Đề tài : Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc việt nam

Luận án tiến sĩ năm 2013 Đề tài: Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam MỞ ĐẦU Tetrodotoxin (TTX) là một độc tốsinh học cực mạnh được chiết xuất chủyếu từcá nóc độc, động vật biển và một sốchủng vi sinh vật. Trong những năm gần đây, TTX đã được nghiên cứu sửdụng làmthuốc gây tê, gây mê, . ởnhiều nước nhưCanada, Mỹ, Trung Quốc Ởnước ta, Dư Đình Động và cộng sựnghiên cứu thành công việc sửdụng TTX kết hợp với bài thuốc dân tộc cổtruyền đểlàm thuốc cai nghiện, đã được tiến hành thửnghiệmtrên các bệnh nhân cho kết quảkhảquan [9]. Những năm trước đây, để đáp ứng được nhu cầu của thịtrường, một sốnghiên cứu đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học. Tuy nhiên, giá thành của sản phẩmTTX tổng hợp hóa học cao, độtinh sạch thấp, không kinh tếbằng phương pháp tách chiết TTX trực tiếp từcá nóc độc. Vì vậy, TTX được tách chiết chủyếu từcá nóc độc hoặc động vật biển. Do hàmlượng TTX từcá nóc độc rất thấp (100kg trứng cá nóc độc mới táchchiết được 1g TTX) nên giá thành của TTX rất cao. Hơn nữa, trữlượng của các loài cá nóc độc ngày càng giảm,trong khi nhu cầu tiêu thụTTX lại ngày càng tăng [93]. Gần đây, các nghiên cứu thu nhận TTX từvi sinh vật đã mởra một triển vọng mới trong công nghệsinh học. Hướng nghiên cứu cho phép chủ động sản xuất TTX trong phòng thí nghiệm hoặc ởquy môcông nghiệp, độtinh sạch cao, giảm được giá thành, . Xuất phát từý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệnuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từmột sốchủng vi khuẩn phân lập từcá nóc độc Việt Nam”. * Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng được quy trình công nghệtừphân lập, nuôi cấy, tách chiết và xác định tính chất, độc tính TTX của vi khuẩn. * Nội dung nghiên cứu: - Phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật sản sinh TTX từcá nóc độc Việt Nam. - Xây dựng quy trình công nghệnuôi cấy vi khuẩn sinh TTX. - Xây dựng quy trình công nghệtáchchiết vàtinh sạch TTX từdịch nuôi cấy vi khuẩn. - Xác định tính chất và độc tính của TTX từdịch nuôi cấy vi khuẩn. * Những đóng góp mới của Luận án: Lần đầu tiên ởViệt Nam, nghiên cứu có hệthống vềTTX từvi khuẩn (từphân lập, nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và xác định tính chất của TTX từvi khuẩn). 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TETRODOTOXIN Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc sinh học, có hoạt tính sinh học cao, có bản chất phi protein, khó bịphá hủy bởi nhiệt; là một hợp chất hữu cơdịvòng, có cấu trúc lưỡng cực, có liênkết nội phân tửvới hemilactal và được phân loại nhưlà một hợp chất aminohydroquinazoline [23]. 1.1.1. Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt: 1. BộLao động-Thương binh và Xã hội (2012) Một năm tăng thêm gần khoảng 13.000 người nghiện ma túy. Báo Lao động, số210, 2012. 2. Đái Duy Ban (2009) Nghiên cứu sửdụng tetrodotoxin làm thuốc hỗtrợ điều trị các bệnh tim mạch, ung thư, nghiện ma túy, nghiện thuốc lá, nghiện rượu và HIV/AIDS. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 3. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972-1978) Một sốphương pháp nghiên cứu vi sinh vật.Tập 1, 2, 3. NXB Khoa học Kỹthuật, Hà Nội. 4. Nguyễn Hữu Hoàng (2002) Tinh chếTetrodotoxin và phân tích hàm lượng Tetrodotoxin từcá nóc bằng phương pháp khối phổ. Đại học Khoa học Tựnhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. 5. Lê Quang Huấn, Lê Xuân Tú (1994) Tách chiết và tinh chếTTX từmột sốloài cá nóc Tetrodontidae tại miền trung Việt nam. Tạp chí sinh học T.16 (3). 38-41. 6. Nguyễn Văn Lệ, Lê Xuân Tú, Bùi ThịThu Hiền, Shigeru SATO và CS (2006) Nghiên cứu độc tính cá Nóc và các giải pháp xửlý chếbiến, quản lý từkhâu khai thác đến khâu tiêu thụcá Nóc đảm bảo an toàn vệsinh thực phẩm. Báo cáo tổng kết đềtài nghiên cứu khoa học, BộThuỷsản. 7. ĐỗTuyết Nga và cộng sự(2002) Phân tích độc tốtrong cá nóc, cua biển và một số loài hải sản hai mảnh vỏ. Đềtài cấp cơsở. Viện Hải dương học Nha Trang. 8. Khuất Hữu Thanh (2006) CơsởDi truyền phân tửvà Kỹthuật gen. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹthuật, 2006. 9. Đào Cẩm Tú (2009) Căn cứkhoa học của thuốc cai nghiện Thiên Thanh Hoàn. Báo An ninh thếgiới số789 ra ngày 27/6/2009. 10. Nguyễn Doãn Ý (2009) Xửlý sốliệu thực nghiệm trong kỹthuật.Nhà xuất bản Khoa học và kỹthuật, 2009. 2. Tài liệu tiếng Anh: 11. Alfred E. B. (2001) Benson’s Microbiological Applications Lab Manual. Eighth Edition, The McGraw- Hill Companies Press. 12. Are Klevan (2004) Classification of bacteria using oligonucleotide microarray: an in silico experiment. Thesis for the degree of Siv.ing in Biotechnology. University of Oslo, Norway. 13. B.A. Venmathi Maran, Emi Iwamoto, Jun Okuda, Shuhei Matsuda, Shigeto Taniyama, Yasuo Shida, Manabu Asakawa, Susumu Ohtsuka, Toshihiro Nakai, Geoffrey 95 A. Boxshall (2007) Isolation and charaterization of bacteria from the panther puffer Takifugu pardalis with the emphasis on TTX. Toxincon. Vol 50, pp 779 – 790. 14. Bragadeeswaran S, Therasa D, Prabhu K, Kathiresan K (2010) Biomedical and pharmacological potential of tetrodotoxin-producing bacteria isolated from marine pufferfish Arothron hispidus (Muller, 1841). The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases. ISSN 1678-9199, 2010,Vol 16 (3), pp. 421-431. 15. Chen C. Y., Chou H. N. (1998) Detection of tetrodotoxinby high performance liquid chromatography in lined-moon shell and puffer fish. Acta Zoologica Taiwanica, 9 (1), pp. 41-48. 16. Deng Y, Fan Yan, Xue D elin, Liu Li, Hu Jiang chun, Wang Shujin (2008) Study on the Fermentation of Tetrodotoxin by Bacillus fusiforms N141. NatProd R es Dev 2008, Vol20, pp. 74-78. 17. D. Bryniok, Trösch W (1989) ELISA techniques for the determination of methanogenic bacteria. Applied Microbiology Biotechnology, vol 32, pp.235–242. 18. Do. H. K, K. Hamasaki, K. Ohwada, U. Simidu, T. Noguchi, Y. Shida, and K. Kogure (1993) Presence of Tetrodotoxin and Tetrodotoxin-Producing Bacteria in Freshwater Sediments. Appl. Environ. Microbiol., 59 (11), p. 3934-3937. 19. Duff H.J., Sheldon R.S and Cannon N.J (1988) Tetrodotoxin sodium channel specific anti arrhythamic activity. Cardio vascular Research. GBR. Vol 22, pp 800-807. 20. Elam K-S, Fuhrman F-A, Kim Y-H, Mosher H-S (1977). Neurotoxins from three species of California goby: Clevelandiaios, Acanthogobius flavimanus, and Gillichthys mirabilis. Toxicon, Vol 15, pp. 45–49. 21. Fuhrman, F. A. (1986) Tetrodotoxin, tarichatoxin, and chiriquitoxin: Historical Perspectives.Tetrodotoxin, saxitoxin, and the molecular biology of the sodium channel. New York Academy of Sciences, Vol 479. 22. Gabor, E.M., de Vries, E.J., Janssen, D.B. (2003) Efficient recovery of environmental DNA for expression cloning by indirect extraction methods.FEMS Microbiology Ecology 44, 153–163. 23. Goto T., Takahashi S., Kishi Y. and Hirata Y. (1965) Tetrodotoxin. Tetrahedron. 21, pp 2059-2088. 24. Goto.T, Takahashi.S., Kishi Y and Hirata Y. (1964) An extraction and purification of tetrodotoxin. J.Chem.Jan. 85, 508. 25. Guimei Yang, Jilin Xu, Shenghua Liang, Daming Ren, Xiaojun Yan, Baolong Bao (2010) A novel TTX-producing Aeromonas isolated from the ovary of Takifugu obscurus. Toxicon 56 (2010), pp. 324-329. 26. Hashimoto Y. (1979). In Marine Toxins and Other Bioactive Metabolites.Japan Scientific Societies Press: Tokyo, Japan, pp. 298–302.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Bùi Thị Thu Hiền

