Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y usnea undulata thu hái tại lâm đồng, việt nam từ vũ hảo; bùi trung hiếu; tạ kiến tường; liêu hoàng phú; hdkt ts phạm thị ngọc nga },{ tag

Theo nghiên cứu của Paul Bergner, usnic acid, một hợp chất có trong Usnea, có hiệu quả chống lại các vi khuẩn gram dương như Streptococcus, Staphylococcus và một số vi khuẩn gây viêm phổ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG CỦA SINH VIÊN

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LOÀI ĐỊA Y Usnea undulata

THU HÁI TẠI LÂM ĐỒNG, VIỆT NAM

TỪ VŨ HẢO

Ts PHẠM THỊ NGỌC NGA

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG CỦA SINH VIÊN

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LOÀI ĐỊA Y Usnea undulata

THU HÁI TẠI LÂM ĐỒNG, VIỆT NAM

Mã số đề tài: 20.T.CB.02

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô TS Phạm Thị Ngọc Nga, người đã trực tiếp hướng dẫn để chúng em có thể hoàn thành tốt đề tài này Nhờ có những lời hướng dẫn, dạy bảo của cô nên đề tài nghiên cứu của em mới có thể hoàn thiện tốt đẹp

Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn đến cô TS Nguyễn Thị Thu Trâm – Phó trưởng khoa KHCB, Trưởng bộ môn Hóa học, người đã đóng góp ý kiến, truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báu, hỗ trợ điều kiện và cơ sở vật chất, luôn giúp đỡ để chúng em hoàn thành đề tài này

Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn đến các thầy, cô ở bộ môn Hóa học, đặc biệt là cô Đỗ Thị Cẩm Hồng và anh Nguyễn Xuân Vinh cũng đã hỗ trợ và giúp

1 Từ Vũ Hảo – Dược K42 – Chủ nhiệm đề tài

2 Bùi Trung Hiếu – Dược K42 – Thành viên

3 Liêu Hoàng Phú – Dược K44 – Thành viên

4 Tạ Kiến Tường – Dược K43 – Thành viên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Từ Vũ Hảo xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong đề tài là trung thực và chưa từng được công bố,

sử dụng trong bất kỳ tài liệu nào

Cần Thơ, ngày tháng năm 2021

Chủ nhiệm đề tài

Từ Vũ Hảo

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

PHẦN 1 TÓM TẮT ĐỀ TÀI PHẦN 2 TOÀN VĂN CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH xi

DANH MỤC BẢNG BIỂU xii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về địa y 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại và hình dạng 3

1.1.3 Phân bố 4

1.1.4 Thành phần hóa học 5

1.1.5 Công dụng của địa y 10

1.2 Chi Usnea 11

1.2.1 Phân bố 11

1.2.2 Thành phần hóa học 12

1.2.3 Hoạt tính sinh học 12

1.2.4 Địa y Usnea undulata 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Hóa chất thiết bị 16

2.2 Địa điểm nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Chiết xuất cao 17

2.3.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao chiết 18

2.3.4 Xác định độ tinh khiết của các hợp chất phân lập từ địa y Usnea undulata bằng SKLM 19

2.3.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 19

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1 Chiết xuất cao 20

3.2 Phân lập và tinh chế các hợp chất 20

3.2.1 Cao n-hexane 20

3.2.2 Cao acetone 21

3.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 24

3.3.1 Chất UH1 24

3.3.2 Chất UH2 25

3.3.3 Chất UH3 25

Chương 4 BÀN LUẬN 27

4.1 Chiết xuất cao 27

4.2 Phân lập và tinh chế các hợp chất 27

4.2.1 Cao n-hexane 27

4.2.2 Cao acetone 28

4.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 29

4.3.1 Chất UH1 29

4.3.2 Chất UH2 31

4.3.3 Chất UH3 34

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

PHẦN 1 TÓM TẮT ĐỀ TÀI

1 PHẦN MỞ ĐẦU

Địa y – một dạng sống đặc biệt, là kết quả cộng sinh giữa nấm (mycoboint)

và một thành phần quang hợp (photoboint) thường là tảo, vi khuẩn lam Dạng sống cộng sinh này dẫn đến việc sản xuất các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp điển hình, đặc biệt là các polyphenolic với cấu trúc depside hoặc depsidone Các chất này đã được chứng minh có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxi hóa,… Usnea là một chi của địa y, thuộc họ Parmeliaceae Theo nghiên cứu của Paul Bergner, usnic acid, một hợp chất có trong Usnea, có hiệu quả chống lại các vi khuẩn gram dương như

Streptococcus, Staphylococcus và một số vi khuẩn gây viêm phổi Những đặc

tính tốt này hứa hẹn khả năng ứng dụng các hợp chất cô lập từ loài địa y Usnea

undulata vào các sản phẩm bảo vệ sức khỏe con người

Hiện nay, các nghiên cứu về địa y chỉ mới được bắt đầu trong những năm gần đây tại Việt Nam và ít có công bố nào về thành phần hóa học có trong

