Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp a, b, c, d, e, f của allopurinol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol trong nguyên liệu và thành phẩm của allopurinol .... Ứng dụng quy trình định lượng tạp chất liên quan trong một số nguyên liệu và thành phẩm al

Trang 1

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG CỦA SINH VIÊN

Trang 2

Chủ nhiệm đề tài:

Tham gia đề tài:

ĐỒNG THỜI 6 TẠP A,B,C,D,E,F CỦA ALLOPURINOL BẰNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Mã số đề tài : 21.T.KD.01

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS TS Dương Xuân Chữ

NGUYỄN DUY GIA BẢO VƯƠNG VINH HƯNG TRƯƠNG LÊ MINH THƯ Cán bộ hướng dẫn: THS LỮ THIỆN PHÚC

Cần Thơ - Năm 2022

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Liên bộ môn Hoá phân tích – Kiểm

nghiệm – Độc chất Đây là nơi tôi học tập, nghiên cứu và học hỏi thêm nhiều kiến

thức mới

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Ths.Ds Lữ Thiện Phúc, thầy là

người đã trực tiếp hướng dẫn, ân cần dìu dắt và giúp đỡ tôi giải quyết khó khăn

trong suốt quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu này Thầy đã truyền đạt kiến

thức đồng thời khơi gợi trong tôi lòng nhiệt huyết đam mê với nghiên cứu khoa

học

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy PGS.Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ – Trưởng Bộ

môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, cùng với tập thể các thầy cô giáo

Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất đã tận tình chỉ bảo, truyền đạy

những kiến thức và kinh nghiệm bổ ích

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến các bạn Vương Vinh Hưng, Trương Lê Minh

Thư, các bạn là những cộng sự đắc lực đã cùng tôi hoàn thành nghiên cứu này

Đồng thời, tôi gửi lời cảm ơn đến anh Ths.Ds Huỳnh Huỳnh Anh Thi - người

anh đi trước đã hướng dẫn chỉ bảo tận tình, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu

Tôi cũng cảm ơn đến các bạn lớp Dược K43 đã làm nghiên cứu ở Liên bộ môn

Hoá phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, các bạn đã giúp đỡ và cùng tôi trải qua

những khoảnh khắc tuyệt vời trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn và lời chúc sức khoẻ đến tất cả mọi người!

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

PHẦN 1 TÓM TẮT ĐỀ TÀI vii

PHẦN 2 TOÀN VĂN CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii

DANH MỤC HÌNH ẢNH xiv

DANH MỤC BẢNG xvi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về allopurinol 3

1.1.1 Tính chất vật lý 3

1.1.2 Tính chất hoá học 3

1.1.3 Tính chất dược lý 4

1.2 Tổng quan về tạp chất liên quan của allopurinol 5

1.2.1 Tạp chất A 5

1.2.2 Tạp chất B 6

1.2.3 Tạp chất C 7

1.2.4 Tạp chất D 8

1.2.5 Tạp chất E 9

1.2.6 Tạp chất Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat 10

1.2.7 Tính chất dược lý và độc tính các tạp allopurinol 11

1.2.8 Giới hạn cho phép của các tạp chất allopurinol theo Dược điển các nước 12

1.3 Kiểm nghiệm tạp chất allopurinol trong nguyên liệu và chế phẩm allopurinol theo Dược điển các nước 12

1.3.1 Kiểm nghiệm allopurinol trong nguyên liệu theo DĐVN V 12

Trang 6

1.4 Tóm tắt các công trình nghiên cứu về định lượng allopurinol và tạp chất liên

quan 20

1.5 Sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần 21

1.5.1 Hệ thống sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần 21

1.5.2 Đầu dò khối phổ ba tứ cục 22

1.5.3 Một số chế độ bắt ion của đầu dò khối phổ ba tứ cực 23

1.6 Thẩm định qui trình định lượng tạp trong thành phẩm và nguyên liệu là thuốc theo hướng dẫn ICH Q2(R2) 24

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 27

2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử và thiết bị 27

2.2.1 Chất chuẩn; hoá chất thuốc thử; mẫu thử 27

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 29

2.3.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F và định lượng allopurinol 31

2.3.3 Khảo sát điều kiện sắc kí tối ưu định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F và định lượng allopurinol 31

2.3.4 Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol và định lượng allopurinol bằng kỹ thuật LC/MS/MS 32

Trang 7

2.3.5 Định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol trong nguyên liệu và thành

phẩm của allopurinol 35

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ và sắc kí 37

3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu 37

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc kí tối ưu định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol và định lượng allopurinol 40

3.2 Thẩm định quy trình phân tích định lượng đồng thời 6 tạp A,B,C,D,E,F và định lượng allopurinol 41

3.2.1 Tính tương thích hệ thống 41

3.2.2 Tính đặc hiệu-chọn lọc 43

3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 45

3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 46

3.2.5 Độ đúng 49

3.2.6 Độ chính xác và độ chính xác trung gian 52

3.3 Ứng dụng qui trình đã thẩm định để định lượng 6 tạp trong mẫu nguyên liệu và thành phẩm allopurinol trên thị trường 55