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN

LẬP TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Bùi Thị Thu Hiền

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN TETRODOTOXIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố

Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2013

Nghiên cứu sinh

Bùi Thị Thu Hiền

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành Luận án này, tôi đã nhận được

sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của hai người thầy đáng kính là PGS.TS Khuất Hữu Thanh - Đại học Bách Khoa Hà Nội, GS.TS Phạm Quốc Long - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới hai thầy

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN đã giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trau dồi kiến thức chuyên môn và cuộc sống

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Shigeru SATO - Đại học Kitasato, Nhật Bản đã truyền đạt cho tôi kiến thức và quy trình công nghệ tách chiết, tinh sạch độc tố Tetrodotoxin; TS Đào Thị Lương, TS Trịnh Thành Trung -Viện Vi sinh và Công nghệ Sinh học, ĐHQGHN; KS Hoàng Thị Oanh, ThS Nguyễn Hữu Hoàng, ThS Bùi Trọng Tâm, ThS Phạm Thị Điềm -Viện Nghiên cứu Hải sản đã cùng tôi thực hiện một

số nội dung của Luận án này

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản, Lãnh đạo Phòng, các anh chị em trong Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sau thu hoạch, Công nghệ Sinh học Biển đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bố mẹ, chồng, con

và các anh chị em, bạn bè đã thực sự động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Hà Nội, ngày 03 tháng 03 năm 2013

Nghiên cứu sinh

Bùi Thị Thu Hiền

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Nội dung viết tắt

2 Anhy-TTX Anhydro Tetrodotoxin (dẫn xuất anhydro của TTX)

5 C-NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân cacbon 13)

11 Epi-TTX Epi-Tetrodotoxin (dẫn xuất epi của TTX)

12 FLD Fluorescence Detector- Detecto huỳnh quang

13 FISH Flourescent in situ hybridization (Kỹ thuật lai phân tử đánh

dấu huỳnh quang)

14 1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy (Phổ học

tương quan giữa 2 vị trí H)

15 HMBC Hetero nuclear Multiple Bond Connectivity (Tương tác giữa

hidro với cacbon bên cạnh)

16 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân proton)

17 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc k ý lỏng cao áp)

23 LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc k ý khối phổ)

24 LC-MS/MS Liquid chromatography–mass spectrometry/mass spectrometry

(Sắc k ý khối phổ/khối phổ)

25 MB Marine Broth

26 MSD Mass Spectrum Detector (Detecto phổ khối lượng)

28 NOESY Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy (Phổ trao đổi

hiệu ứng Overhauser hạt nhân)

32 OD Optical Density (Mật độ quang)

33 ORI Ocean Research Institute medium

35 TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

37 TTXs Tetrodotoxin và các dẫn xuất

38 TTX-s Na+ Kênh điện thế Na+ nhạy cảm TTX

39 TTX-r Na+ Kênh điện thế Na+ kháng TTX

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 TETRODOTOXIN 2

1.1.1 Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX 2

1.1.2 Đặc tính của TTX 4

1.1.3 Cơ chế gây độc của TTX 5

1.1.4 Ứng dụng của TTX 7

1.2 NGUỒN THU NHẬN TTX 9

1.2.1 TTX từ động vật biển 9

1.2.2 TTX từ vi sinh vật biển 15

1.3 CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ CÁ NÓC 20

1.3.1 Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học 20

1.3.2 Tách chiết và tinh sạch TTX từ cá nóc 21

1.4 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH TTX TỪ VI SINH VẬT 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Đối tượng 26

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 26

2.1.3 Hóa chất và môi trường nghiên cứu 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Phương pháp xác định độc tố của 3 loài cá nóc độc bằng HPLC 28

2.2.2 Phương pháp phân tích, xác định tính chất của TTX từ cá nóc Việt Nam làm tiền đề kiểm chứng tính chất TTX từ vi sinh vật 28

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh TTX 29

2.2.4 Phương pháp phân loại các chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh TTX 30

2.2.5 Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy vi khuẩn sản sinh TTX 33

2.2.6 Tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh TTX theo đường dốc của Box-Wilson 34

2.2.7 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi vi khuẩn 36

2.2.8 Phương pháp phân tích xác định độc tính của TTX từ vi sinh vật 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐỘC TỐ TTX CỦA CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM 41