Usnea undulata Thêm vào đó, kết quả khảo sát thực địa cho thấy, địa y Usnea undulata phân bố rộng khắp trên cánh rừng thông thuộc tỉnh Lâm Đồng với số

lượng đủ lớn có thể thu hái phục vụ nghiên cứu Vì thế chúng tôi tiến hành đề

tài “Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y Usnea undulata thu hái tại Lâm

Đồng, Việt Nam”

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Loài địa y Usnea undulata thu hái tại Lâm Đồng vào tháng 02/2020 và

được định danh bởi Ts Kawinnat Buaruang, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học, Trường Đại học Ramkhamhaeng, Thái Lan

Mẫu khô lưu tại Phòng nghiên cứu – Khoa Khoa học cơ bản – Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Chiết xuất cao

Mẫu sau khi được thu hái thì được rửa sạch, phơi khô, bảo quản tại phòng nghiên cứu khoa Khoa học cơ bản Mẫu được cắt nhỏ trước khi bắt đầu chiết Địa y được chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet với các dung môi có độ

phân cực tăng dần: n-hexane, acetone, methanol thu được các dịch chiết

Cô quay dịch chiết thu được, cho bay hơi tự nhiên đến khối lượng không đổi thu được cao tương ứng

Phân lập hợp chất tinh khiết từ cao

Từ các loại cao chiết thu được, tiến hành sắc ký nhanh cột khô để được các phân đoạn đơn giản hơn, sau đó tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, kết tinh lại với các hệ dung môi thích hợp thu được các hợp chất tinh khiết

Xác định cấu trúc các hợp chất tinh khiết phân lập được

Cấu trúc các chất được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), khối phổ (ESI-MS) tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3 KẾT QUẢ

Từ 66g địa y Usnea undulata, tiến hành chiết bằng phương pháp Soxhlet

lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần và cô quay thu được cao

tương ứng: n-hexane (0.72g; 1.1%), acetone (5.0g; 7.6%) và methanol (1.2g;

1.8%)

Cao n-hexane: thu được 0.7g tinh thể màu vàng chất UH1, được xác định

là usnic acid

Cao acetone: thu được 0.5g tinh thể usnic acid màu vàng, chất dạng bột trắng UH2 (17mg), tinh thể trắng UH3 (6.3mg), tinh thể trắng UH4 (7.5mg)

và tinh thể trắng UH5 (12.3mg), trong đó đã các định được cấu trúc của chất UH2 là 4,6-diformyl-8-hydroxy-3-methoxy-1,9-dimethyl-11-oxo-11H-

dibenzo[b,e][1,4]dioxepine-7-carboxylic acid và UH3 là 5-((3-formyl-2-hydroxy-4-methoxy-6-methylbenzoyl)oxy)-3-hydroxy-4-

Với cao n-hexane, qua phương pháp kết tinh thu được 0.7g chất UH1,

được xác định là usnic acid

Với cao acetone, sau khi chạy sắc ký nhanh – cột khô thu được 3 phân đoạn thì phân đoạn 1 tiến hành kết tinh thu được 0.5g tinh thể usnic acid Phân đoạn 2 chạy sắc ký cột cổ điển thu được chất UH3 có tên IUPAC là 2-(ethoxycarbonyl)-5-((3-formyl-2-hydroxy-4-methoxy-6-methylbenzoyl)oxy)-3-hydroxy-4-methylbenzoic acid, là hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài

địa y Usnea undulata Phân đoạn 3 cũng được tiến hành sắc ký cột cổ điển thu

được chất UH2 có cấu trúc được các định là methoxy-1,9-dimethyl-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepine-7-carboxylic acid Cấu trúc của UH1, UH2 và UH3 đã được xác định bằng phổ NMR

4,6-diformyl-8-hydroxy-3-Từ các kết quả cho thấy cao acetone có hiệu suất chiết cao nhất và cũng chứa rất nhiều hợp chất có thể phân lập được, hứa hẹn nhiều cơ hội cho các đề

tài về sau

PHẦN 2 TOÀN VĂN CÔNG TRÌNH

NGHIÊN CỨU

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Từ nguyên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

1 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Quang phổ tương quan

đa liên kết hạt nhân

13 HSQC

Heteronuclear quantum correlation spectroscopy

single-Quang phổ tương quan đơn liên kết hạt nhân

14 MS Mass spectrometry Khối phổ

15 NMR Nuclear Magnetic Resonance

spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

STT Từ viết tắt Từ nguyên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

17 PE Petroleum ether Ete dầu hỏa

18 UV Ultraviolet Phổ tử ngoại

sulfuric acid)

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các dạng hình thái của địa y 4