Chương 4 BÀN LUẬN 70

4.1 Xây dựng quy trình định lượng 70

4.1.1 Điều kiện khối phổ 70

4.1.2 Điều kiện sắc kí 73

4.2 Thẩm định quy trình định lượng 74

4.2.1 Tính tương thích hệ thống 74

4.2.2 Tính đặc hiệu 74

4.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 75

4.2.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 75

4.2.5 Độ đúng và độ chính xác 75

Trang 8

4.4 Ứng dụng qui trình phân tích đã thẩm định trên các mẫu nguyên liệu và

thành phẩm allopurinol trên thị trường 78

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO xv

PHỤ LỤC xviii

Trang 9

PHẦN 1 TÓM TẮT ĐỀ TÀI

I PHẦN MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp dược trên thế giới, ngành dược Việt Nam ngày càng phát triển với hơn 220 nhà máy sản xuất đạt GMP-WHO, GMP-EU, sản xuất các thành phẩm, đa phần là thuốc generic, trong đó phổ biến nhất là nhóm thuốc kháng viêm, thuốc điều trị bệnh gout, kháng sinh, đái tháo đường, tim mạch Trong các nhóm thuốc điều trị bệnh gout mãn tính hay tăng acid uric huyết, allopurinol đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu lần VII năm 2018, và được chỉ định thường quy trong điều trị bệnh gout

và tăng uric huyết thứ phát do hóa trị bệnh bạch cầu hay ung thư

Hiện nay, ngành công nghiệp dược vẫn còn phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu allopurinol được nhập khẩu từ các công ty nước ngoài Do đó, việc kiểm tra chất lượng tạp trong nguyên liệu cũng như thành phẩm trước và trong quá trình lưu hành là một yêu cầu bắt buộc được quy định trong DĐVN V; BP 2021; USP

44 Trong đó tạp chất A, B, C, D, E được chứng minh tác dụng lên gen B*5801 gây hội chứng steven Jonhson[8], tạp Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat (tạp F theo USP standard 2022) thuộc nhóm 3 cấu trúc có khả năng gây ung thư, đột biến gen Tạp A và B là tạp phân hủy của allopurinol cần được kiểm cả trong nguyên liệu và thành phẩm Trong khi

HLA-đó các quy trình Dược Điển hiện hành chỉ định lượng từng tạp hoặc một nhóm các tạp bằng đầu dò UV-VIS hoặc dãy iod quang, hệ số phân giải giữa các tạp thấp, đặc biệt tạp B và C Chưa có quy trình tối ưu để định lượng đồng thời 6 tạp trên trong thành phẩm allopurinol Hiệp hội hòa hợp quốc tế (ICH) năm 2022 bước đầu hướng dẫn định lượng tạp chất liên quan bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò khối phổ như là một bước tiến trong lĩnh vực phân tích các chất có hàm lượng

Trang 10

1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, tạp F của allopurinol bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần tứ cực (LC-MS/MS)

2 Ứng dụng quy trình định lượng tạp chất liên quan trong một số nguyên liệu

và thành phẩm allopurinol trên thị trường

II TÓM TẮT VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

Năm 2001, Xiuhua Sun và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật điện di mao quản để định lượng allopurinol và các chất chuyển hóa bằng đầu dò điện cực (amperometric) với giới hạn phát hiện 10-8 mol/lít [15]

Năm 2014, Sajan PG và cộng sự đã xây dựng qui trình định lượng allopurinol

và 5 tạp A, B, C, D, E bằng kỹ thuật UPLC đầu dò UV Thời gian phân tích đã được rút ngắn còn khoảng 12 phút với giới hạn phát hiện đạt 0,002% đến 0,006% Tuy nhiên qui trình này chưa định lượng tạp Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat có khả năng gây đột biến gen [11]

Hiện chưa có quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A,B,C,D,E,F của allopurinol trong nguyên liệu và thành phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC/MS/MS)

Trang 11

III ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Quy trình định lượng đồng thời 6 tạp chất liên quan A,B,C,D,E, F của allopurinol được ghi rõ trong chuyên luận nguyên liệu và thành phẩm tương ứng trong Dược điển Việt Nam V và một số Dược điển khác như BP 2021 và USP 44 Tạp A: 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxamid; 3-Aminopyrazol-4-carboxamid Tạp B: 5-(Formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxamid

Tạp C: 5-(4H-1,2,4-Triazol-4-yl)-1H-pyrazol-4-carboxamid

Tạp D: Ethyl 5-amino-1H-pyrazol-4-carboxylat

Tạp E: Ethyl 5-(formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxylat

Tạp F: Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat

Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol và định lượng allopurinol bằng kỹ thuật LC/MS/MS

Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F

và định lượng allopurinol với chế độ Auto-tune để khảo sát các thông số khối phổ nhằm ghi nhận được tín hiệu và độ ổn định tốt nhất của các ion mảnh mẹ và các ion mảnh con của 6 tạp A,B,C,D,E,F của allopurinol để được điều kiện khối phổ tối ưu (1) Tiêm dung dịch chuẩn allopurinol với chế độ Auto-tune để khảo sát các thông số khối phổ nhằm ghi nhận được tín hiệu và độ ổn định tốt nhất của các ion mảnh mẹ và các ion mảnh con của allopurinol để được điều kiện khối phổ tối ưu (2)

Khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F và định lượng allopurinol với điều kiện khối phổ tối ưu (1) và điều kiện khối phổ tối

Trang 12

hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng

Ứng dụng qui trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol trong nguyên liệu và thành phẩm của allopurinol

IV KẾT QUẢ-KẾT LUẬN NGHIÊN CỨU

Đề tài đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C,

D, E, F của allopurinol bằng hệ thống sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần tứ cực (LC-MS/MS)

Điều kiện khối phổ MS1 và MS2

Tốc

độ khí hoá hơi (l/h)

Thế Cone (V)

Thế mao quản (kV)

Năng lượng buồng khí va chạm (V)

Ghi chú

Điều kiện khối phổ tối ưu (1)

53,9 400 900 15 4 18 đt

109,9 400 900 10 4 20 đt

Trang 14

Kết quả phân tích mẫu ứng dụng

Trong tổng số 3 mẫu nguyên liệu và 10 mẫu thành phẩm trong đó 2 mẫu thành phẩm allopurinol ngoại nhập và 8 mẫu thành phẩm allopurinol sản xuất trong nước, cho thấy có 2 mẫu ngoại nhập có hàm lượng tạp A vượt trên giới hạn cho phép chiếm tỷ lệ 20% trong các mẫu lấy trên thị trường tại địa bàn Thành phố Cần Thơ Tuy lượng mẫu phân tích chưa đủ lớn để kết luận thực trạng xuất hiện tạp quá qui định nhưng từ một số kết quả phân tích vẫn mang lại những đánh giá đáng quan tâm Việc xuất hiện tạp A có thể trong quá trình vận chuyển, bảo quản thì cơ

sở chưa đảm bảo đúng điều kiện qui định của sản phẩm dẫn đến xuất hiện tạp phân huỷ, đặc biệt tạp A là tạp dễ hình thành trong quá trình bảo quản allopurinol Việc chỉ phát hiện mẫu chỉ chứa nồng độ một tạp ngoài giới hạn cho phép có thể nguyên nhân do số lượng mẫu phân tích còn thấp, chưa khái quát được tình hình thực tế trên thị trường Hơn nữa các mẫu được lấy đều từ các thương hiệu có

uy tín chất lượng nên có thể ít xảy ra trường hợp vi phạm Vì vậy, để nâng cao khả năng ứng dụng của phương pháp phân tích và đánh giá đúng hơn tình hình thực tế cần phải mở rộng phạm vi lấy mẫu và số lượng mẫu phân tích

Trang 15

PHẦN 2 TOÀN VĂN CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

BP British Pharmacopoeia Dược điển Anh

DĐVN Dược điển Việt Nam

DMSO Dimethyl sulfoxid

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

MS Mass spectrometry Khối phổ

RSD% Relative standard deviation% Độ lệch chuẩn tương đối

TB Trung bình

tR Retention time Thời gian lưu

UPLC Ultra performance liquid

chromatography

Sắc kí lỏng siêu hiệu năng

USP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ

UV - Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại – khả kiến

Trang 16

Hình 1.4 Công thức cấu tạo tạp B 6

Hình 1.5 Sơ đồ hình thành tạp B 7

Hình 1.6 Công thức cấu tạo tạp C 7

Hình 1.7 Sơ đồ hình thành tạp C 8

Hình 1.8 Công thức cấu tạo tạp D 8

Hình 1.9 Sơ đồ hình thành tạp D 9

Hình 1.10 Công thức cấu tạo tạp E 9

Hình 1.11 Sơ đồ hình thành tạp E 10

Hình 1.11 Công thức cấu tạo tạp F 10

Hình 1.12 Sơ đồ hình thành tạp F 11

Hình 1.13 Sơ đồ khối của đầu dò khối phổ ba lần tứ cực 23

Hình 1.14 Minh hoạ chọn lọc khối phổ 2 lần MS/MS ở chế độ MRM 24

Hình 3.1 Phân mảnh con định lượng của 6 tạp A,B,C,D,E,F và allopurinol 39

Hình 3.2 Sắc kí đồ của hỗn hợp 6 tạp chuẩn và chuẩn allopurinol ở điều kiện khối phổ (1), điều kiện khối phổ (2) và sắc kí tối ưu 41

Hình 3.3 Sắc kí đồ dung môi pha mẫu, tá dược, mẫu phân hủy, tạp A,B,C,D,E,F và allopurinol trong mẫu chuẩn 45

Hình 3.4 Sắc kí đồ mẫu NL1 57

Hình 3.7 Sắc kí đồ mẫu TPTN1 60

Trang 17

Hình 3.16 Sắc kí đồ mẫu TPNK1 68

Hình 3.17 Sắc kí đồ mẫu TPNK2 69

Hình 4.1 Sắc kí đồ mẫu hỗn hợp 6 tạp theo điều kiện phân tích USP 44, chỉ xuất hiện tạp A,B,D,E 77

Trang 18

theo USP 44 16

Bảng 1.3 Thời gian lưu của allopurinol và các tạp có liên quan 17

Bảng 1.4 Các tiêu chí thẩm định qui trình phân tích tạp trong nguyên liệu và thành phẩm theo hướng dẫn Q2(R2) của ICH 25