3.1.1 Lựa chọn mẫu vật để phân lập vi sinh vật từ cá nóc độc 41

3.1.2 Nghiên cứu xác định tính chất TTX từ mẫu cá nóc độc Việt Nam 43

3.2 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SẢN SINH TTX TỪ CÁ NÓC ĐỘC VIỆT NAM 48

3.2.1 Phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật từ 3 loài cá nóc độc 48

3.2.2 Lựa chọn các chủng vi khuẩn sinh TTX từ các loại mô khác nhau của cá nóc độc49 3.2.3 Nghiên cứu khả năng sinh TTX của các chủng vi sinh vật thu được 51

3.2.3 Phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX 52

3.3 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VI KHUẨN SẢN SINH TTX 59

3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 59

3.3.2 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy 61

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 63

3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 64

3.3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung mô trứng cá nóc độc vào môi trường nuôi cấy 64

3.3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 65

3.3.7 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy thích hợp 66

3.4 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG M37 SẢN SINH TTX 67

3.4.1 Chọn miền khảo sát 67

3.4.2 Thiết lập mô hình 69

3.4.3 Tối ưu hóa khả năng sinh độc tố TTX của chủng M37 theo phương pháp lên dốc của Box-Wilson 72

3.4.4 Kiểm định mô hình tối ưu khả năng sinh TTX của chủng M37 bằng thực nghiệm 73 3.5 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ DỊCH NUÔI VI KHUẨN M37 76

3.5.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết TTX ngoại bào từ dịch nuôi vi khuẩn M37 76

3.5.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tinh sạch TTX từ dịch độc tố thô chứa TTX tách chiết từ dịch nuôi vi khuẩn 77

3.6 KIỂM TRA CHẾ PHẨM TTX TỪ VI SINH VẬT 89

3.6.1 Kiểm tra chế phẩm TTX từ vi sinh vật 89

3.6.2 Thử nghiệm độc tính cấp của TTX thu nhận từ dịch nuôi chủng vi khuẩn M37 90

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92

1 KẾT LUẬN 92

2 KIẾN NGHỊ 92

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

PHỤ LỤC 102

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vi khuẩn sinh TTX phân lập từ một số loài sinh vật biển 16

Bảng 3.1 Hàm lượng độc tố TTX trong các mô của cá thể cái ở 3 loài cá nóc độc Việt Nam 41

Bảng 3.2 Hàm lượng độc tố TTX trong các mô của cá thể đực ở 3 loài cá nóc độc Việt Nam 42

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1 H và 13 C NMR cùng các tương tác xa H-C của TTX 47

Bảng 3.4 Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập trên 4 loại môi trường từ 3 loài cá nóc 48

Bảng 3.5 Số lượng vi sinh vật phân lập từ 4 mô của 3 loài cá nóc độc 49

Bảng 3.6 Số lượng các chủng vi sinh vật sinh TTX phân lập từ 4 mô của 3 loài cá nóc độc 50

Bảng 3.7 Kết quả phân tích định lượng hàm lượng TTX có trong dịch nuôi cấy của 24 chủng 51

Bảng 3.8 Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn sản sinh TTX hàm lượng cao 52

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp TTX 60 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh TTX 61

Bảng 3.11 Hàm lượng TTX của dịch nuôi cấy trong điều kiện chỉnh pH ban đầu và chỉnh pH trong quá trình nuôi 62

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của đệm điều chỉnh pH môi trường đến khả năng sinh TTX 63

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh TTX 63

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh TTX 64

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ mô trứng cá nóc độc bổ sung vào môi trường nuôi cấy 65

Bảng 3.16 Sinh trưởng của chủng vi khuẩn M37 trong quá trình lên men ở các tỷ lệ cấp giống khác nhau 66

Bảng 3.17 Sinh trưởng và sinh tổng hợp TTX của chủng M37 trong quá trình lên men ở các tốc độ khuấy khác nhau 67

Bảng 3.18 Mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm (TN) 68

Bảng 3.19 Bảng ma trận thực nghiệm với biến X 69

Bảng 3.20 Ma trận thực nghiệm ở tâm phương án 70

Bảng 3.21 Ước lượng tính ý nghĩa các hệ số theo tiêu chuẩn Student 71

Bảng 3.22 Bảng tối ưu hóa theo đường dốc của Box - Wilson 73

Bảng 3.23 Thử nghiệm lên men sinh tổng TTX 74

Bảng 3.24 Kết quả phân tích TTX trên HPLC của các mẫu tách chiết ngoại bào với các

tỷ lệ % axit axetic khác nhau so với thể tích dịch nổi 76

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của các thành phần dịch giải hấp đến việc thu hồi độc tố TTX 78

Bảng 3.26 Kết quả phân tích định tính và định lượng các phân đoạn giải hấp theo tỷ lệ than hoạt tính/mẫu độc tố thô 79

Bảng 3.27 Kết quả định tính TTX từ phần dịch rửa than hoạt tính của các thí nghiệm 80

Bảng 3.28 Kết quả định tính và định lượng TTX với các thí nghiệm thay đổi tốc độ dòng chảy qua cột sắc ký 82 Bảng 3.29 Kết quả phân tích hàm lượng TTX của dịch giải hấp từ than hoạt tính 83 Bảng 3.30 Kết quả phân tích TTX có trong dịch giải hấp với các mẫu ở pH khác nhau 83 Bảng 3.31 Định lượng TTXs có trong dịch giải hấp ở nồng độ axit axetic khác nhau 84 Bảng 3.32 Kết quả định lượng các phân đoạn dịch giải hấp khi tiến hành tinh sạch trên cột sắc ký theo tỷ lệ gel Bio-gel P2/mẫu khác nhau 85 Bảng 3.33 Kết quả phân tích hàm lượng TTX sau khi tinh sạch bằng sắc ký Bio-gel P2 85 Bảng 3.34 Hàm lượng TTX trong các phân đoạn chứa độc từ cột Bio-Rex 70 (H + ) 86 Bảng 3.35 Tỷ lệ chuột chết ở các lô chuột 90

