BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ UYỂN THANH PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG (Rosa spp ) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp ) TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN V[.]
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
LÊ UYỂN THANH
PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp GÂY
BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG
(Rosa spp.) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp.) TẠI
TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN VI
KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÒNG TRỊ BỆNH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 62420201
NĂM 2022
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
LÊ UYỂNTHANH
MÃ SỐ NCS: P0915008
PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp.
GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG
(Rosa spp.) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp.) TẠI
TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÒNG TRỊ BỆNH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 62420201
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
TS NGUYỄN ĐỨC ĐỘ
TS TRẦN ĐÌNH GIỎI
Trang 3CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG
Luận án này với tựa đề là “Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm
lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh đồng tháp và tuyển
chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh”, do nghiên cứu sinh Lê Uyển Thanh thực hiện
theo sự hướng dẫn của TS Nguyễn Đức Độ và TS Trần Đình Giỏi Luận án đã báo cáo
và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày: / / Luận án đã được
chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại
TS Trương Thị Bích Vân TS Nguyễn Đức Độ TS Trần Đình Giỏi PGS.TS Nguyễn Văn Thành
Trang 4LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệsinh học, Khoa Sau Đại học, khoa Nông nghiệp, phòng Đào tạo, phòng Quản lý Khoahọc và các phòng ban chức năng khác của trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu tại trường
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
TS Nguyễn Đức Độ và TS Trần Đình Giỏi đã tận tình hướng dẫn, luôn đồng hành, hỗtrợ và động viên tôi hoàn thành luận án này
Cảm ơn Quý Thầy, Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Họctrường Đại học Cần Thơ, Bộ môn Bảo vệ Thực vật - Khoa Nông nghiệp trường Đại họcCần Thơ đã truyền dạy kiến thức, động viên, khuyến khích cho tôi trong thời gian họctập nghiên cứu tại trường
Chân thành cảm ơn các anh, chị là học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành Công nghệsinh học đã đồng hành, trao đổi, động viên cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiêncứu và hoàn thành luận án này
Đặc biệt cảm ơn bạn Tô Lan Phương, em Trần Thanh Tùng, Thị Dim, Nguyễn HồngQuí, Ngô Thị Hồng Hương đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện luận án này.Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới các chủ đất canh tác tại huyện Châu Thành và Thànhphố Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp đã hỗ trợ khu thí nghiệm ngoài đồng ruộng
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành trường Đại học Đồng Tháp, các đồng nghiệp,
đã cho phép, hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các hoạt động giảngdạy, học tập và nghiên cứu của mình
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình quan tâm, động viên và hỗ trợ tôi hoàn thành nhiệm
vụ trong công tác, học tập và thực hiện luận án
Lê Uyển Thanh
Trang 5Với mục đích tìm ra tác nhân sinh học có tiềm năng trong phòng trị bệnh đốm lá
vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt, nghiên cứu này đã được thực hiện nhằm hai mục
tiêu: (i) Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm
lá trên cây hoa hồng giống hồng lửa (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.); (ii) Tuyển
chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn do
Xanthomonas spp gây ra Luận án đã phân lập được các dòng vi khuẩn gây bệnh, đánh
giá khả năng gây hại, xác định được các đặc điểm qua phân tích sinh hóa, kỹ thuật phântích MALDI-TOF-MS và phân tích sinh học phân tử Kết quả đã ghi nhận dòng
Xanthomonas euvesicatoria là tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng qua phân tích MALDI-TOF-MS và MLSA; Trong khi đó, xác định Xanthomonas spp gây bệnh
đốm lá trên cây ớt dựa trên đặc điểm sinh hóa Trên một số dòng vi khuẩn gây bệnhđược chọn, hiệu quả đối kháng, kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn được phân lập từ
cơ chất vùng rễ cây hoa hồng, đất vùng rễ trồng cây ớt, và đất vùng sinh thái bản địa
được sàng lọc và đánh giá trong điều kiện in vitro, nhà lưới và ngoài đồng Qua sàng lọc
in vitro, kết quả ghi nhận ba dòng BR16, BR37, BR88 (từ cơ chất vùng rễ cây hoa hồng)
và ba dòng T265, X61, G24 (từ đất vùng sinh thái bản địa) thể hiện sự đối kháng triển
vọng với ba dòng Xanthomonas euvesicatoria (XR13, XR9, XR18) gây bệnh đốm lá
trên cây hoa hồng Đồng thời, ba dòng BP11, BP49, BP103 (từ đất vùng rễ cây ớt) vàG24, T11, T188 (từ đất vùng sinh thái bản địa) có khả năng đối kháng triển vọng đối
với ba dòng Xanthomonas spp (XP17, XP7, XP1) gây bệnh trên cây ớt Các dòng vi
khuẩn đối kháng triển vọng được xác định qua kỹ thuật phân tích MALDI-TOF-MS, các
dòng BP49, X61 được xác định đến loài B subtilis, và ghi nhận các dòng BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24 thuộc chi Bacillus, dòng T11 thuộc về chi Enterobacter, dòng X16 thuộc chi Serratia Một số dòng được tiếp tục xác định qua phân tích sinh học phân tử và đăng ký “accession number” là các loài B velezensis MW677565 (BR16), B subtilis MW828613 (BR37), B amyloliquefaciens MW828656 (BR88), B velezensis OM017175 (BP103), Paenibacillus elgii MZ841643 (T265), B subtilis MZ841644 (G24) Ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng, với hiệu quả giảm bệnh, giảm chỉ số bệnh và chỉ số AUDPC cao nhất, B amyloliquefaciens MW828656 (BR88)
và B velezensis OM017175 (BP103) được ghi nhận hiệu quả kiểm soát bệnh cao nhất trên đối tượng cây chủ tương ứng, và đặc biệt là B subtilis MZ841644 (G24) phân lập
từ đất vùng sinh thái bản địa đạt hiệu quả kiểm soát bệnh cao nhất trên cả hai loại cây
Trang 6chủ Nhìn chung, nghiên cứu đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây ớt Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận B velezensis (BR16), B subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp (BP11, X32), Enterobacter spp (T11), Serratia spp (X16) có khả năng đối kháng đáng kể, và đã tuyển chọn được B amyloliquefaciens BR88, B velezensis BP103, B subtilis G24 có khả năng kiểm soát bệnh hiệu quả nhất Các dòng vi khuẩn này có thể
được sử dụng như tác nhân sinh học phòng trị bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt
Từ khóa: Đốm lá, Xanthomonas, vi khuẩn đối kháng, cây hoa hồng, cây ớt, hiệu
quả kiểm soát
Trang 7to manage plant diseases.
With the aim of finding potential biological agents in the prevention and treatment
of bacterial leaf spot on rose and pepper, this study was executed with two objectives:
(i) The first was isolation and identification of bacterial strain Xanthomonas spp causing leaf spot disease on Rosa spp and Capsicum spp.; (ii) The second was selection of bacterial isolates capable of controlling leaf spot caused by Xanthomonas spp In thesis,
pathogenic strains were isolated, evaluated for their virulence, and identified throughbiochemistry, MALDI-TOF-MS analysis and molecular analysis technique The result
show that Xanthomonas euvesicatoria causing the leaf spot on rose Meanwhile, Xanthomonas spp causing leaf spot on pepper based on biochemical characteristics.
Against some selected pathogenic strains, the antagonistic and disease control effects ofisolates from the rhizosphere substrates of rose, rhizosphere soil of pepper, and soil of
native ecological area were screened and evaluated under in vitro, net-house and field conditions Through in vitro screening, three isolates with BR16, BR37, BR88 (from
rhizobacteria soil of rose) and three isolates with T265, X61, G24 (from the soil of the
native ecological area) showed potential antagonism to Xanthomonas euvesicatoria
(XR13, XR9, XR18) which causing leaf spot on rose, and three isolates with BP11,BP49, BP103 (from rhizobacteria soil of pepper) and three isolates with G24, T11, T188(from the native ecological area) have potential antagonistic ability against
Xanthomonas spp (XP17, XP7, XP1) which causing leaf spot on pepper Potential
antagonistic isolates are also identified through MALDI-TOF-MS technique, two
isolates of BP49, X61 were identified belong to B subtilis, and the other isolates (BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24) are belong to Bacillus genus, the T11 isolate belongs to Enterobacter genus, and X16 isolate belongs to Serratia genus Identifying by molecular technique and depositing “accession number” as B velezensis MW677565 (BR16), B subtilis MW828613 (BR37), B amyloliquefaciens MW828656 (BR88), B velezensis OM017175 (BP103), Paenibacillus elgii MZ841643 (T265), B subtilis MZ841644 (G24) were performed In the net-house and field conditions, with
the highest efficiency in disease reduction, severity index reduction and AUDPC index,
B amyloliquefaciens MW828656 (BR88) and B velezensis OM017175 (BP103), showed the highest disease control effects on the host plant, respectively Especially, B subtilis MZ841644 (G24) achieved the disease control efficiency on both host plants In general, the thesis recorded Xanthomonas axonopodis causing leaf spot on rose and
Trang 8Xanthomonas spp causing leaf spot on pepper Besides, B velezensis (BR16), B subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp (BP11, X32), Enterobacter spp (T11), Serratia spp (X16) get potential antagonistic ability, and B amyloliquefaciens BR88, B velezensis BP103, B subtilis G24 with the most effective disease control ability were selected.