Bảng 2.1 Chất chuẩn dùng cho nghiên cứu 27

Bảng 2.2 Các thông số khối phổ cần khảo sát 31

Bảng 2.3 Điều kiện sắc kí cần khảo sát 32

Bảng 2.4 Nồng độ các tạp và allopurinol trong tuyến tính 33

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát điều kiện MS tối ưu 37

Bảng 3.2 Các điều kiện sắc kí tối ưu 40

Bảng 3.3 Kết quả tính tương thích hệ thống dung dịch chuẩn (1) và dung dịch chuẩn (2) 42

Bảng 3.4 Kết quả tính tương thích hệ thống định lượng đồng thời 6 tạp allpurinol trong mẫu giả lập nguyên liệu và giả lập thành phẩm 42

Bảng 3.5 Khoảng tuyến tính, phương trình hồi quy và hệ số tương quan 46

Bảng 3.6 Giá trị LOD, LOQ của 6 tạp và allopurinol 47

Bảng 3.7 Độ chính xác và độ chính xác trung gian tại nồng độ LOQ các tạp và allopurinol 48

Bảng 3.8 Độ đúng tại LOQ 6 tạp và allopurinol 48

Bảng 3.9 Kết quả độ đúng của 6 tạp trong nền mẫu giả lập thành phẩm và giả lập nguyên liệu 50

Trang 19

Bảng 3.10 Kết quả độ chính xác và độ chính xác trung gian 6 tạp và allopuirnol trong mẫu giả lập thành phẩm 53 Bảng 3.11 Kết quả độ chính xác và độ chính xác trung gian của 6 tạp trong mẫu giả lập nguyên liệu 54 Bảng 3.12 Kết quả định lượng tạp trong các mẫu nguyên liệu và thành phẩm 55 Bảng 3.13 Kết quả định lượng allopurinol trong các mẫu nguyên liệu, thành phẩm và tỉ lệ tạp A trong các mẫu 56 Bảng 4.1 So sánh các quy trình định lượng các tạp allopurinol trong nguyên liệu 75 Bảng 4.2 So sánh các quy trình định lượng các tạp allopurinol trong thành phẩm 77

Trang 20

trong đó phổ biến nhất là nhóm thuốc kháng viêm, thuốc điều trị bệnh gout, kháng sinh, đái tháo đường, tim mạch

Trong các nhóm thuốc điều trị bệnh gout mãn tính hay tăng acid uric huyết, allopurinol đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu lần VII năm 2018 [2], và được chỉ định thường quy trong điều trị bệnh gout và tăng uric huyết thứ phát do hóa trị bệnh bạch cầu hay ung thư Do đó allopurinol là một trong các thuốc được sản xuất bởi nhiều công ty dược phẩm trong nước như Domesco, Stella, Pharmedic, Dược Hậu Giang

Trong quá trình tổng hợp, sản xuất, bảo quản, allopurinol vẫn còn tồn tại hoặc phát sinh các tạp chất liên quan có khả năng gây độc tính hoặc đột biến gen, ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả điều trị lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc đối với bệnh nhân Các nghiên cứu đã cho thấy tạp A và tạp D của allopurinol là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp Tạp A và tạp B cũng là sản phẩm phân hủy của allopurinol khi gặp tác nhân kiềm hóa [14] Tạp C, D, E, F là các sản phẩm phụ được tạo thành từ sản phẩm trung gian với các chất tham gia phản ứng độc hại với môi trường thủy sinh, có thể gây tác động bất lợi dài hạn trong môi trường nước, do đó có khả năng ảnh hưởng đến phụ nữ có thai [7] Các tạp A, B,

C, D, E đã được chứng minh có khả năng gây độc tính trên da và gây hội chứng Steven Johnson do tác dụng lên gen HLA-B*5801 [12] Trong khi đó tạp Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat (tạp F theo USP

Trang 21

standard 2022) nằm trong nhóm 3, là nhóm có cấu trúc có khả năng gây đột biến

gen và ung thư

Trong nhiều chuyên luận của hầu hết dược điển như USP 44; BP2021; DĐVN

V kiểm tra tạp chất liên quan allopurinol là một tiêu chuẩn bắt buộc trong kiểm nghiệm nguyên liệu allopurinol BP 2021 còn bắt buộc yêu cầu kiểm tra tạp chất

A, B, C, D, E trong thành phẩm allopurinol Trong khi đó quy trình dược điển Việt Nam V và dược điển trên thế giới định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu

dò UV-VIS hoặc dãy iod quang bị hạn chế bởi độ đặc hiệu, các pic phải tách rời nhau Quy trình USP 44 cho thấy thời gian lưu tạp B và C allopurinol lần lược 6,9 phút và 7,1 phút dẫn đến hệ số phân giải thấp có thể gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích Ngoài ra các quy trình Dược Điển Việt Nam V và BP 2021 chỉ định lượng từng tạp hoặc một nhóm các tạp, làm tăng chi phí, thời gian, nguyên liệu để định lượng hết các tạp theo quy định, cũng như chưa có quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trên trong thành phẩm allopurinol