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của TTX 2

Hình 1.2 Cấu trúc dạng Hemilactal của họ TTX 3

Hình 1.3 Cấu trúc dạng lacton của họ TTX 3

Hình 1.4 Hai dạng tautome của Tetrodotoxin 3

Hình 1.5 Cấu trúc dạng 4,9-anhydro của họ TTX 4

Hình 1.6 Sự khác biệt về cấu trúc của nhóm độc tố TTX 5

Hình 1.7 Màng với các kênh ion và ion natri đã bị hydrat hóa và TTX 6

Hình 1.8 Một số loài cá nóc biển chứa độc tố Tetrodotoxin 10

Hình 1.9 Một số động vật biển khác chứa Tetrodotoxin 11

Hình 1.10 Một số động vật trên cạn chứa Tetrodotoxin 11

Hình 1.11 Cá nóc vằn Takifugu oblongus [6] 13

Hình 1.12 Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus [6] 14

Hình 1.13 Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris [6] 15

Hình 2.1 Buồng trứng của cá nóc Torquigener pallimaculatus trong mùa sinh sản 26

Hình 2.2 Phân tích TTX trên hệ thống HPLC 28

Hình 3.1 Sắc kí đồ của TTX từ cá nóc 44

Hình 3.2 Sắc kí đồ của TTX chuẩn 44

Hình 3.3 Phổ khối lượng của TTX 45

Hình 3.4 Phổ 13 C-NMR của TTX 45

Hình 3.5 Phổ 1 H-NMR của TTX 46

Hình 3.6 Phổ COSY của TTX 46

Hình 3.7 Phổ HMBC của TTX 46

Hình 3.8 Cấu trúc TTX ở dạng Hemilactal 48

Hình 3.9 Tỷ lệ % các chủng vi sinh vật phân lập được từ 3 loài cá nóc độc đã lựa chọn 49 Hình 3.10 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M3& M28 53

Hình 3.11 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M6 54

Hình 3.12 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M8 54

Hình 3.13 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M10 55

Hình 3.14 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M19 56

Hình 3.15 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M30 57

Hình 3.16 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M37 57

Hình 3.17 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào chủng M43 58

Hình 3.18 Phổ khối của TTX tách từ cá nóc độc 89

Hình 3.19 Phổ khối của TTX tách chiết từ vi sinh vật 89

Hình 3.20 Phương trình tương quan tỷ lệ chuột chết với liều uống TTX 91

MỞ ĐẦU

Tetrodotoxin (TTX) là một độc tố sinh học cực mạnh được chiết xuất chủ yếu từ cá nóc độc, động vật biển và một số chủng vi sinh vật Trong những năm gần đây, TTX đã được nghiên cứu sử dụng làm thuốc gây tê, gây mê, ở nhiều nước như Canada, Mỹ, Trung Quốc Ở nước ta, Dư Đình Động và cộng sự nghiên cứu thành công việc sử dụng TTX kết hợp với bài thuốc dân tộc cổ truyền để làm thuốc cai nghiện, đã được tiến hành thử nghiệm trên các bệnh nhân cho kết quả khả quan [9]

Những năm trước đây, để đáp ứng được nhu cầu của thị trường, một số nghiên cứu

đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học Tuy nhiên, giá thành của sản phẩm TTX tổng hợp hóa học cao, độ tinh sạch thấp, không kinh tế bằng phương pháp tách chiết TTX trực tiếp từ cá nóc độc Vì vậy, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc độc hoặc động vật biển Do hàm lượng TTX từ cá nóc độc rất thấp (100kg trứng cá nóc độc mới tách chiết được 1g TTX) nên giá thành của TTX rất cao Hơn nữa, trữ lượng của các loài cá nóc độc ngày càng giảm, trong khi nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng [93]

Gần đây, các nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật đã mở ra một triển vọng mới trong công nghệ sinh học Hướng nghiên cứu cho phép chủ động sản xuất TTX trong phòng thí nghiệm hoặc ở quy mô công nghiệp, độ tinh sạch cao, giảm được giá thành, Xuất phát từ ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề

tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy và thu nhận Tetrodotoxin từ một số chủng vi khuẩn phân lập từ cá nóc độc Việt Nam”

* Mục tiêu nghiên cứu:

Xây dựng được quy trình công nghệ từ phân lập, nuôi cấy, tách chiết và xác định tính chất, độc tính TTX của vi khuẩn

* Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập và lựa chọn chủng vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc độc Việt Nam

- Xây dựng quy trình công nghệ nuôi cấy vi khuẩn sinh TTX

- Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn

- Xác định tính chất và độc tính của TTX từ dịch nuôi cấy vi khuẩn

* Những đóng góp mới của Luận án:

Lần đầu tiên ở Việt Nam, nghiên cứu có hệ thống về TTX từ vi khuẩn (từ phân lập, nuôi cấy, tách chiết, tinh sạch và xác định tính chất của TTX từ vi khuẩn)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TETRODOTOXIN

Tetrodotoxin (TTX) là một chất độc sinh học, có hoạt tính sinh học cao, có bản chất phi protein, khó bị phá hủy bởi nhiệt; là một hợp chất hữu cơ dị vòng, có cấu trúc lưỡng cực, có liên kết nội phân tử với hemilactal và được phân loại như là một hợp chất aminohydroquinazoline [23]

1.1.1 Công thức phân tử, cấu tạo hóa học của TTX

Tên tiếng Anh: Tetrodotoxin

Công thức phân tử : C11H17N3O8

Khối lượng phân tử: 319,28 g.mol−1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của TTX

Các dẫn xuất tạo ra từ TTX: anhydrotetrodotoxin, 4-epitetrodotoxin, epitetrodotoxin, nor-tetrodotoxin, quinazolin, axit tetrodoic,

6-TTX được tách chiết đầu tiên từ loài cá nóc Nhật Bản, sau đó được tìm thấy ở nhiều loài cá nóc và một số loài sinh vật khác Cấu trúc của TTX được xác định lần đầu tiên năm 1964 bởi Goto, Tsuda và Woodward [24, 74, 78]

Một số các nhà khoa học đã tiến hành tổng hợp TTX bằng con đường hóa học, nhưng sản phẩm thu được có chất lượng chưa ổn định, độ tinh sạch không cao Cùng với

sự phát triển của khoa học, các thiết bị phân tích hiện đại ra đời, các dẫn xuất của TTX đã lần lượt được xác định cấu trúc và mối tương quan giữa cấu trúc và độc tính của chúng [84]

Năm 1988, Yasumoto và cộng sự nghiên cứu cấu trúc của TTX tách chiết được từ

sa giông, cho thấy trên phổ NMR sự tồn tại ở 2 dạng tautome là hemilactal và lacton của TTX Giữa 2 dạng tautome này có sự chuyển hóa lẫn nhau (hình 1.4) Tỷ lệ giữa 2 tautome tùy thuộc vào cấu trúc của từng dẫn xuất TTX [90]

Hình 1.2 Cấu trúc dạng Hemilactal của họ TTX

Hình 1.3 Cấu trúc dạng lacton của họ TTX

Hình 1.4 Hai dạng tautome của Tetrodotoxin

Hình 1.5 Cấu trúc dạng 4,9-anhydro của họ TTX

TTX

1.1.2.1

bột màu trắng, có khối lượng phân tử

ản chất phi protein, không bị nhiệt phá huỷ, nấu chín hay phơi

un sôi (100oC) sau 6 giờ độc tính TTX bị giảm một nửa;