These isolates can be used as biological agents for the prevention and control of the leafspot disease on rose and pepper
Keywords: Leaf spot, Xanthomonas, antagonistic bacteria, rose, pepper, control
efficiency
Trang 9CAM ĐOAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà chính tôi cùng với ThS Tô LanPhương đã thực hiện và nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Đức Độ và TS.Trần Đình Giỏi Tất cả các số liệu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bốtrong bất kỳ công trình nghiên cứu cùng cấp nào khác
Cán bộ hướng dẫn 1 Cán bộ hướng dẫn 2 Tác giả luận án
TS Nguyễn Đức Độ TS Trần Đình Giỏi Lê Uyển Thanh
Trang 10MỤC LỤC
Tóm tắt ii
Abstract iv
Chương 1: Đặt vấn đề 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu của luận án 2
1.3 Nội dung nghiên cứu 2
1.4 Tính mới của luận án 2
1.5 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 2
1.5.1 Phạm vi nghiên cứu 2
1.5.2 Đối tượng nghiên cứu 3
1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3
1.6.1 Ý nghĩa khoa học 3
1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn 3
Chương 2: Tổng quan tài liệu 4
2.1 Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật 4
2.1.1 Tác nhân gây bệnh 4
2.1.2 Triệu chứng bệnh 5
2.1.3 Quản lý bệnh 5
2.2 Sơ lược về cây hoa hồng và cây ớt 6
2.2.1 Cây hoa hồng 6
2.2.2 Cây ớt 7
2.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp 7
2.3.1 Tương tác của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp 7
2.3.2 Cộng đồng vi khuẩn trong đất ngập nước 9
2.4 Một số cơ chế kiểm soát bệnh thực vật của các dòng vi khuẩn từ đất 12
2.5 Các nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh đốm lá do Xanthomonas sp trên hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt 12
2.5.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng 12
2.5.2 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt 16
Trang 112.6.1 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát
Xanthomonas citri subsp citri trên cây có múi 19
2.6.2 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv campestris trên cây trồng họ cải 20
2.6.3 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát Xanthomonas campestris pv campestris trên cây cà chua và ớt 22
2.6.4 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát các loài Xanthomonas spp khác 23
2.6.5 Kỹ thuật MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desraction Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry) và MLSA (Multilocus sequence analysis) trong nghiên cứu định danh vi khuẩn 24
Chương 3: Phương pháp nghiên cứu 28
3.1 Vật liệu 28
3.1.1 Thời gian và địa điểm 28
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị và Môi trường nuôi cấy 28
3.1.3 Mẫu bệnh cây 29
3.1.4 Vật liệu thí nghiệm 29
3.1.4.1 Giống cây 29
3.1.4.2 Mẫu cơ chất hoặc đất 29
3.1.4.3 Vật liệu trồng cây 30
3.2 Phương pháp 30
3.2.1 Nội dung 1: Phân lập và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt 32
3.2.1.1 Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng chuyên canh các loại cây trồng đã được chọn tại tỉnh Đồng Tháp 32
3.2.1.2 Phân lập, tách ròng vi khuẩn Xanthomonas spp từ các mẫu bệnh 32
3.2.1.3 Khảo sát khả năng gây bệnh trên các cây trồng đã chọn của các dòng Xanthomonas spp gây bệnh 33
3.2.1.4 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp dựa vào hình thái và phương pháp sinh hóa 35
3.2.1.5 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp theo phương pháp MALDI-TOF-MS 36
Trang 123.2.1.6 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp theo kỹ thuật
Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis –
MLSA) 37
3.2.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có nguồn gốc từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp gây bệnh đã được phân lập 39
3.2.2.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu đất thu được 39
3.2.2.2 Khảo sát khả năng đối kháng in vitro trước các dòng Xanthomonas spp được chọn của những dòng vi khuẩn phân lập được từ mẫu đất 40
3.2.2.3 Định danh một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng 42
3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng 43
3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh (BCA) ở điều kiện ngoài đồng 46
3.2.5 Phương pháp lây nhiễm bệnh 47
3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 47
Chương 4: Kết quả và thảo luận 48
4.1 Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn 48
4.1.1 Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây hoa hồng tại tỉnh Đồng Tháp 48
4.1.1.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp gây bệnh trên cây hoa hồng 48
4.1.1.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây hoa hồng của các dòng Xanthomonas spp được phân lập 48
4.1.1.3 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo phương pháp MALDI-TOF-MS 54
4.1.1.4 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis – MLSA) 55
4.1.2 Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp 59
4.1.2.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp gây bệnh trên cây ớt 59
4.1.2.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây ớt của các dòng
Trang 134.1.2.3 Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt theo hình thái,
sinh hóa và sinh học phân tử 664.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với
Xanthomonas spp được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng
sinh thái bản địa 674.2.1 Phân lập vi khuẩn 67
4.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng Xanthomonas spp gây
bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện in vitro 68 4.2.2.1 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây hoa hồng của vi khuẩn phân lập từ cơ chất vùng rễ 68
4.2.2.2 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây hoa hồng của vi khuẩn phân lập từ đất vùng sinh thái
bản địa tỉnh Đồng Tháp 70
4.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng Xanthomonas spp gây
bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện in vitro 73 4.2.3.1 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây ớt của vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ 73
4.2.3.2 Khả năng đối kháng đối với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây ớt của vi khuẩn phân lập từ đất vùng sinh thái bản địa 764.2.4 Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng 784.2.4.1 Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng dựa vào kỹ thuật phân
tích MALDI-TOF-MS 784.2.4.2 Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng dựa vào kỹ thuật phân
tích Sinh học phân tử 814.2.5 Khảo sát mật độ đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng triển
vọng đối với Xanthomonas spp XP17 và XR13 84
4.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn
trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng 894.3.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa
hồng trong điều kiện nhà lưới 894.3.1.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa
hồng trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng
triển vọng từ cơ chất vùng rễ 90
Trang 144.3.1.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa
hồng trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng
triển vọng từ vùng sinh thái bản địa 944.3.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt
trong điều kiện nhà lưới 994.3.2.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt
trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển
vọng từ cơ chất vùng rễ 994.3.2.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt
trong điều kiện nhà lưới của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển
vọng từ vùng sinh thái bản địa 1024.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên
cây hoa hồng và cây ớt ở điều kiện ngoài đồng 1064.4.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa
hồng ở điều kiện ngoài đồng 1064.4.1.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa
hồng ở điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng
triển vọng từ cơ chất vùng rễ 1064.4.1.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa
hồng ở điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng
triển vọng từ vùng sinh thái bản địa 1094.4.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở
điều kiện ngoài đồng 1064.4.2.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở
điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng
từ cơ chất vùng rễ 1064.4.2.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở
điều kiện ngoài đồng của ba dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng
từ vùng sinh thái bản địa 109
Chương 5: Kết luận và đề xuất 120
5.1 Kết luận 120
5.1.1 Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp.
gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng giống hồng lửa (Rosa spp.) và
cây ớt (Capsicum spp.) 120
Trang 155.2 Đề xuất 121
Tài liệu tham khảo 122 Phụ lục
Trang 16DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Các thí nghiệm khảo sát khả năng gây hại trong điều kiện
nhà lưới 34Bảng 3.2: Trình tự các đoạn mồi phục vụ phương pháp phân tích trình
tự đa locus (MLSA) 38Bảng 3.3: Mật độ vi khuẩn đối kháng ban đầu (CFU/mL) trước khi được
pha loãng 42Bảng 3.4: Các thí nghiệm khảo sát khả năng kiểm soát bệnh trong điều
kiện nhà lưới 43Bảng 3.5: Các thí nghiệm khảo sát khả năng kiểm soát bệnh ở điều kiện
ngoài đồng 46Bảng 4.1: Tỷ lệ bệnh (DI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát
gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây hoa hồng trong
điều kiện nhà lưới 49Bảng 4.2: Chỉ số bệnh (SI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát
gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây hoa hồng trong
điều kiện nhà lưới 51
Bảng 4.3: Danh pháp ba dòng Xanthomonas spp (XR9, XR13, XR18)
dựa vào kỹ thuật MALDI-TOF-MS 55
Bảng 4.4: Kết quả BLASTN trình tự sáu gen housekeeping (fusA, gap1,
gltA, gyrB, lacF, lepA) của dòng Xanthomonas sp XR13 gây
bệnh trên cây hoa hồng 56Bảng 4.5: Giá trị ma trận tương đồng (Similarity matrix values - %)
giữa dòng Xanthomonas axonopodis XR13 và các dòng
Xanthomonas spp trong cùng nhánh phát sinh loài 59
Bảng 4.6: Tỷ lệ bệnh (DI) đốm lá vi khuẩn gây ra bởi 20 dòng
Xanthomonas spp trên cây ớt 61
Bảng 4.7: Chỉ số bệnh (SI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát
gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây ớt trong điều
kiện nhà lưới 63
Bảng 4.8: Khả năng đối kháng in vitro của 14 dòng vi khuẩn đối với
ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa
hồng (Rosa spp.) 68
Trang 17Bảng 4.9: Đường kính vùng ức chế của 17 dòng vi khuẩn đối kháng
triển vọng đối với 3 dòng Xanthomonas spp (XR13, XR9,
XR18) gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng 71Bảng 4.10: Đường kính vùng ức chế của 14 dòng vi khuẩn vùng rễ đối
kháng đối với 3 dòng Xanthomonas spp (XP17, XP7, XP1)
gây bệnh đốm lá trên cây ớt 74Bảng 4.11: Đường kính vùng ức chế của 13 dòng vi khuẩn vùng sinh
thái bản địa đối với 3 dòng Xanthomonas spp (XP17, XP7,
XP1) gây bệnh đốm lá trên cây ớt 77Bảng 4.12: Danh pháp một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng dựa
vào kỹ thuật MALDI-TOF-MS 80Bảng 4.13 : Kết quả BLASTN các trình tự của các dòng vi khuẩn đối
kháng triển vọng 82Bảng 4.14: Đường kính vùng ức chế (mm) do các dòng vi khuẩn đối
kháng đối với Xanthomonas spp XP17 hoặc XR13 85
Bảng 4.15: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây
hoa hồng của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16, BR37,
BR88) sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 91Bảng 4.16: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và AUDPC
khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16, BR37,
BR88) sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 92Bảng 4.17: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây
hoa hồng của vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24)
sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 96Bảng 4.18: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và AUDPC
khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24)
sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 97Bảng 4.19: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây
ớt của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BP11, BP49, BP103)
sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 100Bảng 4.20: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt và AUDPC khi xử
lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (BP11, BP49, BP103)
sau 16 NSKLN trong điều kiện nhà lưới 101Bảng 4.21: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây
ớt của vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) sau 16
NSKLN trong điều kiện nhà lưới 103
Trang 18Bảng 4.22: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt và AUDPC khi xử
lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) sau 16
NSKLN trong điều kiện nhà lưới 104Bảng 4.23: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây
hoa hồng của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16, BR37,
BR88) ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 107Bảng 4.24: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và AUDPC
khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (BR16, BR37,
BR88) ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 108Bảng 4.25: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây
hoa hồng của vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24)
ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 110Bảng 4.26: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và AUDPC
khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (X61, T265, G24)
ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 111Bảng 4.27: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây
ớt của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BP11, BP49, BP103)
sau 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 114Bảng 4.28: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt và chỉ số tích lũy
bệnh theo thời gian khi xử lý với vi khuẩn đối kháng triển
vọng (BP11, BP49, BP103) sau 16 NSKLN ở điều kiện ngoài
đồng 115Bảng 4.29: Tỷ lệ bệnh và hiệu quả giảm bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây
ớt của vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) sau 16
NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 117Bảng 4.30: Chỉ số bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt và AUDPC khi xử
lý với vi khuẩn đối kháng triển vọng (G24, T11, T188) sau 16
NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 118
Trang 19rễ và các quá trình hiếu khí và kỵ khí liên quan đến sự tái sinh
các nguyên tố, cũng như sự phát thải methane từ đất ngập
nước (Paul et al., 2013) 11 Hình 2.4: Những triệu chứng của bệnh đốm lá vi khuẩn trên Rosa
RADtko (tráit) and RADrazz (phải) tại Hoa Kỳ (Huang et al.,
2013) 13
Hình 2.5: Sự phát sinh loài của các dòng rosa của chi Xanthomonas dựa
trên các dữ liệu kết nối của các đoạn gen fusA, gap-1, gltA,
gyrB, lacF, và lepA (Huang et al., 2013) 15
Hình 2.6: Các triệu chứng đốm vi khuẩn trên cây ớt và lá cà chua được
dòng dòng vi khuẩn CNUPBL 2039 17Hình 2.7: Sơ đồ hiển thị quy trình hoạt động trong MALDI-TOF-MS 26Hình 3.1: Quy trình thí nghiệm được sử dụng trong đề tài 30Hình 3.2: Hình dạng đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng giống hồng lửa
(A), cây ớt (B) 32Hình 3.3: Hình dạng tiết dịch khuẩn gây bệnh từ vết cắt ngang mẫu
bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng (A), kỹ thuật hộp ria
(Burgess et al 2009) (B) 33
Hình 3.4: Vị trí thu mẫu tại vườn Quốc gia Tràm Chim (A), thu 9 mẫu
(B) 39Hình 3.5: Các thao tác khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh của dòng vi khuẩn phân lập từ đất 40
Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đốm lá vi khuẩn trên Rosa spp và khuẩn
lạc vi khuẩn gây bệnh 48Hình 4.2: Tỷ lệ bệnh (DI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát
gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây hoa hồng trong
điều kiện nhà lưới 50Hình 4.3: Chỉ số bệnh (SI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát
gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây hoa hồng trong
điều kiện nhà lưới 52
Trang 20Hình 4.4: Biểu đồ hộp thể hiện tỷ lệ bệnh (A), chỉ số bệnh (B), chỉ số
AUDPC (C) từ các dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới 53Hình 4.5: Khả năng gây bệnh của ba dòng vi khuẩn (XR9, XR13, XR18)
gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới 54
Hình 4.6: Kết quả điện di trình tự sáu gen housekeeping của dòng
Xanthomonas axonopodis XR13 gây bệnh trên cây hoa hồng 57 Hình 4.7: Phát sinh loài của dòng Xanthomonas axonopodis XR13 gây
bệnh trên cây hoa hồng dựa trên trình tự nối của các gen fusA,
gap-1, gltA, gyrB, lacF và lepA 58 Hình 4.8: Đặc điểm của vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên Capsicum spp.
và khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh 60Hình 4.9: Tỷ lệ bệnh (DI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo sát
gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây ớt trong điều
kiện nhà lưới 62Hình 4.10: Chỉ số bệnh (SI) đốm lá vi khuẩn theo các thời điểm khảo
sát gây ra bởi 20 dòng Xanthomonas spp trên cây ớt trong
điều kiện nhà lưới 64Hình 4.11: Biểu đồ hộp thể hiện tỷ lệ bệnh (A), chỉ số bệnh (B), chỉ số
AUDPC (C) từ các dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới 65Hình 4.12: Khả năng gây bệnh của ba dòng vi khuẩn (XR9, XR13,
XR18) gây bệnh đốm lá trên cây ớt trong điều kiện nhà lưới 66Hình 4.13: Hình 4.13: Đặc điểm triệu chứng bệnh và Gram âm của ba
dòng XP1, XP7, XP17 67Hình 4.14: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn
vùng rễ đối với ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây hoa hồng 69Hình 4.15: Hiệu quả của các dòng vi khuẩn đối kháng (BR16, BR37,
BR88) đối với ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây hoa hồng 70Hình 4.16: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn
vùng sinh thái bản địa đối với ba dòng Xanthomonas spp gây
bệnh đốm lá trên cây hoa hồng 72
Trang 21Hình 4.18: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn
vùng rễ đối với ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá
trên cây hoa hồng 75Hình 4.19: Hiệu quả đối kháng của vi khuẩn vùng rễ triển vọng (BP11,
BP49, BP103) đối với ba dòng Xanthomonas spp gây bệnh
đốm lá trên cây ớt 76Hình 4.20: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn
vùng sinh thái bản địa đối với ba dòng Xanthomonas spp gây
bệnh đốm lá trên cây hoa hồng 78Hình 4.21: Hiệu quả đối kháng của vi khuẩn vùng sinh thái bản địa triển
vọng (G24, T11, T188) đối với ba dòng Xanthomonas spp.
(XP17, XP7, XP1) gây bệnh đốm lá trên cây ớt 78Hình 4.22: Kết quả điện di của gen 16S rRNA của một số dòng vi khuẩn
đối kháng triển vọng 81
Hình 4.23: Biểu đồ thể hiện đường kính vùng ức chế Xanthomonas spp.
của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng theo các mật độ
pha loãng khác nhau 86
Hình 4.24: Biểu đồ thể hiện đường kính vùng ức chế Xanthomonas spp.
của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng theo các mật độ
pha loãng khác nhau 88
Hình 4.25: Đường kính vùng ức chế Xanthomonas spp của vi khuẩn
đối kháng triển vọng 89Hình 4.26: Hiệu quả kiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng
triển vọng (BR88) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa
hồng sau 16 NSKLN 93Hình 4.27: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng
(G24) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng sau 16
NSKLN 98Hình 4.28: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng
(BP103) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt sau 16 NSKLN
102Hình 4.29: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng
(G24) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt sau 16 NSKLN
105
Trang 22Hình 4.30: Hiệu quả kiểm soát bệnh của ba dòng vi khuẩn đối kháng
triển vọng (BR16, BR37, BR88) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn
ở 16 NSKLN ở điều kiện ngoài đồng 109Hình 4.31: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng
(X61, T265, G24) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn ở 16 NSKLN
ở điều kiện ngoài đồng 112Hình 4.32: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng
(BP103) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiện
ngoài đồng sau 16 NSKLN 116Hình 4.33: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng
(G24) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt ở điều kiện
ngoài đồng sau 16 NSKLN 119
Trang 23CBB: Cassava bacterial blight (Bệnh bạc lá do vi khuẩn trên cây sắn)
fusA: translation elongation factor G gene
gap-1: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene
gltA: citrate synthase gene
gyrB: DNA gyrase subunit B gene.