Hiện các phương pháp phân tích hiện đại như sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ ngày càng phổ biến và hiệu quả đã được cập nhật trong hướng dẫn Q2(R2) của ICH năm 2022 đặc biệt trong lĩnh vực phân tích tạp chất liên quan với hàm lượng thấp Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A,B,C,D,E,F của allopurinol bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao” được lựa chọn để thực hiện Với mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, tạp F của allopurinol bằng hệ thống sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần tứ cực (LC-MS/MS)

2 Ứng dụng quy trình định lượng tạp chất liên quan trong một số nguyên liệu và thành phẩm allopurinol trên thị trường

Trang 22

Công thức phân tử: C5H4N4O

Khối lượng mol: 136,11 g/mol [1]

Công thức cấu tạo allopurinol:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo allopurinol

Allopurinol được tổng hợp lần đầu bởi Roland K và Robins năm 1955, từ phản ứng malononitril với triethyl orthoformat

1.1.2 Tính chất hoá học

Allopurinol có pKa = 10,2; có thể bị phân hủy một phần trong môi trường acid

và kém bền trong môi trường kiềm tạo 3-aminopyrazol-4-carboxamid Ở môi

Trang 23

trường kiềm sản phẩm tiếp tục bị phân hủy thành acid carboxylic và 3-aminopyrazol [6]

Thuốc ức chế xanthin oxydase, bắt đầu làm giảm sản xuất acid uric trong 2-3 ngày, acid uric máu trở lại bình thường trong vòng 1 - 3tuần [1]

Chỉ định: Dự phòng gout và tăng acid uric máu [1]

Chống chỉ định: Gout cấp; nếu có đợt cấp xảy ra trong khi đang dùng allopurinol,

vẫn tiếp tục dự phòng và điều trị đợt cấp riêng lẻ [1]

Liều lượng và cách dùng:

Cách dùng: Thuốc uống trong bữa ăn với sữa hoặc một thuốc kháng acid để làm

giảm bớt kích ứng dạ dày nhưng phải uống cách xa nhau để không ảnh hưởng đến hấp thu của allopurinol Người lớn uống ít nhất 2 lít nước mỗi ngày Tránh uống nhiều rượu (có thể làm tăng acid uric máu) hoặc vitamin C (có thể làm tăng khả năng bị sỏi thận do acid hóa nước tiểu) [1]

Liều dùng: Dự phòng gout: uống, người lớn, 100 mg uống 1 lần mỗi ngày, sau

đó điều chỉnh liều tùy theo nồng độ acid uric máu hay nước tiểu; liều duy trì thông thường đối với bệnh nhẹ, 100 - 200 mg hàng ngày; bệnh vừa 300 - 600 mg hàng ngày; bệnh nặng 700 - 900 mg hàng ngày; liều trên 300 mg phải chia làm nhiều liều [1]

Trang 24

Công thức phân tử: C4H8N4O5S [1]

Khối lượng mol: 175,15 g/mol

Công thức cấu tạo tạp A:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo tạp A 1.2.1.1 Tính chất vật lý

Tinh thể màu vàng nhạt hoặc trắng ngà, không mùi

Trang 25

Khối lượng mol: 154,13 g/mol [13]

Công thức cấu tạo tạp B:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo tạp B 1.2.2.1 Tính chất vật lý

Chất rắn, màu trắng hoặc trắng ngà, không mùi

1.2.2.2 Nguồn gốc phát sinh

Tạp B được hình thành trong quá trình phân hủy allopurinol dưới tác động môi trường kiềm tạo 3-aminopyrazol-4-carboxamid, sản phẩm tạo thành tiếp tục tác dụng với format hình thành tạp B Sukhdev Singh (2013) đã phân lập tạp B bằng sắc kí cột nhanh khi kiềm hóa allopurinol bằng NaOH 1N, cho thấy lượng tạp B

hình thành khoảng 4% [34],[35],[42]

Trang 26

Hình 1.5 Sơ đồ hình thành tạp B 1.2.3 Tạp chất C

Tên hóa học: 5-(4H-1,2,4-triazol-4-yl)-1H-pyrazol-4-carboxamid [1]

Công thức phân tử: C6H6N6O

Công thức cấu tạo tạp C:

Hình 1.6 Công thức cấu tạo tạp C 1.2.3.1 Tính chất vật lý

Chất rắn, kết tinh, màu trắng hoặc trắng ngà, không mùi

Tạp C được tạo thành do khả năng tạo vòng 1,2,4 triazol của các tác nhân tham gia phản ứng hydrazin, formamid tồn dư với sản phẩm trung gian 3-amino-4 pyrazolcarboxamid (tạp A) [18]

Allopurinol Tạp A Tạp B

Trang 27

Công thức cấu tạo tạp D:

Hình 1.8 Công thức cấu tạo tạp D 1.2.4.1 Tính chất vật lý

Chất rắn, kết tinh, màu trắng, trắng ngà hoặc vàng nhạt, không mùi

Nhiệt độ nóng chảy: 101 – 104 oC

Tạp D là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp allopurinol theo qui trình

của Jean Druey và cộng sự (1959) [23]

Trang 28

Hình 1.9 Sơ đồ hình thành tạp D 1.2.5 Tạp chất E

Tên hóa học: ethyl 5-(formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxylat [1]

