TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH ĐỂ KIỂM NGHIỆM TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM MỐC

TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH ĐỂ KIỂM NGHIỆM TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM MỐC... 1.Tổng số vi khuẩn hiếu khíSử dụng kĩ thuật đổ đĩa, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạc

TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH ĐỂ KIỂM NGHIỆM TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM

MỐC

MỤC LỤC

I KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC

1 Vi khuẩn hiếu khí

2 Nấm men, nấm mốc

II PHƯƠNG PHÁP VÀ QUI TRÌNH

1 Phương pháp truyền thống

a Vi khuẩn hiếu khí

b Nấm men, nấm mốc

2 Phương pháp nhanh

a Kỉ thuật màng petri (petrifilm)

b Qui trình

III CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí

• Vi khuẩn hiếu khí là

những vi khuẩn tăng

trưởng và hình thành

khuẩn lạc trong điều

kiện có sự hiện diện

của oxy phân tử.

Định nghĩa :

I KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC

1.Tổng số vi khuẩn hiếu khí

Sử dụng kĩ thuật đổ đĩa, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 o C trong thời gian từ 72 giờ

Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu thực

phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khuẩn lạc đếm được trong các hộp nuôi cấy theo các nồng độ pha loãng

Nguyên tắc:

2.Tổng số nấm men nấm mốc

• Là nhóm vi sinh vật rất đa dạng

• Chúng thuộc nhóm Eucaryote, có vách tế bào là lớp vỏ chitin

• Là các vi sinh vật dị dưỡng

• Nhóm mesophiles, 1 số ít thuộc nhóm

psychrophiles hoặc thermophiles

Định nghĩa :

2.Tổng số nấm men nấm mốc

• Là nhóm vi sinh vật ưa mát (nhiệt độ thích hợp 20-28 0 C)

• Phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạt

tính, khoảng 85%

• PH thích hợp là 2-9 ( tối ưu 4-6.5)

• Là vi sinh vật thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc

có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí.

Đặc điểm :

2.Tổng số nấm men nấm mốc

• Nấm mốc : là vi nấm dạng sợi

sinh sàn bằng bào tử hoặc

khuẩn ty

• Nấm men: đơn tính, phát triển

theo kiểu nảy chồi, thỉnh

thoảng có thể tồn tại ở dạng

khuẩn ty giả trong đó có các tế

bào kết nhau thành chuỗi

Phân loại nấm men nấm mốc

2.Tổng số nấm men nấm mốc

• kỹ thuật pha loãng, trãi đĩa và đếm khuẩn lạc trên

môi trường DG18, DRBC

• Môi trường DG18 được sử dung cho các loại thực

phẩm có hàm lượng nước thấp

• Môi trường DRBC được sử dụng cho các mãu có hàm lượng nước cao

• Đối với mẫu các môi trường thường được sử dụng là MEA, PDA chứa 40ppm chloramphenicol hay

chlotetraciline.

Nguyên tắc:

II PHƯƠNG PHÁP VÀ QUY TRÌNH

1 Phương pháp truyền thống

a Vi khuẩn hiếu khí:

Phương pháp đổ đĩa:

 Quy trình xác định tổng vi khuẩn hiếu khí:

Chuẩn bị dịch đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha loãng

10-1 -10-6

Chọn 3 nồng độ pha loãng thích hợp Chuyển 1ml mẫu vào đĩa

petri vô trùng (cấy 3 đĩa)

Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường PCA đã làm nguội đến

450C, lắc đều và đem ủ ở 300C trong 72h

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc 25-250/đĩa để đếm

Tính kết quả: tổng VSV hiếu khí trong mẫu (CFU/g hay CFU/ml)

b Nấm men, nấm mốc

Quy trình phân tích định tính:

Đồng nhất mẫu trong môi trường SDB thành độ

pha loãng 10-1, ủ ở 300C, 1-7 ngày

Cấy canh trường có mốc mọc lên đĩa SDB, MEA hay PDA, ủ ở 300C trong 7 ngày

Kết luận: có/ không có nấm mốc

Quy trình phân tích định lượng:

Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc

DG18, ủ ngửa đĩa ở 250C trong 5-7 ngày

Trải 0,1ml mẫu lên đĩa MEA hoặc PDA,

ủ ngửa đĩa ở 300C, trong 7 ngày

Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính mật độ (CFU/g)

Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ ở 300C, 7 ngày

Định danh Đồng nhất và pha loãng mẫu thành các độ pha loãng

10-1, 10-2, 10-3…

 Cách tính kết quả:

Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ (25-250) Mật độ tổng VSV hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính như sau:

N A(CFU/g hay CFU/ml) =

n1 Vf1 +…+ni Vfi

Trong đó:A- số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.

N- tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa.

ni- số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i.

V- thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa.

fi – độ pha loãng tương ứng

2 Phương pháp nhanh

Kỹ thuật màng petri (petrifilm)

 Kỹ thuật

The Oxoid Dip Slide được phủ hai lớp môi trường nuôi cấy khác nhau trên hai mặt Cả hai mặt phải được tiếp xúc với bề mặt cần kiểm tra hoặc tiếp xúc trực tiếp với dung dịch lỏng.