IAA: Indole – 3 – acetic acid
MS: mass spectrometry
MALDI-TOF-MS: Matrix Assisted Laser Desraction Ionization
Time-Of-Flight mass spectrometry
ML: Maximum Composite Likelihood
MLSA: Multilocus sequence analysis
NT: Nghiệm thức
NSKLN: Ngày sau khi lây nhiễm
lacF: ABC transporter sugar permease gene
lepA: GTP binding protein gene
PGPB (Plant Growth Promoting Bacteria)
PMF: peptide mass fingerprint
Xam: X axonopodis pv manihotis
Xap: X axonopodis pv passiflorae
Trang 24CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, sản xuất nông nghiệp phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng thuốc bảo
vệ thực vật nhờ chúng đạt hiệu quả nhanh chóng Thực trạng biến đổi khí hậu ngày càngkhiến canh tác nông nghiệp gặp nhiều khó khăn như cây trồng sinh trưởng phát triểnkhông hiệu quả, dịch bệnh dễ bùng phát, và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càngtrở nên trầm trọng Tại Đồng Tháp, gần đây đã xuất hiện nhiều dịch bệnh nghiêm trọng
Trong đó, bệnh đốm lá vi khuẩn do chi Xanthomonas gây ra trên hai loài cây trồng chủ
lực của tỉnh là cây ớt và cây hoa hồng là đặc biệt nghiêm trọng Đối với các nông hộ thunhập chính từ hai loài cây này, nông dân đã tiến hành canh tác liên tục trong năm đểtăng thu nhập, kết hợp với việc mở rộng không ngừng vùng chuyên canh đã tạo điềukiện thuận lợi cho nhiều mầm bệnh phát triển và gây hại Bên cạnh đó, biện pháp chiếtnhánh cây hoa hồng để giữ giống hoặc sử dụng hạt giống ớt không kiểm soát nguồn gốc
đã giúp bệnh lưu tồn và lây lan từ vụ này sang vụ khác Để đối phó với bệnh đốm lá vikhuẩn, khi bệnh mới phát nên nhổ bỏ ngay cây bệnh và hạn chế tưới nước, nên phunngay các loại thuốc hóa học đặc trị vi khuẩn (Cúc & Thủy, 2014) Tuy nhiên, thuốckháng sinh và thuốc bảo vệ thực vật thường được sử dụng vượt ngưỡng cho phép, gâyngộ độc cho cây, sẽ rất tốn kém, có hại cho thiên địch và các vi sinh vật có lợi, gây ô
nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Robison et al., 2006; Adesemoye et al., 2009) và dễ làm mầm bệnh kháng thuốc Do đó, cần tập trung nghiên
cứu phát triển các phương pháp mới giúp kiểm soát bệnh cây trồng một cách bền vững(Gerhardson, 2002), tiết kiệm chi phí và hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật
Trong trường hợp này, kiểm soát sinh học (biological control) ứng dụng vi khuẩnkiểm soát bệnh (Biological control agent- BCA) là một chiến lược quan trọng trong việc
quản lý canh tác một cách bền vững và giảm các vấn đề về môi trường (Bale et al., 2008; Adesemoye et al., 2009; Hungria et al., 2010; 2013) Các chế phẩm vi sinh vật được sử
dụng hiệu quả nhằm giảm bệnh hại trên lá hoặc sau thu hoạch ở các loại cây ngũ cốc,
rau, cây ăn trái, cây hoa, cây cảnh (Cawoy et al., 2011) Chúng phân tán nhanh hơn vào
môi trường và thường ít độc hơn đối với các loài không phải mục tiêu Ngoài ra, vì sửdụng các phương thức tác động khác với thuốc bảo vệ thực vật thông thường nên chúng
có thể giúp ngăn chặn các mầm bệnh kháng thuốc (Bhattacharyya et al., 2016; Marasco
et al., 2012).
Trước đây, đa số các diện tích ẩm, lầy thấp ở Đồng Tháp được bao phủ bởi rừngrậm, và cây tràm được xem là đặc thù Hiện nay, tại Đồng Tháp rừng đặc dụng đượcphân bổ ở các khu vực được bảo tồn như Vườn Quốc Gia Tràm Chim, Khu di tích Xẻo
Trang 25tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh” đã được thực hiện.
1.2 Mục tiêu của luận án
Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.).
Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi
khuẩn do Xanthomonas spp gây ra.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây hại và xác định các dòng vi khuẩngây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng giống hồng lửa và cây ớt
Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp.
được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa
Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiệnnhà lưới của những dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng
Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh tiềm năng
ở điều kiện ngoài đồng
1.4 Tính mới của luận án
Nghiên cứu đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây ớt nhờ vào các kỹ thuật sinh hóa,
MALDI-TOF-MS và sinh học phân tử như multilocus sequence analysis (MLSA)
Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận B velezensis (BR16), B subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp (BP11, X32), Enterobacter spp (T11), Serratia spp (X16)
có khả năng đối kháng đáng kể, đặc biệt, nghiên cứu đã tuyển chọn được B amyloliquefaciens BR88, B velezensis BP103, B subtilis G24 có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn hiệu quả nhất dựa trên các thí nghiệm sàng lọc in vitro, nhà lưới,
ngoài đồng, và được xác định danh pháp bằng kỹ thật phân tích MALDI-TOF-MS vàSinh học phân tử Các dòng vi khuẩn này có thể được sử dụng như tác nhân sinh họcphòng trị bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt
1.5 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu
1.5.1 Phạm vi nghiên cứu
Trang 26Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm khi phân lập vi khuẩn
gây bệnh và tuyển chọn in vitro các dòng vi khuẩn đối kháng.
Nghiên cứu đánh giá khả năng gây hại của các dòng Xanthomonas spp và đánh
giá hiệu quả kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn đối kháng được thực hiện ở điềukiện nhà lưới và ngoài đồng
1.5.2 Đối tượng nghiên cứu
Giống cây hoa hồng giống hồng lửa và cây ớt chỉ thiên được sử dụng trong thínghiệm, đây là giống cây được người dân trồng phổ biến tại tỉnh Đồng Tháp và đượcngười dân đánh giá là giống có tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất Bên cạnh đó, vi khuẩn gâybệnh và vi khuẩn đối kháng được phân lập từ tỉnh Đồng Tháp
1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Việc phân tích khả năng gây hại của mầm bệnh và khả năng đối kháng của cácdòng vi khuẩn được phân lập trên cơ sở các kết quả đã được xử lý bằng các phân tíchkhoa học trên phần mềm đã được công nhận đã cung cấp một nguồn thông tin khoa học,tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo
1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học hướng đến sử dụng các dòng vi khuẩnđối kháng triển vọng trong kiểm soát bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt trongđiều kiện sản xuất thực tế, phục vụ sự phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững
Trang 27CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật
2.1.1 Tác nhân gây bệnh
Bệnh do vi khuẩn gây ra là một trong những trở ngại khó kiểm soát và dễ tái phátnhất đối với các vụ mùa trên khắp thế giới Nguyên nhân là do sự tăng sinh nhanh chóng,
sự khó khăn trong quản lý, các vấn đề phát sinh khi kiểm soát bằng thuốc hóa học, và
sự thiệt hại nghiêm trọng của các trang trại bị nhiễm bệnh (Sundin et al., 2016) Xanthomonas là một chi vi khuẩn lớn gây bệnh trên thực vật, có phản ứng gram âm,
hình que và sắc tố vàng Chi này gây bệnh trên 400 loài vật phân bố trên toàn thế giới
và là tác nhân gây bệnh cho một số cây trồng quan trọng về kinh tế như: lúa (rice), camquýt (citrus), sắn (cassava), cà chua (tomato), mía đường (sugar cane), chanh dây
(passionfruit), chuối (banana) (Ryan et al., 2011; Rodriguez et al., 2012) Vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas có thể tương tác với cây chủ bằng nhiều phương thức, chúng có
thể tồn tại trong đất, hạt giống, tàn tích cây trồng, tương tác với côn trùng và đặc biệt là
có thể sống độc lập với cây chủ Những hình thức sinh tồn này tạo điều kiện cho sự pháttriển của dịch bệnh (Marcuzzo, 2009)
Một số Xanthomonas spp gây bệnh cho các loài cây thuộc họ Rosaceae đã được báo cáo, như Xanthomonas fragariae trên dâu tây (Roberts et al., 1997), X pruni trên đào (Wert et al., 2006) Tuy nhiên, rất ít báo cáo về Xanthomonas spp gây bệnh về hoa hồng (Rosa spp.), một thành viên của họ Rosaceae, bước đầu ghi nhận dòng vi khuẩn này trên cây hoa hồng thuộc loài Xanthomonas euvesicatoria (Huang et al 2013; Barak
et al., 2016).
Trên họ Solanaceae, Jones et al (2004) đã ghi nhận rằng tất cả vi khuẩn thuộc Xanthomonas gây bệnh đốm lá vi khuẩn (bacterial spot Xanthomonas – BSX) được phân thành 4 loài là X euvesicatoria, X vesicatoria, X perforans, và X gardneri Trong đó,
X euvesicatoria và X vesicatoria gây bệnh trên cả ớt và cà chua (Jones et al., 2004) Trong khi, một số loài Xanthomonas spp chỉ gây bệnh trên cà chua như X perforans and X gardneri Tuy nhiên, gần đây Potnis et al (2015) lại ghi nhận X perforans đã xuất hiện trên ớt Tại Hàn Quốc, Myung et al (2015) và Kyeon et al (2016) đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh trên ớt (Capsicum sp.).