Công thức phân tử: C7H9N3O3

Công thức cấu tạo tạp E:

Hình 1.10 Công thức cấu tạo tạp E 1.2.5.1 Tính chất vật lý

Chất rắn, màu trắng, không mùi [44]

Nhiệt độ nóng chảy: 196 – 200 oC

Tạp E được hình hành từ sản phẩm trung gian là tạp D trong quá trình tổng

hợp allopurinol theo qui trình của Jean Druey Tạp D sau khi hình thành sẽ phản

ứng tiếp với triethyl orthoformat dư để tạo thành tạp E [23]

Trang 29

Tạp D Tạp E

Hình 1.11 Sơ đồ hình thành tạp E 1.2.6 Tạp chất Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4- carboxylat

Tên hóa học: 4-carboxylat

ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-Công thức phân tử: C12H14N4O4

Công thức cấu tạo:

Hình 1.11 Công thức cấu tạo tạp F 1.2.6.1 Tính chất vật lý

Chất rắn, màu trắng

Tạp F được hình hành từ sản phẩm trung gian là tạp D trong quá trình tổng hợp allopurinol theo qui trình của Jean Druey Tạp D sau khi hình thành sẽ phản ứng tiếp với lượng dư của triethyl orthoformat và ethyl cyanoaceton tạo thành tạp F

Trang 30

Tạp D Ethyl 2-cyanoacetyl Tryethylothorformat Tạp F

Hình 1.12 Sơ đồ hình thành tạp F 1.2.7 Tính chất dược lý và độc tính các tạp allopurinol

Makoto Osabe và cộng sự (2016) bằng mô hình docking đã chứng minh khả năng gắn kết của 6 tạp chất liên quan của allopurinol có ký hiệu lần lượt là A, B,

C, D, E, F với gen HLA-B*5801 gây ra hội chứng Steven-Johnson và hoại tử tế bào biểu bì tương tự như tác dụng phụ của allopurinol [2],[28] … Kết quả nghiên cứu cho thấy các tạp liên quan allopurinol (ngoại trừ tạp A) có khả năng gắn kết cao hơn hẳn hoạt chất chính, trong đó đặc biệt đáng lưu ý là tạp F với hai dạng đồng phân quang học (Z) và (E) có khả năng gắn kết vượt trội Theo USP 44, hàm lượng các tạp không vượt quá 0,2%, tuy nhiên đối với tạp Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat do có phản ứng Michel ở nhóm hút điện tử nên được xếp vào nhóm 3 các chất có khả năng gây đột biến gen, cần có sự kiểm soát nghiêm ngặt

Theo cơ sở dữ liệu về độ an toàn các hóa chất của EU, các tạp chất liên quan bao gồm A, B, C, D, E của allopurinol đều có khả năng gây kích ứng da, mắt, đường hô hấp và nguy hiểm khi nuốt phải Đặc biệt chúng rất độc hại với môi trường thủy sinh, có thể gây tác động bất lợi dài hạn trong môi trường nước, do đó

có khả năng ảnh hưởng đến phụ nữ có thai

Trang 31

1.2.8 Giới hạn cho phép của các tạp chất allopurinol theo Dược điển các nước

Dược điển Việt Nam V, Dược điển Anh 2021và Dược điển Mỹ (USP 44)quy định giới hạn hàm lượng các tạp của allopurinol theo bảng sau:

Bảng 1.1 Giới hạn tạp chất liên quan allopurinol theo DĐVN V; BP 2021 và

USP 44

Dược

Tổng tạp khác

Giới hạn (%) tạp trong nguyên liệu không được vượt quá DĐVN V 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 - 2,5 ppm 0,3

BP 2021 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 - 2,5 ppm 0,3 USP 44 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 10 ppm 1

Giới hạn (%) tạp trong viên nén không được vượt quá DĐVN V - - - -

BP 2021 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1 - - 0,1 USP 44 - - - -

1.3 Kiểm nghiệm tạp chất allopurinol trong nguyên liệu và chế phẩm allopurinol theo Dược điển các nước

1.3.1 Kiểm nghiệm allopurinol trong nguyên liệu theo DĐVN V

1.3.1.1 Xác định giới hạn tạp A, B, C trong nguyên liệu allopurinol

Tiến hành bằng phương pháp sắc kí lỏng Các dung dịch pha trước khi sử dụng Bảo quản tiêm mẫu ở 8oC, sử dụng thiết bị tiêm mẫu tự động

Pha động: Dung dịch kali dihydrophosphat 0,125%

Trang 32

Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 2,0 mL dung dịch thử (1) thành 100,0 mL bằng pha động Pha loãng 5,0 mL dung dịch thu được thành 100,0 mL bằng pha động

Dung dịch đối chiếu (2): Hoà tan 5,0 mg tạp chất A chuẩn của allopurinol; 5,0

mg tạp chất B chuẩn của allopurinol và 5,0 mg tạp chất C chuẩn của allopurinol trong 5,0 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng ngay thành 100,0

mL bằng pha động Pha loãng 1,0 mL dung dịch thu được thành 100,0 mL bằng pha động

Dung dịch đối chiếu (3): Hoà tan 20,0 mg allopurinol chuẩn trong 5,0 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng ngay thành 250,0 mL bằng pha động Điều kiện sắc kí:

Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm)

Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 230 nm

Tốc độ dòng: 1,4 mL/min

Thể tích tiêm: 20 µL

Cách tiến hành: tiến hành sắc kí với thời gian gấp 2 lần thời gian lưu của allopurinol Các chất sẽ rửa giải theo thứ tự: tạp A, tạp B, tạp C và allopurinol Thời gian lưu của allopurinol khoảng 10 phút

Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (2),

độ phân giải giữa pic của tạp chất B với pic của tạp chất C ít nhất là 1,1

Giới hạn:

Trang 33

Tạp chất A: Diện tích pic tạp A không được lớn hơn 2 lần diện tích pic chính thu được trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,2%)

Tạp chất B: Diện tích pic tạp B không được lớn hơn diện tích pic chính thu được trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,1%)

Tạp chất C: Diện tích pic tạp B không được lớn hơn diện tích pic tương ứng thu được trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,1%)

Các tạp chất khác: Diện tích pic của mỗi tạp không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,1%)

Tổng diện tích pic của tất cả các tạp (trừ pic của các tạp A, B, C) không được lớn hơn 3 lần diện tích pic chính trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,3%)

Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,5 lần diện tích pic chính trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,05%)

1.3.1.2 Xác định giới hạn tạp D và E trong nguyên liệu allopurinol

Tiến hành bằng phương pháp sắc kí lỏng Các dung dịch pha trước khi dùng Pha động: Methanol – dung dịch A (10:90)

Dung dịch A: Dung dịch kali dihydrophosphat 0,125%

Dung dịch thử: Hoà tan 50,0 mg chế phẩm trong 5,0 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng ngay thành 100,0 mL bằng dung dịch A Dung dịch đối chiếu: Hoà tan 5,0 mg tạp chuẩn D và 5,0 mg tạp chuẩn E của allopurinol trong 5,0 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng ngay thành 100,0 mL bằng dung dịch A Pha loãng 1,0 mL dung dịch thu được thành 100,0 mL bằng dung dịch A

Điều kiện sắc kí:

Trang 34

Thể tích tiêm: 20 µL

Cách tiến hành:

Tiến hành sắc kí với thời gian lưu gấp 1,5 lần thời gian lưu của tạp chất E Thời gian lưu của tạp chất D khoảng 3,6 phút; tạp chất E khoảng 4,5 phút Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu, độ phân giải giữa pic của tạp chất D với pic của tạp chất E ít nhất là 2,0

Dung môi pha mẫu: hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B (90:10)

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 5 mg mỗi allopurinol chuẩn, tạp A chuẩn, tạp B chuẩn, tạp C chuẩn, tạp D chuẩn, tạp E chuẩn vào bình định mức 100 mL Thêm 2 mL NaOH 0,1 M, siêu âm ngay trong 1 phút để hoà tan, thêm 80 mL dung môi pha mẫu, siêu âm thêm 5 phút, pha loãng bằng dung môi pha mẫu đến thể tích quy định

Trang 35

Dung dịch chuẩn: Pha loãng một lượng dung dịch chuẩn gốc với dung môi pha mẫu để được dung dịch có nồng độ 0,5 µg/mL allopurinol, tạp A, B, C, D, E Dung dịch thử: cân chính xác 25 mg allopurinol vào bình định mức 100mL, thêm 5 mL NaOH 0,1M để hoà tan, siêu âm ngay trong 1 phút để hoà tan, thêm

80 mL dung môi pha mẫu, siêu âm thêm 5 phút, pha loãng bằng dung môi pha mẫu đến thể tích quy định

Pha động: hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B, được sử dụng theo chương

trình dung môi theo bảng 1.2:

Bảng 1.2 Chương trình rửa giải tạp A, B, C, D, E trong nguyên liệu allopurinol

theo USP 44 [17]

Thời gian

(phút)

Dung dịch A (%)

Dung dịch B (%)

Chế độ rửa giải

0-30 90-70 10-30 Gradient tuyến tính

35-36 70-90 30-10 Gradient tuyến tính 36-46 90 10 Cân bằng đường nền

Kiểm tra tính tương thích hệ thống: độ phân giải giữa allopurinol và tạp B, C không nhỏ hơn 0,8; hệ số kéo đuôi của pic allopurinol không lớn hơn 1,5

Trang 36

CS là nồng độ (mg/mL) của mỗi tạp trong dụng dịch chuẩn

CU là nồng độ (mg/mL) của allopurinol trong dung dịch thử

Ru, rs lần lượt là diện tích pic của mỗi tạp trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Trang 37

1.3.3 Kiểm nghiệm allopurinol trong nguyên liệu theo Dược điển Anh (BP 2021)

1.3.3.1 Xác định giới hạn tạp A, B, C trong nguyên liệu allopurinol

Tiến hành bằng phương pháp sắc kí lỏng [8]

Pha động: 1,25 g/l dung dịch kali dihydrophosphat

Dung môi pha mẫu: 4 g/l dung dịch NaOH

Dung dịch thử (a): Hoà tan 25,0 mg chế phẩm với 2 mL dung môi pha mẫu rồi pha thành 50,0 mL bằng pha động