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học các acid béo có trong địa y 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học nhóm dẫn xuất pulvinic acid có trong địa y 6

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học nhóm hợp chất đơn vòng thơm có trong địa y 7

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học nhóm depside có trong địa y 8

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học nhóm depsidone trong địa y 8

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học nhóm dẫn xuất của dibenzofuran 9

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học nhóm hợp chất anthraquinone, naphthoquinone và dẫn xuất 9

Hình 1.9 Loài địa y Usnea undulata 12

Hình 1.10 Sợi của địa y Usnea undulata được chụp phóng to 13

Hình 1.11 Cấu trúc các hợp chất hóa học đã được phân lập từ địa y Usnea undulata 15

Hình 3.1 Kết quả SKLM của UH1 21

Hình 3.2 Kết quả SKLM các phân đoạn cao Ac 21

Hình 3.3 Kết quả SKLM của UH3, UH4 và UH5 22

Hình 3.4 Kết quả SKLM của chất UH2 23

Hình 3.5 Kết quả SKLM của chất UH6 và chất phân hủy 24

Hình 4.1 Cấu trúc của usnic acid 30

Hình 4.2 Cấu trúc của UH2 33

Hình 4.3 Cấu trúc của stictic acid 33

Hình 4.4 Cấu trúc dự đoán UH3 36

Hình 4.5 Một số tương quan HMBC trong UH3 36

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Trang thiết bị 16

Bảng 2.2 Dung môi 16

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết cao 20

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký nhanh cột khô từ cao acetone 21

Bảng 3.3 Các chất phân lập từ phân đoạn 1 của cao Ac 22

Bảng 4.1 Tóm tắt kết quả phổ nghiệm của UH1 và so sánh 29

Bảng 4.2 Tóm tắt kết quả phổ nghiệm của UH2 và so sánh 32

Bảng 4.3 Tóm tắt kết quả phổ nghiệm của UH3 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Địa y là một dạng sống cộng sinh giữa nấm (phần mycobiont) và tảo hoặc

vi khuẩn lam (phần photobiont), đôi khi là cả ba [36] Địa y có thể sinh sống khắp nơi trên trái đất trong các điều kiện thời tiết từ ôn hòa đến khắc nghiệt: những vùng núi cao, sa mạc, vùng nhiễm mặn hay những nơi chịu tác động mạnh của ánh nắng mặt trời Dạng sống cộng sinh này dẫn đến việc sản xuất các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp điển hình, đặc biệt là các polyphenolic với cấu trúc depside hoặc depsidone Các chất này đã được chứng minh có hoạt tính sinh học, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxi hóa,…[2],[13],[18] Theo nghiên cứu của Paul Bergner, usnic acid, một hợp chất có trong các loài địa y thuộc chi Usnea, có

hiệu quả chống lại các vi khuẩn gram dương như Streptococcus,

Staphylococcus và một số vi khuẩn gây viêm phổi [29] Năm 2011, nghiên cứu

của Nasim Sultana trên cao n-hexane của loài địa y Usnea undulata thu hái ở rừng của tỉnh Eastern Cape, Nam Phi thu được 8 chất: methyl β-orsellinate,

norstictic acid, menegazziaic acid, usnic acid, hypoconstictic acid, salazinic acid, galbinic acid và 20-O-methylhypostictic acid [23] Những đặc tính tốt này hứa

hẹn khả năng ứng dụng các hợp chất cô lập từ loài địa y Usnea undulata vào

các sản phẩm bảo vệ sức khỏe con người

Các nghiên cứu về địa y tại Việt Nam chỉ mới bắt đầu trong khoảng 10 năm gần đây, chủ yếu được thực hiện bởi nhóm nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Kim Phi Phụng (Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – Đại Học Quốc Gia Thành Phố

Hồ Chí Minh) Các nghiên cứu này tập trung khảo sát thành phần hóa học, tìm kiếm hợp chất mới với định hướng điều trị ung thư

Năm 2011, từ cao diethyl ether, cao dichloromethan và cao acetone của

loài địa y Usnea Undulata, E Susithra và cộng sự đã cô lập ra 3 hợp chất tương

ứng là usnic acid, salazinic acid và lecanoic acid và cho thấy khả năng chống oxy hóa in vitro của 3 hợp chất này [6]

Năm 2015, từ cao chloroform của địa y Parmotrema praesorediosum,

Huynh BLC đã cô lập 7 hợp chất mới trong đó có 4 hợp chất thuộc nhóm diphenyl ether [11] Cùng năm, Duong TH công bố 17 hợp chất cô lập từ

Parmotrema tsavoense [5]

Năm 2016, nghiên cứu của Prashith Kekuda và cộng sự cho thấy họat tính

kháng khuẩn mạnh trên Bacillus subtilis và Klebsiella pneumoniae do sự hiện

diện của các chất chuyển hóa thứ cấp, điển hình là usnic acid và salazinic acid

trong địa y Usnea undulata [25]