Các vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas lây nhiễm và gây bệnh trên nhiều loài thực
vật nhờ vào các nhân tố lây nhiễm như các polysaccharide bề mặt, các chất có khả năngkết dính, các hệ thống tiết và phản ứng siêu nhạy cảm khác nhau, các chất độc, các chứcnăng liên quan làm mất tác dụng các hợp chất kháng khuẩn của cây trồng tiết ra, và khảnăng thu nhận chất dinh dưỡng (Agrios, 2005)
Trang 282.1.2 Triệu chứng bệnh
Những triệu chứng bệnh điển hình của bệnh đốm lá vi khuẩn như: dưới dạng nhữngđốm nhỏ, ngấm nước, phát triển thành những đốm hoại tử bất thường và có góc cạnh,thường có đường kính từ 1,58 mm (1/16 inch) đến 6,35 mm (1/4 inch) Những đốm này
có trung tâm màu xám nhạt và mép nâu tối, được bao quanh bởi các vòng màu vàng hẹp
(Lowell et al., 1991; Agrios, 2005; Nguyễn Thị Thu Cúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014).
Mô ở trung tâm của đốm có thể khô và rụi đi, tạo ra một “lỗ hỏng” (shot–hole) Trongđiều kiện ẩm ướt và mưa liên tục, các vết thương sẽ lan rất nhanh, giữ màu xanh đậm,
và bị ngấm nước Nhiều đốm có thể kết hợp lại và gây ra vết hoại tử lớn Cuối cùng, lá
biến màu vàng và rụng sớm (Myung et al., 2009; Huang et al., 2013).
Hình 2.1: Mẫu bệnh đốm lá vi khuẩn trên lá hoa hồng (A), ớt (B).
Các dòng vi khuẩn này thường không lưu tồn trong đất nhưng có thể tồn tại trongmột năm hoặc lâu hơn trên trong hạt Cây con có thể bị nhiễm bởi gió hoặc nước bắnlên từ các cây bệnh lân cận Các cây ghép bị nhiễm bệnh được đưa vào cánh đồng cóthể đóng vai trò như nguồn gốc ban đầu của bệnh Vi khuẩn này cũng có thể sống trêntàn dư cây ớt và cà chua từ vụ mùa trước hoặc tồn tại trên cỏ dại (Agrios, 2005; NguyễnThị Thu Cúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014) Tưới phun một cách thường xuyên, trongđiều kiện ấm áp, hoặc mưa to và kéo dài sẽ gây ra sự bùng phát bệnh nghiêm trọng Tất
cả các tác nhân như gió, giọt mưa rơi, hoặc nước tưới, sự chuyển động của thiết bị xịt
áp suất, và cả việc xử lý cây ướt đều hỗ trợ sự lây lan của vi khuẩn trên đồng ruộng Sựlan truyền bệnh trong một cánh đồng thường có thể tương quan với hướng gió thổi Sựlây nhiễm xảy ra thông qua các lỗ tự nhiên (stomates) hoặc thông qua các vết thươngtrên lá và thân cây do côn trùng gây ra hoặc do cọ xát (Nguyễn Thị Thu Cúc và TrầnThị Thu Thủy, 2014) Bệnh phát triển mạnh khi ở điều kiện độ ẩm cao và kéo dài, nhiệt
độ cao dao động từ 200C đến 350C Nhiệt độ ban đêm từ 240C đến 280C giúp phát triểnbệnh tật trong khi nhiệt độ ban đêm thấp (160C) ngăn chặn sự phát triển của bệnh bất kểnhiệt độ ban ngày Nồng độ nitơ cao thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn trên cây Cácdòng khác nhau của vi khuẩn có thể được xác định dựa trên phạm vi và các triệu chứngcủa ký chủ
2.1.3 Quản lý bệnh
Bệnh do các loài Xanthomonas spp thường bắt đầu với hạt giống bị nhiễm, mặc
Trang 29nông nghiệp như cắt tỉa và phun sương cho luống trồng, nước mưa, nhiễm trong đất và
có thể do côn trùng (Ryan et al., 2011) Nhìn chung, việc kiểm soát sự lây nhiễm trùng
do các mầm bệnh khác nhau của chi Xanthomonas được thực hiện bằng cách sử dụng
các loài hoặc giống ít nhiễm bệnh hơn, sử dụng các tấm chắn gió, khử trùng thiết bị vàdụng cụ canh tác, bổ sung các hóa chất gốc đồng và loại bỏ các cây bị nhiễm bệnh (Liu
et al., 2016) Tuy nhiên, những biện pháp này là chưa thật sự hiệu quả, do sự tích tụ của
chất hóa học trong môi trường, khả năng nhiễm bệnh của các giống được cho là kháng
bệnh và những tổn thất về diện tích cây trồng (Pernezny et al., 2012; Dewdney &
Graham, 2017)
Tại Đồng Tháp, khi vi khẩn gây bệnh đã xâm nhập được vào ruộng ớt hoặc hoahồng thì cực kỳ khó kiểm soát Do đó, việc ngăn ngừa lây nhiễm mầm bệnh từ các câyghép hoặc cây trung gian là rất quan trọng Khi mua cây con cần đảm bảo được nguồngốc và được kiểm tra, chứng nhận là không bị bệnh Luân canh với cây trồng khác họ.Tiêu hủy những tàn dư trước khi vào mùa vụ tiếp theo Kiểm soát cỏ dại bên trong vàxung quanh các cánh đồng Thiết lập và duy trì một chương trình sinh sản cân bằng đất
(Burgess et al., 2009, Cúc & Thủy, 2014) Ngoài ra, tránh tình trạng sinh trưởng quá
mức, đặc biệt là trước khi ra quả, vì điều này có thể dẫn đến việc có quá nhiều lá và tăngmức độ nghiêm trọng của bệnh Hạn chế tưới phun Sau khi trồng cây có thể sử dụngcác hợp chất chứa đồng như dung dịch Bordeaux trước khi xuất hiện bệnh Tiếp tụcphun lên lá theo lịch trình từ 7 đến 10 ngày Thuốc xịt áp dụng cho cây trồng trước khimưa hoặc tưới tiêu là có lợi nhất Ngoài ra còn có thể sử dụng các chế phẩm vi sinh vàoviệc quản lý, cũng như quản lý dịch hại tổng hợp (Agrios, 2005)
2.2 Sơ lược về cây hoa hồng và cây ớt
2.2.1 Cây hoa hồng
Cây hoa hồng (Rosa spp.) thuộc họ Rosaceae Cây có xuất xứ từ ôn đới và bán
nhiệt đới Ở nước ta, cây hoa hồng được trồng ở nhiều vùng trên cả nước Theo NguyễnXuân Linh (1998), hoa hồng gồm hơn 300 loài được phân bố ở khắp bán cầu Hoa hồngđược trồng đầu tiên ở Trung Quốc và sau đó du nhập qua Châu Âu, và chính nơi đây,chúng được lai tạo thành các giống hoa hồng như ngày nay
Cây hoa hồng có rễ thuộc rễ chùm, chiều ngang tương đối rộng và khi bộ rễ lớn sẽphát sinh nhiều rễ phụ Thân cây thuộc nhóm cây thân gỗ, cây bụi thấp, thẳng, có nhiềucành và gai cong Cây ưa khí hậu ôn hòa, nhiệt độ sinh trưởng phát triển tốt là vàokhoảng 18 – 250C Đất trồng loài cây này phải cao ráo, thoát nước tốt, pH từ 5,6 – 6,5(Phạm Văn Duệ, 2005; Nguyễn Xuân Linh, 1998) Yêu cầu ẩm độ đất khoảng 60 – 70%,
độ ẩm không khí vào khoảng 80- 85%
Tại Đồng Tháp, cây hoa hồng được trồng chủ yếu ở Làng hoa Sa Đéc với nhiềugiống như hồng nhung, hồng lửa (hay hồng Pháp), hồng tỉ muội, hồng tường vi,… Trong
Trang 30đó, hồng nhung và hồng lửa chiếm đa số và mang lại giá trị kinh tế cao cho người nôngdân Tuy nhiên, việc trồng hoa thâm canh và ngày càng mở rộng đã tạo điều kiện chonhiều loại sâu bệnh có cơ hội phát sinh, phát triển, lây lan và gây hại (Nguyễn Thị ThuCúc và Trần Thị Thu Thủy, 2014).