Muốn

ữu cơ, tan trong axit loãng, tan nhẹ trong nước

TTX k

Theo Yamashita M.Y, phương pháp phân tích TTX có hiệu quả hiện nay là sử dụng

sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có nối ghép detector huỳnh quang (FLD) hoặc detector

phổ khối lượng Công cụ đắc lực nhất trong xác định cấu trúc TTX là phổ cộng hưởng từ

hạt nhân… [82]

1.1.2 Đặc tính của

Tính chất hóa lý của TTX

a) Dạng tồn tại:

TTX tồn tại ở dạng tinh thể hoặc dạng

M=319,28 Da Ở trạng thái tự do TTX tồn tại dạng hydrat C11H17O8N3.1/2 H2O (M = 328,28) [2, 82]

b) Nhiệt độ nóng chảy:

Tetrodotoxin có b

khô, sấy, độc chất vẫn tồn tại Đ

phá hủy hoàn toàn độc tính TTX cần phải đun sôi ở 200oC trong 10 phút [1] TTX

không bị nóng chảy ở nhiệt độ 2000C, khi tăng nhiệt độ TTX chuyển sang màu sẫm

(khoảng 2200C trở lên) nhưng vẫn không bị nóng chảy [35; 82]

c) Độ hòa tan:

TTX không tan trong dung môi h

hông bền trong môi trường kiềm và môi trường axit mạnh Trong môi trường axit,

TTX chuyển thành hợp chất axit hydroclotetrodoic C11H17O8N3HCl; trong môi trường

kiềm, TTX chuyển thành hợp chất không no là axit anhydrotetrodoic C11H19O9N3 TTX thể hiện tính bazơ yếu pKa = 8,76 [82]

d) Hấp thụ ánh sáng:

TTX không hấp thụ ánh sáng hồng ngoại với λ=1690-2000 cm-1, không hấp thụ cực đại ở bước sóng trên 220 nm trong vùng tử ngoại [82]

1.1.2.2 Một số đồng phân phổ biến của TTX

TTX có rất nhiều đồng phân khác nhau, như: 4 epi-TTX, 6 epi-TTX, anhydro-TTX, deoxy-TTX, axit tetrodotoic, Hoạt tính sinh học của các đồng phân của TTX có sự khác nhau Trong hỗn hợp TTX tách chiết được thường gồm TTX và hai đồng phân epi-TTX và anhydro-TTX [74]

C9 cùng liên kết với một nhóm OH-, anhy-TTX lại có cấu trúc tại 2 vị trí đó gắn với nguyên tử O Anhy-TTX có độc tính kém hơn TTX [74, 102]

Hình 1.6 Sự khác biệt về cấu trúc của nhóm độc tố TTX

1.1.3 Cơ chế gây độc của TTX

truyền xung trong sợi thần kinh, xung bị kích thích và được dẫn truyền dọc theo sợi trục Thông

O

S ển những ion natri vào tế bào thần kinh là yếu tố cần thiết cho tính d

thường tế bào sợi trục thần kinh có nồng độ ion K+ cao, nồng độ Na+ thấp và có điện thế âm Sự kích thích có hiệu quả dẫn đến luồng ion Na+ từ ngoài màng tế bào đi vào

O

N H

N H O

H OH

O

NH2OH

O

N H

N H O

H

OH

O

NH2OH

H OH

H

OH

NH2O

H

OH

H OH+

10 97

1

3 4a

trong làm phát sinh điện thế hoạt động dương ở màng tế bào Sự khử cực lan truyền dọc theo dây thần kinh, dòng ion Na+ qua màng tế bào chiếm kênh ion Na+ (một kênh chọn lọc những ion natri hơn là những ion kali theo thứ tự cường độ), giúp dẫn truyền tín hiệu qua rron thần kinh [37]

Kênh Na+ được cấu tạo từ một chuỗi peptid đơn với bốn tiểu đơn vị lặp, mỗi đơn vị bao gồm 6 xoắn xuyên màng (hình 1.7) Các lỗ xuyên màng được tạo thành khi 4 tiểu đơn

vị cuộn gấp trong một bó, với tâm là lỗ xuyên màng [37]

Hình 1.7 Màng với các kênh ion và ion natri đã bị hydrat hóa và TTX

TTX gắn với vị trí lỗ mở của kênh ion bên ngoài tế bào, một vài phân tử TTX gắn với vị trí lỗ màng mở của kênh ion, tạm thời làm mất khả năng vận chuyển của kênh ion [47] Có hai loại kênh điện thế natri khác nhau trong tế bào của các mô con người: kênh điện thế Na+ nhạy cảm TTX (kênh TTX-s Na+) và kênh điện thế natri kháng TTX (kênh TTX-r Na+) TTX gắn với kênh TTX-s Na+ với một liên kết có ái lực 5-15 nanomolar, trong khi kênh TTX-r Na+ liên kết TTX với ái lực thấp micromolar Tế bào chứa những kênh TTX-r Na+ có chủ yếu là ở trong mô tim, trong khi những tế bào thần kinh chứa những kênh TTX-s Na+ chiếm ưu thế lúc nghỉ ngơi của con người Các kênh TTX-s bị bất hoạt nhiều hơn kênh TTX-r ở điện thế nghỉ Trong khi kênh vận chuyển ion natri của tế bào mô cơ có xu hướng đối kháng với TTX thì tế bào thần kinh lại rất nhạy cảm với TTX [65, 70]

Với một số lượng đủ lớn, TTX bám giữ lấy phức hợp kênh Na+, chiếm giữ những

vị trí nhận ở kênh Na+, ngăn không cho ion natri có cơ hội vào kênh cho đến khi nó khuếch tán chậ

c dụng của TTX, màng tế bào bị

n natri bị đóng, làm cho quá trình truyền thông tin cũng như

ị dừng lại TTX có tác dụng trực tiếp vào sợi trục của tế

m rồi ngừng hẳn, làm rối loạn hoạt động khử cực của màng tế bào thần kinh (thay đổi đột ngột điện thế màng), và tác động dọc theo dây thần kinh làm phong bế dẫn truyền các xung động thần kinh TTX phong bế chọn lọc lên các kênh vận chuyển ion natri do vậy ngăn chặn dẫn truyền tín hiệu trên các sợi thần kinh vận động và cảm giác dẫn đến liệt Thực tế TTX ngăn cản sự vận chuyển những ion natri vào bên trong màng tế bào thần kinh

ho kênh này không nhạy cảm với tetrodotoxin Đột biến điểm này

có lợi cho cá nóc, cho phép cá nóc k

u nhà khoa học đã nghiên cứu tìm hiểu, khai thác và

sử dụn

ển ion Na+

h vận chuyển này Điều này rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu sinh lý màng tế bào [28]

ần kinh cơ, rồi đến khớp nối của tế bào thần kinh và tác dụng vào trung tâm sợi cơ