Năm 2017, nghiên cứu của Lawerce P Timbreza và cộng sự cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên một số vi khuẩn đa kháng thuốc, đặc biệt là các vi

khuẩn gram dương và chủng Pseudomonas aeruginosa do sự hiện diện của các acid trong địa y thuộc chi Ramalina và Usnea [14]

Năm 2019, từ cao n-hexane của loài địa y Usnea undulata mọc tại Việt

Nam, Trung Do và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất: methyl orsellinate, methyl β-orsellinate, 7-hydroxyl-5-methoxy-6-methylphtalide, usnic acid và

salazinic acid và thử hoạt tính kháng khuẩn Helicobacter pylori [37]

Một số nghiên cứu khác về hóa thực vật được thực hiện trên các loài địa

y Ramalina farinacea, Lobaria orientalis và Roccella montagnei [4],[23],[24] Hiện nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài địa y Usnea

undulata mọc tại Việt Nam còn rất hạn chế

Vì thế chúng tôi quyết định tiến hành đề tài “Khảo sát thành phần hóa học

của loài địa y Usnea undulata thu hái tại Lâm Đồng, Việt Nam”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về địa y

1.1.1 Khái niệm

Địa y là loài thực vật cộng sinh giữa tảo và nấm đôi khi có thêm vi khuẩn Theo nghiên cứu, hiện nay trên thế giới có khoảng 18.500 loài địa y sinh sống, ước tính khoảng 6% bề mặt đất liền trên trái đất được bao phủ bởi địa y [27]

Cấu tạo thành phần của địa y bao gồm:

− Nấm: chủ yếu là nấm túi, đôi khi là nấm đảm có chức năng bảo vệ, vận chuyển, cung cấp nước và muối khoáng cho tảo

− Tảo (thường là tảo lục hoặc tảo lam) có chức năng tổng hợp chất hữu

cơ cho cả hệ cộng sinh sử dụng Tảo có thể phân bố đồng đều hoặc ở một phía của địa y

− Vi khuẩn nếu có thì làm chức năng cố định nitơ trong không khí cho tảo Về mặt cấu tạo, tản của địa y gồm các sợi nấm kết bện thành mô giả bao lấy tảo ở phía trong

Ngoài ra, bề mặt địa y có thể thấy các mầm phấn (cơ quan sinh dưỡng)

và thể quả của nấm, nổi cao hơn, bên trong chứa bào tử túi

1.1.2 Phân loại và hình dạng

Dựa vào hình thái bên ngoài địa y được chia làm ba dạng phổ biến: địa y dạng khảm, địa y dạng phiến và địa y dạng sợi [15]

− Dạng khảm: bề mặt của địa y khảm cực kì mỏng và bám chặt vào bề

mặt chủ bằng những sợi nấm có lõi (Hình 1.1a)

− Dạng phiến: địa y dạng phiến có hình dạng như tờ giấy mỏng Bề mặt trên và dưới khác biệt nhau rõ rệt, bám lỏng lẻo trên bề mặt chủ bằng

các rễ giả nên rất dễ bóc tách ra khỏi bề mặt chủ (Hình 1.1b)

Dạng sợi: Địa y dạng sợi có hình thức giống như bụi cây nhỏ, đứng trên

bề mặt chủ và xõa xuống (Hình 1.1c)

Hình 1.1 Các dạng hình thái của địa y Nguồn: https://courses.lumenlearning.com/microbiology/chapter/lichens/ 1.1.3 Phân bố

Địa y có thể sống bám ở nhiều dạng địa hình đất, đá, thân cây và trong nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt, khô hạn hay giá lạnh, từ vùng thấp đến núi cao, cho thấy chúng có tính chống chịu tốt Địa y xuất hiện trải dài trên mọi địa hình, từ đất đá dưới thấp cho đến cành cây từ trung bình đến cao, tại những khu rừng gỗ, rừng mưa, địa y đều có thể tồn tại [16]

Trong tự nhiên, địa y phát triển rất chậm Sự tăng trưởng của chúng được tính bằng milimet mỗi năm Tốc độ phát triển của địa y được Hale (1973) đã công bố hầu hết các loài địa y dạng phiến phát triển 0.5–4mm / năm, các loài địa y dạng sợi 1.5–5mm / năm và các loài địa y dạng khảm thì 0.5–2mm / năm [27] Phần lớn các loài địa y vùng ôn đới, cận nhiệt và nhiệt đới tăng trưởng vài milimét tới vài centimét trong một năm và phát triển mạnh nhất ở vùng khí hậu

ẩm ven biển và rừng mưa Bắc Mỹ Ở vùng rất lạnh và rất nóng, địa y phải mất hàng thế kỷ để đạt được kích thước lớn