có nhiều cành, nhẵn; lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn; hoa mọc đơn độc ở kẽ lá
Ở nước ta, cây ớt được trồng ở nhiều nơi, thuộc nhóm cây gia vị có tiềm năng phát triểnrất lớn ở nước ta Cây ớt phát triển tốt ở đất thịt nhẹ, đất pha cát dễ thoát nước Hạt ớtnảy mầm ở 25-300C
Đồng Tháp (ĐT) là một trong những tỉnh có diện tích trồng ớt lớn nhất đòng bằngSông Cửu Long Năm 2013, diện tích trồng ớt của Đồng Tháp là 2.766 ha (chiếm hơn50% diện tích trồng ớt ở ĐBSCL và sản lượng đạt 30.428 tấn Đồng Tháp có điều kiện
tự nhiên phù hợp cho cây ớt phát triển và chất lượng cao, nhất là đất cồn ở huyện ThanhBình, năng suất trung bình 11 tấn/ha (giảm 26,7% so với năm 2012) Tuy nhiên, gần đâydiện tích và sản lượng ớt bị giảm do tình hình thời tiết bất lợi (ảnh hưởng biến đổi khíhậu) dẫn đến dịch bệnh xuất hiện thường xuyên trên cây ớt, đặc biệt là bọ trĩ, bệnh thánthư, bệnh do virus, bệnh héo xanh, đốm lá vi khuẩn, Dịch bệnh gây thiệt hại lớn vềnăng suất và chất lượng ớt, đến nay chưa có một quy trình quản lý dịch bệnh trên ớt hiệuquả, nông dân sử dụng thuốc hóa học là giải pháp phổ biến Hơn nữa, do thâm canh liêntục nhiều vụ, đất đai bị bạc màu trong khi nông dân không có tập quán sử dụng phânhữu cơ Điều này dẫn đến độ phì tự nhiên của đất giảm làm hạn chế năng suất của ớt(Võ Thị Thanh Lộc, 2015)
2.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp
2.3.1 Tương tác của vi khuẩn trong đất đối với hệ sinh thái nông nghiệp
Một trong những thách thức chính trong thế kỷ XXI là làm sao canh tác cây trồngmột cách bền vững Những vi sinh vật liên quan đến cây trồng giữ chức năng sinh tháiquan trọng đối với đất và cây trồng Chức năng này bao gồm những ảnh hưởng củachúng lên sự sinh trưởng và sức sống; nâng cao được khả năng chịu đựng stress, hỗ trợkhả năng kháng bệnh; hỗ trợ sự hấp thu những dinh dưỡng có ích của cây trồng, và thúcđẩy đa dạng sinh học (Maheshwari, 2012) Hơn 150 năm qua, nhiều nghiên cứu đã chứngminh rằng vi khuẩn và nấm có một sự tương tác mật thiết với cây trồng, có thể kích thích
Trang 31Trong đó, vi khuẩn là một trong những sinh vật thích nghi nhất Sự tiến hóa củachúng trong suốt thời gian dài, và khả năng thích nghi đa dạng cao và trước các môitrường bất lợi, kết hợp với chọn lọc tự nhiên đã làm cho những vi sinh vật này có thểphục hồi tốt nhất trong các dạng sống trên hành tinh này Vì vậy, vi khuẩn trong đất đã
có những đóng góp thiết yếu trong việc duy trì sự cân bằng sinh thái Một trong những
sự phát triển đáng chú ý nhất của vi sinh vật trong thế kỷ XX là phát hiện vi khuẩn kíchthích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB), chúng cung cấpmột loạt các đặc tính có lợi cho cây trồng, qua đó tạo thuận lợi cho việc tăng năng suấtcây trồng một cách bền vững
Các loại đất tự nhiên có sự hiện diện của những quần thể vi sinh vật trong trạngthái cân bằng động Ước tính có khoảng 7,7 kg nấm và 18,1 kg vi khuẩn tồn tại trên mỗimẫu Anh (khoảng 0,4 hecta) Các vi sinh vật đất cạnh tranh với nhau về nguồn dinhdưỡng và không gian sống (Maheshwari, 2012) Chúng đóng vai trò trung tâm trongviệc điều khiển cách thức mà các hệ sinh thái trên mặt đất phản ứng với sự thay đổi khíhậu toàn cầu Cây trồng thường đáp ứng với nồng độ CO2 cao bằng cách tăng tạo rễ vàtiết dịch (Korner, 2000) Đa số các vi khuẩn có trong đất mang lại lợi ích cho cây trồng
bằng các con đường như: (i) Liên kết trực tiếp với rễ (mycorrhizae, vi khuẩn hình thành nốt); (ii) Phân hủy và giải phóng các chất khoáng từ các chất hữu cơ có trong đất làm tăng hàm lượng các chất sẳn có cho cây sử dụng; (iii) Ký sinh hoặc gây hại cho bệnh cây; (iv) Ức chế sự tăng trưởng, sinh sản, và hoạt động gây hại của bệnh hại nhờ vào các
tương tác ức chế hóa học của các vi sinh vật Các loại nấm và vi khuẩn này thường cótrong tất cả các loại đất tự nhiên
Tất cả các môi trường ảnh hưởng đến cây trồng ở mức vi mô, đặc biệt là vùng rễ
(rhizosphere) đều hiện diện một lượng lớn vi sinh vật (Berg et al., 2005) Khi kiểm tra
những dòng vi khuẩn được phân lập từ môi trường sống của cây trồng ghi nhận khoảng1% đến 35% dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng ức chế sự phát triển của các mầm
bệnh (Berg et al., 2002, 2006) Trong các dòng vi khuẩn được phân lập, tỷ lệ dòng vi
khuẩn biểu hiện đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật (PGPB) cao hơn nhiều và có
thể lên đến 2/3 quần thể (Furnkranz et al., 2009) Sự kích thích tăng trưởng thực vật có
thể đạt được bằng sự tương tác trực tiếp giữa các vi khuẩn có lợi và cây chủ và gián tiếp
do hoạt động chống lại mầm bệnh thực vật Phương thức hoạt động và khả năng sử dụng,tiềm năng cho các ứng dụng công nghệ sinh học được thể hiện trong hình 2.2
Trang 32Hình 2.2: Sự tương tác giữa cây trồng và vi sinh vật kích thích sự sinh trưởng và sức
khoẻ cây trồng (Berg & Smalla, 2009)
Các vi khuẩn có lợi có thể được phân loại theo chức năng như: (i) kích thích sự tăng trưởng thực vật (plant–growth–promoting bacteria–PGPB); (ii) tác nhân kiểm soát
sinh học (biological control agents – BCA) Tác động trực tiếp của PGPB hoặc PGPR(plant–growth–promoting rhizobacteria) là kích thích tăng trưởng thực vật, trong khiảnh hưởng trực tiếp của BCA là để kiểm soát mầm bệnh, lần lượt cải thiện năng suấtcây trồng
Tuy nhiên, theo Avis et al (2008), PGPR và BCA có thể có tác dụng thứ cấp ở các cây trồng có quan hệ gần Ví dụ như chi Sinorhizobium (PGPB) nổi tiếng nhất với vai
trò chính là cố định đạm, và vì thế cải thiện sự sinh trưởng của cây trồng; Tuy nhiên,
loài Sinorhizobium cũng có liên quan đến sự ức chế bệnh bằng cách kích thích tăng tổng
hợp các hợp chất bảo vệ thực vật, dẫn đến kiểm soát mầm bệnh và kích kháng lưu dẫn
2.3.2 Cộng đồng vi khuẩn trong đất ngập nước
Các vùng đất ngập nước là một trong những hệ sinh thái quan trọng nhất trên tráiđất Hiện nay, sự đa dạng sinh học và khả năng sản xuất của hệ sinh thái này có giá trịlớn đối với cuộc sống trên hành tinh của chúng ta Tuy nhiên, tính đa dạng và chức năngcủa các cộng đồng vi sinh vật trong các hệ thống đất ngập nước rất ít được khảo sát so
Trang 33Sự phát triển quan trọng của vi sinh vật trong đất ngập nước ở thập kỷ đầu tiên củathế kỷ 21 đã được đánh giá bước đầu Trong đó, sự chuyển hóa của vi sinh vật ở vùng
đất ngập nước được đánh giá bởi Lamers et al (2012), cho thấy tác động của các hoạt
động vi sinh vật đối với sự sinh trưởng và năng suất thực vật Nhiều chuyển hóa sinhhọc được xúc tác bởi các vi khuẩn có thể kiểm soát thành phần thực vật ở vùng đất ngậpnước, đặc biệt là chuyển đổi nitrogen, lưu huỳnh và chuyển hóa sắt, như tác nhân làm
giảm sulfate (Pester et al., 2012), cố định nitrogen - diazotrophs (Lovell & Davis, 2012),
Giảm khí methan CH4 (methanotrophs) và khử dinitrogen monoxide N2O - denitrifiers(Kolb and Horn, 2012)
Theo Pester et al (2012), mặc dù hình thành như một quần thể nhỏ, những tác
nhân khử sulfate trong vùng đất ngập nước ngọt có khả năng xúc tác giảm sulfate đáng
kể và tương tác đáng kể với các vi khuẩn trong các chu trình khác Nhìn chung, các khuđất ngập nước nội địa (nước ngọt) có một cộng đồng vi khuẩn rất đa dạng có khả nănggiảm thiểu sulfate Bên cạnh đó, vai trò quan trọng của các vi khuẩn cố định đạm trongmôi trường hạn chế dinh dưỡng được đánh giá bởi Lovell & Davis (2012), ghi nhận rằngcộng đồng vi khuẩn này rất đa dạng thậm chí khác nhau giữa các loài thực vật
Sự ngập nước thường xuyên hoặc định kỳ tạo ra một số đặc điểm đặc trưng về lý,hóa học và sinh học cho môi trường (Ponnamperuma, 1984) Sự phân tầng quan trọngnhất giữa nước và đất bị ngập là sự xâm nhập của oxy trong khí quyển Sự khuếch tánoxy trong nước chậm hơn 10.000 lần so với không khí Oxygen nhanh chóng cạn kiệt ởtầng trên của đất ngập do các quá trình oxy hóa hóa học và sinh học, dẫn đến một cấu
trúc đất ở đó sự hiện diện của oxy được giới hạn ở các milimet trên (Frenzel et al., 1992).