Sự tiếp nhận cholinergic trên các hạch độc lập, tuyến thượng thận không bị tác động bởi TTX, chúng có phản ứng bình thường với acetylcholin khi có mặt TTX Điều này cho thấy trước tiên TTX tác dụng vào tế bào thần

inh cảm giác Khi sử dụng TTX ở nồng độ cao sẽ làm mất khả năng phản xạ của thần kinh đối với những kích thích mạnh Các kênh dẫn truyền của tế bào thần kinh chỉ bị ngăn cản ở nồng độ TTX cao hơn 1µM Ở các tế bào tim, tác dụng kìm hãm của TTX có hiệu quả khi tác dụng ở nồng độ thấp hơn tùy thuộc vào con đường đưa TTX vào tế bào Đối với tế bào thần kinh của vỏ não trong môi trường nuôi cấ

ngừng hoạt động ở ngay nồng độ thấp h

Nếu tetrodotoxin là một độc tố mạnh, tại sao lại không gây độc cho vật chủ? Các nghiên cứu cho thấy, kênh vận chuyển Na+ trong vật chủ có cấu tạo khác với những động vật khác, ở vật chủ kênh Na+ không nhạy cảm với độc tố TTX Điều đó được chứng minh

ở một trong các loài cá nóc: gen mã hóa protein của kênh ion natri bị đột biến làm thay đổi trình tự axit amin làm c

ết hợp chặt chẽ với vi sinh vật cộng sinh, sử dụng độc

tố do vi sinh vật sinh ra vào mục đích phòng vệ [77, 81]

1.1.4 Ứng dụng của TTX

Trong những năm gần đây, nhiề

g các chất có hoạt tính sinh học cao từ sinh vật biển như: prolactin, oxytoxin, progesteron, estrion, các axit amin, aldosteron, và đặc biệt là các chất độc sinh học (biotoxin) phục vụ nền kinh tế quốc dân

TTX là một trong số các chất độc sinh học có hoạt tính sinh học cao (là chất độc thần kinh rất mạnh), không chỉ được sử dụng trong khoa học để nghiên cứu sự vận chuy

qua màng tế bào, mà còn được sử dụng để điều chế thuốc gây tê, gây mê và thuốc kích thích sự hoạt động của hệ tuần hoàn, điều trị một số bệnh hiểm nghèo như các bệnh

về tim mạch, ung thư, HIV-AIDS, làm thuốc cai nghiện

Thứ hai, TTX làm giảm tính thấm của màng tế bào đối với việc vận chuyển ion Na+

mà không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển ion K+, trong khi đó các thuốc gây tê khác lại có tác dụng đối với cả 2 kên

Thứ ba, TTX được dùng để điều chế thuốc gây tê, gây mê trong phẫu thuật Ngoài những tác dụng gây tê giống thuốc: novocain, procain, cocain, TTX có nhiều ưu điểm hơn

ở khả năng gây tê tại chỗ và tác dụng mạnh hơn nhiều so với thuốc gây tê khác Ví dụ: để kìm hãm hoạt động của hệ thần kinh bằng cocain phải cần đến nồng độ 500mg, trong khi

đó TTX chỉ cần 0,03mg (hiệu quả tác dụng của TTX mạnh gấp 60.000 lần cocain) [33]

Thứ tư, TTX còn được dùng như thuốc giảm đau, khi sử dụng TTX với liều lượng rất nhỏ có khả năng cắt cơn đau của những bệnh nhân ung thư gan ở giai đoạn cuối Công

đã sử dụng TTX để chế ra Tectin (thuốc giảm đau), T

ả khả quan Theo các chuyên gia, các

ty International Wex Technologies (Canada)

ocudin (thuốc gây tê), và Tetrodin (thuốc cai nghiện ma túy) - một vài loại thuốc giúp bệnh nhân ung thư vượt qua được những cơn đau hoặc giúp con nghiện heroin cắt cơn Các thử nghiệm ban đầu khi sử dụng thuốc cho kết qu

thuốc này có thể ngăn chặn tế bào thần kinh chuyển tín hiệu đau đến não, chúng khác với các thuốc giảm đau khác ở chỗ nó không gây ra tác dụng phụ như morphin, không xung đột với các loại thuốc khác và cũng không gây nghiện [71]

Ở Việt Nam đã nghiên cứu thành công biệt dược Thiên Thanh Hoàn sử dụng cho cai nghiện ma tuý Mỗi viên nhộng Thiên Thanh Hoàn có chứa tối đa 0,1 miligam TTX và một số vị thuốc Đông y khác [9

Thứ năm, nghiên cứu của Lesort cho thấy TTX có khả năng liên kết với protein của

HIV, đặc biệt là gp-120, gp-120 là thụ thể hay móc bám của HIV gắn được vào thụ thể tế bào người, đặc biệt là những tế bào Lympho T có thụ thể CD4, từ đó hệ gen của HIV không được chuyển vào trong tế bào dẫn đến hệ gen của HIV không thể gắn được vào hệ gen của người và không làm tan tế bào người Vì vậy, người bị nhiễm HIV không thể phát triển thành AIDS được Đây chính là

thế kỷ HIV-AIDS [34]

1.1.4.2 Một số tác dụng có hại của TTX

TTX không chỉ có tác dụng có lợi, cũng như nhiều biệt dược khác, nếu sử dụng không đúng cách, đúng liều lượng hoặc đúng mục đích TTX sẽ trở thành độc dược, có tác hại khôn lường đến sức khoẻ con ngườ

Đối với hệ thần kinh của người và động vật, T

ng của sợi trục thần kinh dẫn đến sự thay đổi điện tích Na+ trên bề mặt của tế bào thần kinh, làm cho điện thế hoạt động của cơ bị ức chế và hệ thống thần kinh bị suy yếu Tùy vào liều lượng độc tố TTX nhiều hay ít mà gây ra hậu quả khác nhau, nhẹ thì gây cảm giác choáng váng, nôn mửa, co giật giữ dội, sau đó bất tỉnh vài ngày, nặng thì rối loạn hô hấp và gây tử vong [50, 59]

Khi tác dụng vào tế bào thần kinh, TTX giống như xung điện gây kích thích mạnh, làm hưng phấn quá mức dẫn đến ion Na+ được kích thích tạo ra với một lượng dư thừa trong tế bào Ion Na+ không được vận chuyển ra ngoài tế bào và tập trung nhiều ở phần đầu mút dây thần kinh, dẫn đến ảnh hưởng tới phản ứng truyền dẫn xung của tế bào thần kinh

cảm giác, đồng thời làm cho màng tế bào bị khử cực, làm đóng kênh vận chuyển ion, gây

ức chế hệ thống thần kinh [58]