1.1.4 Thành phần hóa học

1.1.4.1 Các con đường chuyển hóa

Cho đến nay khoảng hơn 1000 hợp chất hóa học, trong đó khoảng 800 hợp chất hóa học chất chuyển hóa thứ cấp của địa y được biết đến và đã được báo cáo thể hiện các hoạt động sinh học đa dạng [27] Hầu hết các chất chuyển hóa thứ cấp trong địa y là các hợp chất phenolic như: hợp chất đơn vòng thơm, depside, depsidone, depsone, dibenzofurane, lactones, quionon và các dẫn xuất pulvinic acid Các thành phần địa y được tổng hợp chủ yếu qua ba con đường chuyển hóa [27]

− Con đường acetyl-polymalonyl: đây là con đường tổng hợp phổ biến các chất trong địa y và khoảng 80% các chất chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp thông qua con đường này

− Con đường mevalonic acid: tổng hợp khoảng 17% tổng số các hợp chất bao gồm steroid và triterpenes

− Con đường shikimic acid: phần rất nhỏ của các chất chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp bằng con đường này bao gồm terphenylquinones

và dẫn xuất của pulvinic acid

1.1.4.2 Phân loại các hợp chất hóa học

acetoxyprotolichesterinic acid

lichesterinic acid

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học các acid béo có trong địa y

Nhóm dẫn xuất pulvinic acid

Calycin (3), epanorin, 4-hydroxyvulpinic acid, pulvinic acid, pulvinamide (4) là những hợp chất tiêu biểu thuộc nhóm pulvinic acid và dẫn

xuất [9],[23]

(3) calycin

(4) pulvinamide

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học nhóm dẫn xuất pulvinic acid có trong địa y

Nhóm hợp chất đơn vòng thơm

Nhóm chất đơn vòng thơm bao gồm nhiều hợp chất như: hợp chất đơn vòng thơm và dẫn xuất của chúng

Ester của 4­hydroxybenzoic acid như methylparaben (5), các hợp chất

đơn vòng phenol từ địa y như methyl γ-orsellinate (6), methyl orsellinate (7) và

methyl hematommate (8) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn [9],[23]

(5) methylparaben

(6) γ­orsellinate

(7) methyl orsellinate

(8) methyl hematommate

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học nhóm hợp chất đơn vòng thơm có trong địa y

Nhóm depside

Depside là nhóm hợp chất tạo thành do sự ngưng tụ của hai hoặc nhiều hydroxybenzoic acid, trong đó nhóm carboxyl của phân tử thứ nhất ester hóa với nhóm hydroxyl phenol của phân tử thứ hai Nhóm depside bao gồm nhiều

hợp chất như: didepsides, tri và tetra-depsides, benzyldepside

Một số depside tiêu biểu đó là atranorin (9), diffractaic acid (10), sekikaic

acid, … [9],[23]

(9) atranorin

(10) diffractaic acid

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học nhóm depside có trong địa y

Nhóm depsidone

Depsidone có thêm liên kết ether so với depside chỉ có liên kết ester, tạo thành cấu trúc vòng cứng nhắc Các depsidone đều dựa trên cấu trúc vòng 11H

- dibenzo [b,e][1,4]dioxepin -11-one Một số chất hóa học tiêu biểu cho nhóm

depsidone như: constictic acid (11), galbinic acid (12), hypocostctic acid,

norstictic acid…[9],[23]

(11) constictic acid

(12) galbinic acid

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học nhóm depsidone trong địa y

Nhóm dibenzofuran và dẫn xuất của chúng

Trong nhóm này, tiêu biểu nhất là (+) usnic acid (13) là hợp chất thể hiện

hoạt tính kháng sinh có tiềm lực nhất trong các hợp chất từ địa y, có tác dụng trên rất nhiều chủng vi khuẩn, ngoài ra còn kháng ung thư, hạ sốt và giảm đau

Ngoài ra còn có các hợp chất khác như ascomatic acid (14), alectosarmentin,

didymic acid, 3-O-demethylschizopeltic acid, [9],[23]

(13) (+) usnic acid

(14) ascomatic acid

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học nhóm dẫn xuất của dibenzofuran

Nhóm quinone

Nhóm quinone bao gồm nhiều hợp chất như: biphenylquinone, terphenylquinone, phenanthrenequinone, perylenequinone, anthraquinone, naphthoquinone và dẫn xuất

Hợp chất chứa nhân anthraquinone (15) hiện diện nổi bật trong thực vật

bậc cao và nấm nhưng cũng là thành phần quan trọng trong địa y Các hợp chất

anthraquinone là tác nhân kháng virus, kể cả HIV, đặc biệt là hypericin (16)

[6]

Napthoquinone là nhóm hợp chất có nguồn gốc từ naphthalene, đáng chú

ý có naphthazarin [23]

