây bỏng

Sau khi gây bỏng, chuột được nuôi trong các chuồng riêng biệt cho ăn

và uống nước hàng ngày như nhau giữa các chuồng Đồng thời tiến hành quan sát, ghi lại ngày chết của chuột và lô tương ứng (nếu có)