Dung dịch thử (b): Hoà tan 20 mg chế phẩm với 5 mL dung môi pha mẫu rồi pha thành 50 mL bằng pha động

Dung dịch đối chiếu (a): Pha loãng 2 mL của dung dịch thử (a) thành 100 mL bằng pha động Tiếp tục pha loãng 5 mL dung dịch vừa thu được thành 100 mL bằng pha động

Dung dịch đối chiếu (b): Hoà tan 5 mg allopurinol, 5 mg mỗi tạp A, B, C trong

5 mL dung môi pha mẫu rồi pha thành 100 mL bằng pha động Pha loãng 1 mL dung dịch vừa thu được thành 100 mL bằng pha động

Dung dịch đối chiếu (c): Hoà tan 20 mg allopurinol trong 5 mL dung môi pha mẫu rồi pha thành 250 mL bằng pha động

Trang 38

Kiểm tra tính tương thích hệ thống: Trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (b), độ phân giải giữa pic của tạp B và pic của tạp C ít nhất là 1,1

Giới hạn các tạp:

Tạp A: không được lớn hơn 2 lần diện tích của pic chính có trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (a) (0,2%)

Tạp B: không được lớn hơn diện tích của pic chính có trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (a) (0,1%)

Tạp C: không được lớn hơn diện tích của pic chính có trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (a) (0,1%)

Tạp không xác định khác: với mỗi tạp, không được lớn hơn diện tích pic chính có trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (a) (0,1%)

Tổng tạp khác trừ các tạp A, B, C: không được lớn 3 lần diện tích của pic chính có trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (a) (0,3%)

Không tính các tạp nhỏ hơn 0,5 lần diện tích của pic chính có trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (a) (0,05%)

1.3.3.2 Xác định giới hạn tạp D, E trong nguyên liệu allopurinol

Tiến hành bằng phương pháp sắc kí lỏng [8]

Dung môi pha mẫu: 4

Dung dịch A: 1,25 g/l dung dịch kali dihydrophosphat

Dung dịch thử: Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong 5,0 mL dung dịch NaOH

4 g/l và ngay lập tức pha loãng thành 100,0 mL bằng dung dịch A

Trang 39

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 5,0 mg tạp D chuẩn; 5,0 mg tạp E chuẩn trong 5,0

mL dung dịch NaOH 4 g/l Ngay lập tức pha loãng thành 100,0 mL với dung dịch

A Pha loãng 1,0 mL dung dịch này thành 100 mL bằng dung môi pha mẫu Điều kiện sắc kí

Pha động: Methanol – dung dịch kali dihydrophosphat 1,25 g/l (10:90) Cột pha đảo C18 (0,05 m x 4,6 mm; 3 µm)

Năm 2014, Sajan PG và cộng sự đã xây dựng qui trình định lượng allopurinol

và 5 tạp A, B, C, D, E bằng kỹ thuật UPLC đầu dò UV Thời gian phân tích đã được rút ngắn còn khoảng 12 phút với giới hạn phát hiện đạt 0,002% đến 0,006% Tuy nhiên qui trình này chưa định lượng tạp Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat có khả năng gây đột biến gen [11]

Trang 40

nguyên liệu pantoprazol bằng phương pháp LC-MS/MS Độ nhạy của phương pháp đề xuất nằm trong khoảng 0,6–10,0 ng/mL Độ phục hồi tốt trong khoảng 94,32% –107,43% với giá trị RSD dưới 6,5% Phân tích định lượng tạp chất cho thấy hiệu quả cao của phương pháp đã phát triển ở mức nồng độ tạp rất thấp Do

đó, phương pháp được đề xuất là thực tế và có thể ứng dụng [9]

Nhận xét: Do các quy trình kiểm tra tạp chất liên quan của allopurinol từ Dược Điển Việt Nam V và dược điển các nước có một số hạn chế nhất định, việc ứng dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại như LC-MS/MS để định lượng allopurinol và các tạp chất liên quan là xu hướng của ngành kiểm nghiệm nhằm rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ nhạy, có thể định lượng đồng thời nhiều thành phần có hàm lượng khác nhau

1.5 Sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần

Phương pháp sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC-MS/MS) được xem là một trong những công cụ phân tích mạnh nhất hiện nay cho độ nhạy (fg/mL), độ chính xác và tính đặc hiệu cao được ứng dụng trong phân tích mẫu dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm, độc chất học, sinh dược học và dược động học,…

1.5.1 Hệ thống sắc kí lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần

Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS Tại đây diễn ra quá trình ion hóa bằng các kiểu ion khác nhau Ion sinh ra được định hướng để đưa vào bộ phận phân tách khối bằng điện thế phù hợp đưa vào bộ phân tích khối

Tiêu đề	Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp a, b, c, d, e, f của allopurinol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tác giả	Nguyễn Duy Gia Bảo
Người hướng dẫn	ThS. Lữ Thiện Phúc
Trường học	Trường Đại học Y Dược Cần Thơ
Chuyên ngành	Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất
Thể loại	đề tài nghiên cứu khoa học
Năm xuất bản	2022
Thành phố	Cần Thơ

Định dạng
Số trang	104
Dung lượng	5,13 MB