Các loài cây trong vùng đất ngập nước đã phát triển các cơ chế để có thể tồn tại và tăngtrưởng trong đất và trầm tích bị thiếu oxygen Còn được gọi là mô không khí, các mônày hiện diện trên chồi và rễ tạo điều kiện vận chuyển oxy từ khí quyển đến rễ, do đócung cấp nguồn oxygen cho quá trình hô hấp
Cây trồng ở vùng đất ngập nước là nơi giao diện giữa hiện diện oxygen và yếmkhí (thiếu oxygen), và do đó cung cấp môi trường sống cho cả vi khuẩn hiếu khí và kỵkhí, tạo điều kiện cho việc tái sản xuất chất dinh dưỡng (Hình 2.3) Bên cạnh oxygen,các loài thực vật tại đây thải ra các hợp chất cacbon hữu cơ cung cấp cho vi sinh vậttrong vùng rễ (rhizosphere) là nguồn năng lượng cần thiết giúp vi sinh vật thực hiện cácphản ứng sinh học khác nhau
Trang 34Hình 2.3: Sơ đồ trình bày sự tương tác giữa sự phóng thích oxygen của rễ và các quá trình hiếu khí và kỵ khí liên quan đến sự tái sinh các nguyên tố, cũng như sự phát thải
methane từ đất ngập nước (Paul et al., 2013).
Ghi chú: các mũi tên liên tục chỉ các quy trình vi sinh vật, mũi tên chấm chấm mô tả quá trình khuếch tán.
Do yêu cầu phải thích ứng với môi trường vùng rễ của vùng đất ngập nước chothấy rằng có thể có sự hiện diện đa dạng các loài vi khuẩn Sự đa dạng vi khuẩn này,đặc biệt là trong môi trường đất, thường đi kèm với sự đa dạng về chức năng, và đượcxem là có ý nghĩa quan trọng trong việc duy trì các chức năng địa sinh học(biogeochemical) dưới sự thay đổi môi trường Vùng rễ (rhizosphere) của các khu đấtngập nước là nơi cư ngụ của một nhóm các vi khuẩn sống tự do và đa dạng có khả năng
cố định nitrogen Cộng đồng vi khuẩn này được duy trì với sự đa dạng cao và ổn định
trước những biến đổi về môi trường (Paul et al., 2006) Ngoài ra, còn có sự hiện diện
của các nhóm vi khuẩn chuyên biệt (vi khuẩn chuyển hóa sắt), chúng thường liên quanđến những phản ứng quan trọng về sinh học và môi trường Trong vùng rễ của khu đấtngập nước, nơi có sự giao nhau đặc trưng giữa hiện diện oxygen và yếm khí, những vikhuẩn hiếu khí và kỵ khí bắt buộc phải hoạt động gần nhau, qua đó tạo điều kiện cho sựtuần hoàn vật chất
Các vùng đất ngập nước nội địa như U Minh, Đồng Tháp Mười và các hệ thốngsông suối, hồ là những nơi chứa đựng nhiều loài động vật, thực vật đặc hữu hoặc nhữngloài có tầm quan trọng về đa dạng sinh học toàn cầu Tuy nhiên, hiện nay, các nghiêncứu về cộng đồng vi khuẩn trên các vùng đất ngập nước này chưa được ghi nhận nhiều,
Trang 35nhằm phục vụ con người, và đồng thời nhằm bảo tồn nguồn gen quý hiếm là vô cùngcần thiết
2.4 Một số cơ chế kiểm soát bệnh thực vật của các dòng vi khuẩn từ đất
Các dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng và kiểm soát bệnh có tiềm năng rất lớnvào việc phát triển các hệ thống nông nghiệp bền vững Chúng thực hiện theo ba cách
khác nhau: (i) Tổng hợp các hợp chất đặc biệt cho cây trồng; (ii) Tạo thuận lợi cho việc hấp thu một số chất dinh dưỡng từ đất; (iii) Ngăn ngừa bệnh cây (Kumar and Dubey,
2012) Nhìn chung, cơ chế gián tiếp liên quan đến khả năng giảm các tác động có hại docác sinh vật gây bệnh trên cây trồng Các dòng BCA gián tiếp giúp kích thích sinh trưởngcây trồng thông qua sự ức chế các mầm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau, chẳng hạnnhư khả năng tổng hợp siderophores cạnh tranh nguồn sắt với các tác nhân gây bệnh
(Pandey et al, 2005), khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa chống nấm và vi khuẩn như kháng sinh (Kang et al., 2004), sự biểu hiện của các enzyme phân giải tế bào nấm
β – 1, 3 – glucanase, cellulase, chitinase, trên cả nấm và vi khuẩn như Protease (Szekeres
et al., 2004) và khả năng tổng hợp hydro cynide (Senthilkumar et al., 2009), những chất
này ức chế sự phát triển của các dòng vi sinh vật gây bệnh Do đó, các dòng BCA đãthành công trong việc cạnh tranh với các mầm bệnh về chất dinh dưỡng và không giansống
2.5 Các nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh đốm lá do Xanthomonas sp trên hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt
2.5.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng
Bệnh đốm vi khuẩn trên hoa hồng (Rosa sp.) đã được ghi nhận ở các bang miền nam Hoa Kỳ như Florida và Texas, trong đó các dòng thuộc chi Xanthomonas đã được
phân lập và cho thấy có khả năng gây bệnh Phân tích trình tự Multilocus và trình tựrRNA 16S cùng với cấu hình axit béo ghi nhận các dòng gây bệnh trên hoa hồng này rất
giống với X alfalfae subsp citrumelonis Kết quả nghiên cứu này được Huang et al.
(2013) tiến hành Nhóm tác giả tiến hành khảo sát trên các cây hoa hồng tại Bang Texas
và Florida trong khoảng thời gian giữa năm 2004 đến 2010 Mười dòng vi khuẩn đạidiện được thu thập và được sử dụng để xác định vị trí phân loại Các dòng này được lâybệnh nhân tạo, ghi nhận các tổn thương qua những vết ngấm nước, sau đó tiếp tục pháttriển thành những đốm hoại tử và vết cháy lá trên phần lớn các cây chủ Sự khác biệt về
kiểu hình này có thể được liên kết với tính đa dạng di truyền (Huang et al., 2013).
Trang 36Hình 2.4: Những triệu chứng của bệnh đốm lá vi khuẩn trên Rosa RADtko (tráit) and
RADrazz (phải) tại Hoa Kỳ (Huang et al., 2013).
Nhóm tác giả đã sử dụng một số phương pháp như phân tích axit béo (Fatty acidmethyl ester analysis), trình tự gen rRNA trong việc định danh, phân loại các dòng vikhuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng Kết quả đã xác nhận rằng các dòng vi khuẩn
gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng là thành viên của chi Xanthomonas (Huang et al.,
2013)
Ngoài ra, nhóm còn sử dụng kỹ thuật phân tích phát sinh loài dựa vào kết quả phântích và đánh dấu trình tự đa locus (MLSA) nhằm mô tả thêm các dòng vi khuẩn gây
bệnh trên hoa hồng Trình tự không liên tục của các gen fusA, gapA, gltA, gyrB, lacF,
và lepA của các dòng vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas đã được tải xuống từ PAMDB.org (Almeida et al., 2010) được sử dụng cho các phân tích so sánh với các
trình tự của các dòng vi khuẩn gây bệnh trong nghiên cứu này Tiến hành phương phápMLSA (phương pháp phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự của các locus nhiễm
sắc thể khác nhau giữa các sinh vật có quan hệ gần gũi) dựa trên các gen fusA (translation elongation factor G gene), gap1 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene), gltA (citrate synthase gene), gyrB (DNA gyrase subunit B gene), lacF (ABC transporter sugar permease gene), và lepA (GTP binding protein gene) Việc phân tích được thực
hiện bằng cách sử dụng phần mềm Clustal X phiên bản 2.0.6 và điều chỉnh (bằng mắt)bằng cách sử dụng phiên bản Se-Al 2.0a10 Trước khi phân tích phát sinh loài, sự đadạng trình tự, bao gồm số lượng các kiểu haplotype, số lượng các vị trí đa hình(polymorphic) và đa dạng nucleotide (nuclear diversity) được xác định trong tất cả các
dòng gây bệnh trên hoa hồng thuộc chi Xanthomonas bằng cách sử dụng phần mềm
DnaSP phiên bản 5 Phân tích chi tiết cây phát sinh loài được tiến hành bằng phần mềmMEGA 5
Kết quả ghi nhận những dòng vi khuẩn này ít có sự biến đổi di truyền đáng kể, chỉ
Trang 37theo quyết định danh pháp được mô tả trước đây Các dòng vi khuẩn gây bệnh trên câyhoa hồng có ít đa dạng di truyền vì chúng hiện diện chỉ có hai haplotype và hiển thị 25
vị trí đa hình (polymorphic) chỉ trong trình tự gapA 25 đột biến trong gapA có lẽ được
tạo ra được do sự tái tổ hợp từ dòng khác Phân tích trên các dòng gây bệnh trên hoa
hồng trong loài X axonopodis phân nhóm 9.2 (phân nhóm này bao gồm hơn 50 mầm bệnh) xác định cùng với X alfalfae, X euvesicatoria, và X perforans dựa trên các phát sinh loài gyrB Các thành viên của phân nhóm được xem là gây bệnh cho một loạt các chi thực vật khác Trong đó, các mầm bệnh (rosa) trên cây hoa hồng này là loài gây hại