(15) anthraquinone

(16) hypericin

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học nhóm hợp chất anthraquinone,

naphthoquinone và dẫn xuất

+ Steroid như cholesterol, ergosterol, lichesterol…

+ Carotenoid như carotene, lutein, neoxanthin… [23]

1.1.5 Công dụng của địa y

Trong y học: Địa y có thể chữa bệnh khó tiêu, viêm phế quản, nấm, và

nhiều rối loạn về máu và tim Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi,

Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ não Ahmadjian và Nilsson công bố địa

y Cetraria islandica bán rộng rãi trong các tiệm bào chế thuốc ở Thụy Điển và

dùng để điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh phổi và bệnh viêm mũi [39] địa y

Peltigera canina được sử dụng ở Ấn Độ như một dược phẩm làm giảm đau

[27]

Tác động đến môi trường: Địa y thực hiện nhiều chức năng hữu ích

trong môi trường Chúng chứa vi khuẩn lam và có thể cố định nitơ trong đất Trên bề mặt của địa y, các lớp biểu bì có khả năng hấp thụ các chất gây ô nhiễm, địa y là những chất sinh học được nghiên cứu nhiều nhất về chất lượng không khí, dùng để đánh giá ô nhiễm không khí Ngoài ra địa y từ các loài Usnea đã được sử dụng để đánh giá các mô hình lắng đọng kim loại nặng ở Nam cực Các hoạt động được thực hiện trong các trạm khoa học khác nhau ở Nam cực

có thể tìm ra nguồn ô nhiễm tiềm tàng và góp phần vào việc lưu thông các kim

loại vi lượng trong khu vực này

Ngày nay, cùng với tiến bộ của khoa học, những hợp chất đã được tìm thấy trong địa y có những hoạt tính sinh học đối với con nguời và cây trồng như:

− Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao [9]: tác

dụng gây độc cho thực vật của Ergochrome AA (secalonic acid A), giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina của Evernic acid, ức

chế sự nảy mầm và phát triển của Lepidium sativum

− Hoạt tính tiêu diệt hoặc ức chế virus và enzym của virus [9]: tác

dụng chống lại virus HIV của Sulfate GE-3-S từ chlorosteraic acid,

acetylattes β (1-6) glucan từ loài địa y Umbilicaria esculenta (Miyoshi) Mink, tác dụng gây ức chế Virus Epstein-Barr (EBV) của

(+)-usnic acid, hoạt động chống lại virus HIV [14] của Sulfate

GE-3-S từ chlorosteraic acid, acetylattes β(1-6) glucan từ loài địa y Umbilicaria esculenta (Miyoshi) Mink

− Hoạt tính kháng khuẩn [9],[12],[16],[21],[23]: tác dụng trên

Helicobacter pylori (H pylori) của Protolichesterinic acid, (+)-usnic

acid, methyl-orsellinate, hợp chất usnic acid tác động trên một số

chủng gram âm và gram dương như bacteroides spp, clotridium

perfringens, Bacillus subtilis, P aeruginosa, R Solanacearum

− Hoạt tính kháng ung thư [9],[12],[16],[21],[22]: tác dụng kháng tế

bào ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu của usnic acid, tác dụng chống lại tế bào ung thư bạch cầu K-562 của protolichesterinic acid,

ức chế tế bào ung thư MCF-7, NCI-H460 của (+) usnic acid, methyl orseliante

1.2 Chi Usnea

1.2.1 Phân bố

Chi Usnea phân bố rộng rãi, được tìm thấy khu vực thuộc rừng nguyên sinh có độ cao từ trung bình đến cao từ 1000-3000m, đặc biệt là trong rừng linh sam [38] Tản của chi này thường mọc trên vỏ cây, trong khi một số các loài khác mọc ở dưới đất hoặc trên đá Chúng có mặt khắp cả các châu lục trên thế

giới, trải dài từ châu Á, Châu Âu, Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Đại Dương [1],[17],[26],[28],[34],[38]

1.2.2 Thành phần hóa học

Chi này chứa các chất bao gồm nhiều các hợp chất hóa học, trong đó các acid đặc trưng như constictic acid, hypoconstictic acid, stictic acid, galbinic acid, norstictic acid, salazinic acid, (+)-usnic acid [7],[17] và các nhóm hợp chất đã trình bày ở phần 1.4.2

1.2.3 Hoạt tính sinh học

Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong các loài địa y thuộc chi Usnea có những hoạt tính sinh học rất đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng vi sinh vật, có tác dụng chống oxy hóa [7],[12],[27],[33]

1.2.4 Địa y Usnea undulata

1.2.4.1 Thực vật học

Tên gọi: Usnea undulata

Theo Randlane và các cộng sự công bố năm 2009, Usnea undulata còn

có các tên gọi khác như: Usnea dasaea Stirt., Usnea dolosa Motyka, Usnea

galbinifera Asahina, Usnea spinigera Asahina, Usnea spinulifera (Vain.)