Đối với kiểm tra dung dịch lỏng, Dip Slide phải được nhúng sâu vào lòng chất lỏng hoặc đổ chất lỏng lên kín hai mặt Slide, cho chất lỏng tiếp xúc bề mặt Slide vài giây trước khi bỏ Slide vào lại trong lọ.

Chú ý : không được giữ ấm cả Slide với cả dung dịch cần kiểm tra trong lọ -

việc kiểm tra sẽ không thực hiện được

Đối với việc kiểm tra bề mặt môi trường, mỗi bề mặt Slide nên tiếp xúc trực tiếp với bề mặt cần kiểm, phải dùng lực nhấn mạnh để hai bề mặt tiếp xúc nhau vài giây, sau đó bỏ Slide vào lại trong lọ.

Đem lọ chứa slide đi giữ ấm ở nhiệt độ phù hợp theo

bảng dưới đây:

Bảng 1: một số loại Oxoid Dip Slides

Kiểm tra Dip Slide

Cho kiểm tra tổng số

vi khuẩn hiếu khí

Slides chứa môi trường TTC Red Spot Medium màu vàng trong suốt Khuẩn lạc phát triển

là những đốm có màu đỏ Giữ ấm ở 35–37°C trong vòng 18-48 giờ

Cho việc đếm tổng số

vi khuẩn hiếu khí,

nấm men, nấm mốc

Slide chứa môi trường TTC (Red Spot) trên một cạnh và môi trường Malt Extract Agar trên cạnh kia cho việc cô lập nấm men và nấm mốc Giữ ấm 25–30°C trong 2-5 ngày Trên một cạnh mang môi trường Plate Count Agar, cho việc đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, cạnh kia mang môi trường OGYE Agar cho việc đếm tổng số nấm men và nấm mốc Giữ ấm 25–30°C trong 2-5 ngày

Cho việc đếm tổng số

vi khuẩn coliform

bacterial

Plate Count Agar (PCA) trên một cạnh và MacConkey Agar No.3 trên cạnh còn lại PCA sẽ phát hiện tổng số vi khuẩn hiếu khí và MacConkey Agar No 3 phát hiện faecal coliforms, inhibiting gram positive cocci

Môi trường có chứa chất ức chế diệt khuẩn

Giữ ấm ở 30–37°C trong 18-48 giờ

Cho việc đếm tổng số

vi khuẩn

Enterobact-eriaceae

Môi trường PCA trên một cạnh và Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA) trên cạnh khác PCA sẽ phát hiện tổng số vi khuẩn hiếu khí và VRBGA sẽ giúp nhìn thấy các khuẩn đỏ tím Enterobacteriaceae

có chứa chất ức chế diệt khuẩn Giữ ấm ở 30–37°C trong vòng 18-48 giờ

III CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

Bảng 2: QUY CHUẨN KĨ THUẬT QUỐC GIA VỀ GIỚI HẠN AN TOÀN CHO PHÉP ĐỐI VƠI Ô NHIỄM VSV

TRONG THỰC PHẨM (QCVN:2010/BYT)

Nhóm sản phẩm Kế hoạch lấy mẫu Mức giới hạn cho phép Phân loại chỉ tiêu

Tổng số vi khuẩn hiếu

khí (CFU/g hoặc ml)

Thịt xay và sản phẩm chế biến từ thịt sử dụng trực tiếp không

xử lí nhiệt

5 2 5.10 5 5.10 6 B

Thịt xay và sản phẩm chế biến từ thịt phải qua xử lí nhiệt trước khi sử dụng

5 2 5.10 5 5.10 6

B

Gia vị 5 0 10 4 10 5 B

Nước chấm có nguồn gốc động vật 5 0 104 105 B

Nước chấm có nguồn gốc thực vật 5 0 104 105 B

Đồ uống có cồn

Tối đa 1000 A Nấm men nấm mốc

Chú thích

• Chỉ tiêu loại A: Sản phẩm lưu thông trên thị trường bắt buộc phải thử nghiệm

• Chỉ tiêu loại B: Sản phẩm tại công đoạn cuối của quá trình sản xuất (áp dụng đối với sản phẩm sản xuất tại Việt Nam) hoặc tại cửa khẩu (áp dụng đối với sản phẩm nhập khẩu) không bắt buộc phải thử

nghiệm nhưng tổ chức, cá nhân sản xuất, nhập khẩu các sản phẩm này phải đáp ứng các quy định đối với chỉ tiêu loại B.

• c: số mẫu có kết quả nằm giữa m và M, tổng số mẫu có kết quả nằm giữa m và M vượt quá c là không đạt,

• m: giới hạn dưới, các kết quả không quá mức này là đạt,

• M: giới hạn trên, chỉ một mẫu vượt quá mức này là không đạt,

• cfu/g hoặc ml : số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 gam

mẫu hoặc 1 ml.

TÀI LIỆU THAM KHẢO :

1 Phương pháp phân tích vi sinh vật trong

nước, thực phẩm và mỹ phẩm (Trần Linh Thước – NXBGD Việt Nam)

2 QCVN 2010/BYT