nghiêm trọng trên hoa hồng Những phát hiện này cho thấy đặc điểm cây chủ cụ thể, hỗtrợ các cho đặt danh pháp cho các mầm bệnh này
Trong 10 dòng vi khuẩn này, các dòng R07, R09, HDRA, X1808, X1811, X1847,X1850, Tx11 và Tx12 chia sẻ cùng kiểu haplotype, dòng HDRB là một mẫu haplotype
độc nhất Hai haplotypes khác nhau bởi 25 nucleotide (nt) trong chuỗi 444-nt gapA, với
giá trị về đa dạng nucleotide đạt 0.01126 Mười dòng vi khuẩn gây bệnh trên hoa hồngnày tạo thành hai nhánh nhỏ trong phân nhóm 9.2 dựa trên các kết quả phân tích
“maximum parsimony”, nhưng kết quả phân tích xác suất sau Bayesian của 2 nhánh nàychưa ổn định Các giá trị khởi động đối với nhóm 9,2 là 55 và 65%, nhưng phân tích xácsuất sau Bayesian là 100% cho phân lớp, giúp phân lớp trở nên đáng tin cậy Các dòng
vi khuẩn này đã được phân tích phát sinh loài cho thấy có quan hệ gần với X alfalfae subsp citrumelonis, X alfalfae subsp alfalfae, và X perforans của phân lớp 9,2 hơn so với các dòng Xanthomonas spp khác Giá trị tương đồng trong nội bộ dòng vi khuẩn
gây bệnh trên hoa hồng là 99,1% Các giá trị tương tự cho các dòng còn lại thuộc phân
lớp 9,2 là 98,3 đến 99,7%, với giá trị thấp nhất giữa hoa hồng và HDRB với X alfalfae subsp alfalfae Nhìn chung, các dòng vi khuẩn gây bệnh trên hoa hồng này có giá trị tương đồng cao nhất (98,8 đến 99,7%) với phân họ X alfalfae subsp citrumelonis Nhìn
chung, kết quả MLSA và lây bệnh nhân tạo cho thấy rằng đây là một mầm bệnh mới
(Xanthomonas sp pv rosa) thuộc chi Xanthomonas là tác nhân gây đốm lá vi khuẩn
trên hoa hồng Mặc dù mầm bệnh này có mức độ tương đồng cao về trình tự DNA với
các thành viên khác của X axonopodis phân nhóm 9.2, nó hiển thị một kiểu hình độc
khác biệt với các mầm bệnh khác tương tự của các phân nhóm được sử dụng trongnghiên cứu này
Trang 38Hình 2.5: Sự phát sinh loài của các dòng rosa của chi Xanthomonas dựa trên các dữ liệu kết nối của các đoạn gen fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF, và lepA (Huang et al., 2013) Phát sinh loài của những dòng gây bệnh trên cây hoa hồng của Xanthomonas dựa trên bộ dữ liệu nối các đoạn của các gen fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF, và lepA Các trình tự các gen này thuộc Xanthomonas được tải về
từ PAMDB Số trên các nốt (node) đại diện cho các giá trị hỗ trợ bootstrap cho độ phân cực tối đa – maximum parsimony (phía trước), khả năng tối đa – maximum likelihood (trung bình) và xác suất sau Bayesian trình bày
Trang 39Trong một nghiên cứu gần đây, Barak et al (2016) đã so sánh toàn bộ trình tự bộ
gen của dòng GEV-Rose-07, một trong những dòng gây bệnh trên hoa hồng, với các
dòng Xanthomonas có liên quan chặt chẽ khác Dựa trên phân tích toàn bộ trình tự bộ
gen, GEV-Rose-07 có liên quan chặt chẽ với nhóm phân loại Rademaker 9.2, bao gồm
X euvesicatoria (Xe) 85-10, X perforans (Xp) 91-118, X euvesicatoria pv allii (Xea) CFBP 6369, X alfalfae subsp citrumelonis (Xac) F1, và X dieffenbachiae (Xd) LMG 12,749 (Rademaker et al., 2005) Với giá trị phân tích tương đồng nucleotide theo cặp lớn hơn 97% (> 97%) với X euvesicatoria, dòng GEV-Rose-07 được đề xuất là mầm bệnh thuộc loài X euvesicatoria; và thuộc phân loài rosa với tên đầy đủ là X euvesicatoria pv rosa (Xer) (Barak et al., 2016) Tên X euvesicatoria pv rose cũng được công nhận và sử dụng để nghiên cứu về vi khuẩn Xanthomonas gây bệnh hoa hồng (Fan et al., 2022).
2.5.2 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt
Myung et al (2009) đã tiến hành ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh đốm lá trên cây ớt trong
một nhà kính thương mại ở Jinju, Hàn Quốc vào năm 2014, kết quả cho thấy có tỷ lệmắc bệnh đốm lá là 35%, với các triệu chứng đốm lá điển hình trên cây con đã được ghi
nhận trên giống ớt ngọt (Capsicum annuum L.) Cụ thể như sau: Các triệu chứng gây
bệnh như: những đốm hoại tử tròn, bất thường, đen, với cạnh ngấm nước Các lá bị ảnhhưởng chuyển sang màu nâu sẫm và dễ dàng rụng đi Bảy dòng vi khuẩn được phân lập(BC3707 đến BC3713) đã được tái phân lập trên môi trường đậu nành trypticase(trypticase soy agar) từ các vị trí lá bệnh sau khi được khử trùng bề mặt trong cồn ethyl70% trong 20 giây
Đặc điểm hình thái đã được ghi nhận cho thấy các dòng vi khuẩn được phân lậpnày có Gram âm, roi chuyển động với một sợi cực duy nhất Trên môi trường peptonesucrose agar, khuẩn lạc có màu vàng và nhô lên với rìa mịn Đặc điểm sinh hóa được
kiểm tra dựa trên hướng dẫn phân biệt các loài thuộc chi Xanthomonas (Schaad et al., 2001) và chi Xanthomonas liên quan đến bệnh đốm vi khuẩn ở cà chua và ớt (Jones et al., 2004) Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn này có kết quả dương tính trong phản
ứng catalase, và âm tính đối với oxidase
Xác định tác nhân gây bệnh và khả năng gây bệnh được thực hiện bằng cách phunhuyền phù tế bào vi khuẩn chứa 107 CFU/ml lên cây ớt (C annuum) 3 tuần tuổi và cây giống cà chua 2 tuần tuổi (Solanum lycopersicun) trong nhà kính duy trì ở 27 ± 20C Cácdòng gây ra các triệu chứng tương tự như những biểu hiện bệnh ban đầu trên cây ớt
(Capsicum spp cv Wangdaebak) và ớt chuông (C spp var angulosum cv Red), và
làm lá ớt và lá cà chua rụng sau 1 tuần chủng mầm bệnh Không có triệu chứng nàođược ghi nhận trên cây đối chứng và cây cà chua khi phun bằng nước cất tiệt trùng
Trang 40Một nghiên cứu khác của Kyeon et al (2016) với 72 mẫu bệnh trên cây ớt trên
khắp Hàn Quốc được sử dụng để xác định tác nhân gây bệnh 3 kiểu hình của các mầmbệnh trên ớt tại Hàn Quốc được so sánh với các dòng BSX (bacterial spot – causing
Xanthomonas) tham khảo để định danh chính xác Ba đặc điểm chính được sử dụng để tách 4 loài BSX được dựa theo Jones et al (2004) Tất cả các mầm gây bệnh trên ớt ở
Hàn Quốc đều âm tính đối với hoạt tính pectolytic, và ngoại trừ 5 dòng, những dòng cònlại ghi nhận kết quả âm tính đối với hoạt tính amylolytic Những đặc điểm này giống hệt
như của X euvesicatoria và X gardneri Năm dòng được phân lập cho kết quả dương tính với hoạt tính amylolytic không thuộc các dòng của X euvesicatoria hoặc X perforans.
Hình 2.6: Các triệu chứng đốm vi khuẩn trên cây ớt và lá cà chua được chủng dòng vi
khuẩn CNUPBL 2039 (Kyeon et al., 2016)
A: Tổn thương trên lớp biểu bì mặt trên của lá ớt; B: Tổn thương trên lớp biểu bì mặt dưới lá ớt; C: Tổn thương trên lớp biểu bì mặt trên của lá cà chua; D: Tổn thương trên lớp biểu bì mặt dưới của lá cà chua.
Gần đây, Stoyanova et al (2014) lập luận rằng để tách thành phần loài của nhóm
BSX thì việc sử dụng một số đặc điểm kiểu sinh hóa như hoạt tính amylolytic và việc
sử dụng cis-aconitic acid là chưa đủ Bên cạnh đó, tất cả các mầm bệnh này trên ớt ở Hàn Quốc có một protein 32 kDa Đây là loại protein chỉ duy nhất có ở X euvesicatoria.
Nhằm đảm bảo xác định chính xác danh pháp của các dòng gây bệnh trên ớt được
thu thập, Kyeon et al (2016) đã tiến hành phân tích một số đặc điểm kiểu hình và kiểu
gen đã được sử dụng như: khả năng phân giải amylo (amylolytic activity), khả năngphân giải pecto (pectolytic activity), sự hiện diện vết protein độc nhất khi điện di trêngel sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE), Phân tích Restriction
fragment length polymorphism – RFLP dựa trên gen rpoB, Phân tích phát sinh loài với
16S rRNA và trình tự 3 gen houskeeping Cụ thể như sau:
Kết quả về phân tích 3 đặc điểm kiểu hình cho thấy tất cả các mầm bệnh trên ớt
này ở Hàn Quốc đều là X euvesicatoria Kết quả của RFLP dựa trên gen rpoB cho thấy rằng tất cả các mầm bệnh trên ớt này đều có vạch (band) trùng với mẫu của X.