Motyka

Hình 1.9 Loài địa y Usnea undulata

Chi: Usnea Loài: Usnea undulata

1.2.4.3 Đặc điểm hình thái

Hình dạng của loài địa y Usnea undulata được mô tả chi tiết bởi các nhà

khoa học Swinscow, T và H Krog năm 1975 là dạng bụi hoặc dạng treo, kích thước 2-15cm, nhánh đôi khi có màu xám nhạt hoặc màu xám ô liu, có màu đồng nhất ở phần thân Phần lõi thông thường dày đặc Trục màu trắng đến hồng nhạt Các sợi thường nhiều nhưng thưa thớt trên mẫu gốc (holotype) [34]

Hình 1.10 Sợi của địa y Usnea undulata được chụp phóng to

1.2.4.4 Phân bố

Theo một số tài liệu đã được công bố trước đây, loài địa y Usnea

undulata xuất hiện rất phổ biến trên thế giới [21]

Usnea undulata được tìm thấy ở Ấn Độ như vùng Arunachal Pradesh,

Meghalaya, trên các ngọn đồi Nagaland, Sikkim, Uttarakhand ở Hymalia và

nam Tamil Nadu Ở Châu Phi, vùng rừng Hogsback, Eastern Cape thuộc Nam Phi, ngoài ra còn tìm thấy tại Kenia, Ethiopia – khu vực trung tâm của Châu Phi Tại Australia được tìm thấy tại New South Wales [31]

Ở Việt Nam loài địa y này mọc trên các cây thông vùng cao nguyên Lâm Đồng thuộc vùng Tây Nguyên, Việt Nam Nằm trên cao nguyên cao nhất của Tây Nguyên là Lâm Viên - Di Linh với độ cao 1500 mét so với mực nước biển [3],[35]

1.2.4.5 Thành phần hóa học

Ngoài các hợp chất hóa học cơ bản như các acid béo, carbohydrat,

carotenoid, terpen… có trong địa y, ở loài địa y Usnea undulata còn có các

hợp chất hóa học thứ cấp quan trọng được phân thành các nhóm sau:

− Nhóm đơn vòng thơm: Methyl γ-orselinate (6), methyl orselinate (7),

7-hydroxyl-5-methoxy-6-methylphtalide (9) [32],[35]

− Nhóm depside: Sekikaic acid (10)

− Nhóm depsidone: Salazinic acid (1), norstictic acid (2), menegazziac

acid (3), stictic acid (4), hypoconstictic acid (5),

2’-O-methylhypostictic acid (8), constictic acid (11), galbinic acid (12)

[32],[35]

− Nhóm dibenzofuran: (+) usnic acid (13) [32],[35]

(9)

của Usnea undulata và được thí nghiệm trên 5 loại vi khuẩn Gam (-): S typhi,

K pneumoniae, E coli, P aeruginosa, R Solanacearum và và 3 loại vi khuẩn

Gam (+): S aureus, B subtilis, B Coagulans kết quả đối chiếu với chloramphenicol - một chất kháng khuẩn tốt Kết quả Usnea undulata đều thể

hiện khả năng ức chế tất cả các vi khuẩn được chọn thử nghiệm Tuy nhiên, mức độ ức chế của vi khuẩn thử nghiệm khác nhau từ vi khuẩn này sang vi

khuẩn khác Tuy nhiên, không thấy tác dụng ức chế đối với R solanacearum

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Loài địa Y Usnea undulata thu hái tại Lâm Đồng vào tháng 02/2020 và

được định danh bởi Ts Kawinnat Buaruang, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học, Trường Đại học Ramkhamhaeng, Thái Lan

Mẫu khô lưu tại Phòng nghiên cứu – Khoa Khoa học cơ bản – Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ

2.1.2 Hóa chất thiết bị

Bảng 2.1 Trang thiết bị

2 Cân kỹ thuật AQT-600 ADAM Anh

3 Cân phân tích Pioneer AAJ 220-4NM OHAUS Nhật

4 Đèn UV 254/366 nm CAMAG Thụy Sĩ

5 Máy cô quay chân không HEIDOLPH Đức

6 Bộ chiết Soxhlet Isolab Đức

7 Phân cực kế Perkin Elmer 341 Fremont Mỹ

Bảng 2.2 Dung môi

STT Tên dung môi, hóa chất Sản xuất

4 Petroleum ether Vn-chemsol

8 Chất chuẩn usnic acid Phân lập và đã xác định cấu trúc từ

nghiên cứu trước

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng nghiên cứu – Khoa Khoa học cơ bản – Trường Đại Học Y Dược Cần Thơ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất cao

Mẫu sau thu hái thì được rửa sạch, phơi khô và bảo quản tại phòng nghiên cứu khoa Khoa học Cơ bản Mẫu được cắt nhỏ trước khi bắt đầu chiết

Địa y (66g) được chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet với các dung môi

có độ phân cực tăng dần: n-hexane, acetone, methanol thu được các dịch chiết

Với mỗi loại dung môi thì chiết trong 4 – 5 ngày với khoảng 800mL dung môi

để đảm bảo chiết kiệt các chất

Dịch chiết thu được đem cô quay chân không đến khối lượng không đổi thu được cao tương ứng

2.3.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao chiết

2.3.3.3 Cao methanol

Do giới hạn về thời gian cũng như một số tồn tại khách quan nên cao

methanol chưa được khảo sát

2.3.4 Xác định độ tinh khiết của các hợp chất phân lập từ địa y Usnea

undulata bằng SKLM

Nguyên tắc: khảo sát trên các hệ dung môi khác nhau để đánh giá độ tinh

khiết dựa vào vết chính duy nhất hoặc một vết chính và vết tạp

Điều kiện sắc ký và cách tiến hành:

Bản mỏng: Silica gel G (Merck – Đức)

Ba hệ dung môi khai triển:

- Hệ dung môi PE-C (8:2): đánh giá độ tinh khiết của UH1

- Hệ dung môi C-EA-acid formic (16:5:1): đánh giá độ tinh khiết của UH2

- Hệ dung môi PE:C (6:4): đánh giá độ tinh khiết của UH3, UH4 và UH5

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 25µL mỗi dung dịch thử

và chuẩn Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 8.5cm, lấy bản

mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới đèn UV 254nm và 365nm

Sau đó nhúng bảng mỏng vào thuốc thử VS và quan sát dưới ánh sáng thường

Quan sát, ghi nhận các vết ở sắc ký đồ và tính Rf

2.3.5 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm để xác định cấu trúc của các chất

phân lập được

Mẫu được gửi đo phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC tại

Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Hà Nội, Việt Nam

Các dữ liệu phổ dùng để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết xuất cao

Từ 66g địa y Usnea undulata, tiến hành chiết bằng phương pháp Soxhlet lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, acetone và

methanol Dịch chiết thu được đem cô quay chân không dưới áp suất giảm thu

được các cao chiết tương ứng được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết cao

Cao chiết Khối lượng cắn (g) Hiệu suất (%)

Mẫu cao n-hexane đem hòa tan trong ethyl acetate (EA), lọc lấy dịch và

đem kết tinh ở điều kiện thường (nhiệt độ phòng) thu được 0.7g tinh thể chất UH1 màu vàng, sau khi so sánh với các chất chuẩn sẵn có thì sơ bộ kết luận UH1 là usnic acid

Hình 3.1 Kết quả SKLM của UH1 3.2.2 Cao acetone

Với 5g cao acetone thu được, tiến hành sắc ký nhanh – cột khô với dung

môi chloroform (C) và acetone (Ac) theo tỷ lệ tăng dần, kết quả được trình bày

trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả sắc ký nhanh cột khô từ cao acetone

Phân đoạn Số bình

100 mL/bình

Hệ dung môi giải ly

C:Ac Khối lượng (g)

UH1 Usnic acid PE:C = 8:2 PE:C = 8:2

Hình 3.3 Kết quả SKLM của UH3, UH4 và UH5

PE:C = 6:4 PE:C = 6:4 PE:C = 6:4

UH3 UH4 UH5

UH3 UH4 UH5

UH4 UH5 UH4 UH5

3.2.2.2 Phân đoạn 2

Phân đoạn 2 theo kết quả từ SKLM gồm các chất khá phân cực được tiến hành sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi C:EA = 6:4 thu được 17mg một chất dạng bột màu trắng, được ký hiệu là UH2 Khi phát hiện bằng thuốc thử VS cho vết màu cam

Hình 3.4 Kết quả SKLM của chất UH2

3.2.2.3 Phân đoạn 3

Phân đoạn 3 được tiến hành sắc ký cột pha thuận bằng hệ dung môi C:EA

= 6:4 cũng thu được chất UH2 như trên

Sau đó, phần còn lại chứa những chất phân cực mạnh nên được tiến hành sắc ký cột pha đảo C18, thu được chất UH6 nhưng chất được tách ra bị phân hủy sau khi cô quay

UH2 UH2 C:EA:a.formic = 16:5:1

Hình 3.5 Kết quả SKLM của chất UH6 và chất phân hủy

3.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất

3.3.1 Chất UH1

Hợp chất UH1 có dạng tinh thể hình kim màu vàng, kết tinh trong EA và

có các đặc điểm sau:

− Hấp thụ UV ở  =254 nm;

− Trên SKLM, giải ly bằng hệ dung môi PE:C = 8:2 có R = f 0,2 Khi

hiện vết bằng thuốc thử VS cho vết màu tím xanh (Hình 3.1);

200.3 (Phụ lục 1.3)

Phổ DEPT (CDCl3): Phụ lục 1.4

UH6 chất phân hủy