Nhìn chung, tác dụng có lợi của TTX đối với con người khá rõ và nổi bật TTX đã và đang được sử dụng rộng rãi trong y dược, nhu cầu sử dụng TTX không chỉ ở Việt Nam mà trên thế giới cũng ngày càng tăng Hiện nay, lượng TTX được tách chiết, tinh chế từ động vật biển, đặc biệt là cá nóc còn ít Do vậy, hướng nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật

có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

1.1.4.3 Triển vọng ứng dụng TTX ở Việt Nam

TTX là thành phần quan trọng trong các liệu pháp cai nghiện, chữa ung thư, HIV hoặc sử dụng làm thuốc giảm đau Những nhóm liệu pháp này tạo ra nhu cầu sử dụng TTX rất lớn ở Việt Nam, đòi hỏi một nguồn cung cấp TTX dồi dào Theo thống kê 6 tháng đầu năm 2012 của Bộ Lao động – Thương binh và Xã hội Việt Nam, có 171.400 người nghiện

ma tuý đã được quản lý hồ sơ trong cả nước, con số thực tế khoảng hai lần số liệu thống

kê, nghĩa là có khoảng gần 350.000 người nghiện ma túy trong cả nước [1] Giả sử để cai nghiện cho số người nghiện này; mỗi người sử dụng 02 viên thuốc biệt dược Thiên Thanh Hoàn trong một ngày và quá trình điều trị kéo dài trong 10 ngày thì nhà sản xuất phải sử dụng ít nhất 650 gam TTX để phối trộn cùng một số vị thuốc Đông y Để sản xuất một lượng TTX như vậy, cần có ít nhất 65 tấn trứng cá nóc độc, hay khoảng 6.500 tấn cá nóc độc (trứng chiếm khoảng 5-10% trọng lượng cá nóc) [6, 9] Đây là vấn đề khó có thể thực hiện thành công ở nước ta

ng nghiên cứu sản xuất TTX từ vi sinh vật là hướng nghiên cứu đang được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu [6]

1.2 NGUỒN THU NHẬN TTX

1.2.1 TTX từ động vật biển

Trên thực tế, TTX có ở nhiều động vật khác nhau như: bạch tuộc đốm xanh, ếch, cua Xanthid, ốc biển, cá bống vân mây, cá nóc, nhuyễn thể, TTX được phát hiện đầu tiên vào năm 1950 từ trứ ủa loài cá nóc ở Nhật Bả và được gọi là spheroidine [ 1]

chung cho đến ngày nay

Trữ lượng cá nóc trên toàn vùng biển Việt Nam (theo ước tính năm 2005 là khoảng

37.387 tấn) Trong đó họ cá nóc Tetraodontidae chiếm khoảng 84,7% tổng trữ lượng Đây

là nguồn nguyên liệu tiềm tàng để tách chiết TTX Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này đang

bị chia sẻ bởi việc thu mua của các thương gia Trung Quốc và Hàn Quốc, trong khi Chính phủ Việt Nam vẫn chưa gỡ bỏ lệnh cấm khai thác, buôn bán, vận chuyển và chế biến cá nóc Bởi vậy, việc thu mua, xử lý và chiết xuất TTX từ một lượng lớn cá nóc 6.500 tấn là hầu như không thể thực hiện, xét về mặt kinh tế và xã hội Rõ ràng, bên cạnh nguồn nguyên liệu triển vọng là cá nóc, cần tìm kiếm những nguồn nguyên liệu khác để sản xuất TTX Hướ

độc tố spheroi i tên là TTX và được các nhà học dùng

Từ cuối những nă ừ c loài động vật khác nhau Trong một thời gian dài, nguồn gố

số loài sinh vật khác và chứng minh tarichatoxin chính là TTX [

Trishananda và cộng sự đã công bố 4 trường hợp bị ng độc thực phẩm do ăn phải trứ g

1976, TTX còn đượ

ở loài b

Hình 1.8 Một số loài cá nóc biển chứa độc tố Tetrodotoxin

Một số động vậ ển khác cũng chứa Tetrodotoxin gồm sao biển (Astropecten

scoparius), cua xanthid mắt đỏ (Eriphia.sp.), cua hình móng ngựa (Carcinos orpius

m 1960 trở đi, TTX được tách t nhiều nguồn khác nhau ở cá

c TTX là vấn đề còn nhiều bàn tarichatoxin từ sa giông và m

49] Năm 1966,

i Lan, điều này sau đó được k do trứng sam có chứ

c tìm thấy ở da ếch (Atelopus chiriquiensis) thuộc Costa Rica [31, 60],

Ốc tù và Sao biển

TTX tập trung nhiều ở trong gan, trứng, cơ quan sinh sản, ví dụ ở loài Spheroides

Fugu niphobles) TTX có trong gan (1000µg/g),

Sam

Hình 1.9 Một số động vật biển khác chứa Tetrodotoxin

Ngoài sinh vật biển, một số sinh vật trên cạn bao gồm ếch Harlequin (Atelopus

sp.), các loài sa giông thuộc chi Taricha (Taricha torosas, Taricha rirularis, T.granulosa)

và chi Diemictylus, các loài thuộc họ Salamandridae (Kì giông), loài chân bụng Gastropod

charonia saulinae cũng có chứa TTX [54, 87; 89]

Hai loài ếch Harlequin (Atelopus sp.) Sa giông Taricha granulosa

Hình 1.10 Một số động vật trên cạn chứa Tetrodotoxin

niphobles (cá nóc Takifugu niphobles hoặc

ứng (400µg/g), trong da (40µg/g) Tuy nhiên

thuộc vào loài, vào từng cơ quan, từng loại mô mà hàm lượng TTX còn ph

ưng nguồn thu TTX chủ yếu vẫn từ các loài

a, thông thường vào mùa sinh sản và đẻ trứng thì hàm lượng TTX là r

TTX có ở nhiều động vật khác nhau, nh

cá nóc biển độc Theo số liệu thống kê của Nguyễn Văn Lệ, trên thế giới có khoảng 246 loài cá nóc bao gồm cả cá nóc nước mặn và nước ngọt với sản lượng tương đối cao Ở Việt Nam có khoảng 60 loài cá nóc nhưng mới thu thập, mô tả, nhận dạng được 37 loài cá nóc nước mặn, trong đó có 7 loài độc mạnh, 10 loài độc ở một số mô, với trữ lượng khoảng

40.000 tấn Đây chính là lý do cá nóc biển độc được chọn là nguyên liệu thu nhận TTX ở nhiều quốc gia [6]

Mặc dù, cá nóc có trữ lượng lớn, phân bố rộng rãi khắp các vùng biển, nhưng nguồn nguyên liệu từ cá nóc vẫn phụ thuộc rất nhiều vào tự nhiên Không phải loài cá nóc

độc tố cao, không phải mùa nào, giai đoạn sinh trưởng nào cũng chứa độ

nhau Đây sẽ là một hướng nghiên cứu tương đối mới cả trên thế giới và ở Việt

1.2.1

:

ó ở hai bên bắp đuôi Trên cơ thể có đường bên và đường gờ ngăn cách mặt bên và mặt bụng Khe miệng thấp hơn rìa trên gốc vây ngực Trên đầu và lưng màu nâu với các chấm vàng nhạt lớn nhỏ không đều Hai bên đầu, lưng có nhiều vân màu nâu và màu vàng nhạt xen kẽ như da hổ Phía cuối lưng và trên bắp đuôi, các vân này có dạng hình chữ V nằm vắt ngang qua Vây ngực, vây đuôi có màu vàng tươi Mặt bụng màu trắng [6]

b) Đặc điểm sinh học:

Loài cá nóc vằn Takifugu oblongus có kích thước tương đối lớn, khoảng 15 – 25

ước ven bờ, cửa sông và bãi triều Đồng thời, cũng bắt gặp chúng ở các khu rừng ngập

c) Phân

ng Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Hàn Quốc [99]

nào cũng chứa hàm lượng

c tố [6] Do đó, việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu thay thế để có thể chủ động trong việc sản xuất TTX lại là vấn đề được nhiều nhà khoa học quan tâm hơn cả Đặc biệt, khi có nhiều nghiên cứu khẳng định TTX có nguồn gốc từ vi sinh vật sống cộng sinh với các động vật khác

Nam

.1 Cá nóc vằn Takifugu oblongus

Họ Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae

Tên địa phương: Cá nóc, cá nóc hổ, cá nóc trần, cá nóc bông

Tên tiếng Anh: Lattice blaasop

heo số liệu thống kê của Fishbase, loài cá nóc

ển Ấn Độ – Thái Bình Dương: Nam P

Malaysia, Philippin, Tru

Ở Việt Nam: Loài cá nóc vằn Takifugu oblongus thường gặp, phân bố ven bờ biển

từ Bắc vào Nam [6]

d) Tính độc: Theo kết quả phân tích độc tố cho thấy thịt, da, mật, tinh sào độc nhẹ Gan,

ruột độc mạnh; trứng độc rất mạnh [6]

Tên địa phương: Cá nóc chấm cam, cá nóc mít

Tên tiếng Anh: Rusty spotted toadfish

a) Đặc điểm hình thái:

Gai trên thân nhỏ, tương đối ngắn, nằm

Cá nóc Torquigener pallimaculatus có chiều dài t

cm, tối đa là 22 cm Loài này sống ở đáy, ven bờ và là loài

ố:

ố liệu thống kê của Fishbase, loài cá nóc độc Torquigener pallimaculatus

ng biển nhiệt đới và thường gặp ở vùng biển Tây Thái Bình Dương n

bắc Australia, ở quanh

Papua New Guinea [100]

Ở Việt Nam: Loài Torquigener pallimaculatus thường gặp ở vùng biển ven bờ

Trung bộ Vùng biển đông Nam bộ ít gặp hơn [6]

d) Tính độc: Theo kết quả phân tích độc tố cho thấy mật, tinh sào độc nhẹ; thịt, da độc

mạnh; còn gan, ruột, trứng độc rất mạnh [6]

Hình 1.12 Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus [6]

1.2.1.3 Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris

Họ Tetraodontidae, họ phụ Tetraodontinae

Tên địa phương: Cá nóc, cá nóc đầu thỏ mắt to, cá nóc vàng, cá nóc xanh

Thân hình trứng kéo thon dài phía sau Lưng và bụng có gai nhỏ Gai ở mặt lưng phân bố dạng hình bầu dục, bắt đầu từ đỉnh đầu kéo đến tận gốc vây lưng Mặt bụng thì gai phân bố từ cằm cho đến phía trước lỗ hậu môn Mỗi bên thân có một đường gờ ngăn cách mặt bên và mặt bụng Lưng và đầu có màu xám lục Vây hậu môn, mặt bụng và hai bên thân dọc gờ bụng màu trắng Vây ngực, vây lưng, nửa trên vây đuôi, phía dưới sau mắt và dọc hai bên của lưng thân đều có màu vàng tươi, nửa dưới của vây đuôi có màu xám nhạt

Lỗ mang màu trắng [6]

b) Đặc điểm sinh

Loài cá nóc độc Lagocephalus lunaris có chiều dài dao động từ 10 – 25 cm, tối đa

hiều dài 13 – 15 cm chiếm tỷ lệ cao trong sản lượng, chiều d

ài thành thục khoảng 25 cm Đây là loài cá dữ, ăn tạp, thường có tập tính sống đáy

ở cả vùng nước lợ và nước mặn ven bờ biển hay vùng cửa sông thuộc vùng nước nhiệt đới [6]

c) Phân bố:

Loài cá nóc độc Lagocephalus lunaris phân bố ở biển Đỏ, vịnh Petsit, Nam Phi, Sri

Lanca, Ấn Độ, Australia, Indonesia, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản ngoài ra còn phân bố dọc theo phía đông thềm lục địa Châu Âu đến phía tây Thái Bình Dương và ở vùng biển Nam Đại Tây Dương [98]

Ở Việt Nam: Loài cá nóc độc Lagocephalus lunaris khá thường gặp, phân bố khắp

vùng biển Việt Nam [6]

độc: Theo kết quả phân tích độc tố cho thấy da, mật độc nhẹ; nhưng thịt, gan, ruột,

tinh sào độc mạnh; còn trứng độc rất mạnh [6]

Hình 1.13 Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris [6]

1.2.2

ng TTX cho y dược đang ngày càng phổ biến (chủ yếu cho sản xuất thuốc) Những năm trước đây, TTX được tách chiết chủ yếu từ cá nóc hoặc động vật biển

Do hàm lượng TTX từ cá nóc không cao (1kg trứng cá nóc độc có thể tách chiết được 0,01

g TTX) nên giá thành của TTX rất cao Hơn nữa, trữ lượng của cá nóc cũng ngày càng giảm trong khi nhu cầu tiêu thụ TTX lại ngày càng tăng Để đáp ứng được nhu cầu của thị trường, một số nghiên cứu đã sinh tổng hợp TTX theo phương pháp hoá học, nhưng phương pháp này rất phức tạp, khó kiểm soát chất trung gian do phải tổng hợp qua 15 bước [32] Vì thế TTX tổng hợp hóa học có giá thành cao, không kinh tế bằng phương pháp tách chiết TTX trực tiếp từ cá nóc [61]

Năm 1981, Matsui Takashi và cộng sự, lần đầu tiên nuôi thử nghiệm loài cá nóc

không độc Takifugu rubripes có bổ sung thêm độc tố TTX vào thức ăn Kết quả nghiên

cứu cho thấy cá nóc thí nghiệm có độc tố TTX Kết quả nghiên cứu cho thấy TTX tích tụ trong cá nóc qua nguồn thức ăn [42]

Năm 1986, Noguchi và Yasumoto đã phân lập được một số chủng vi khuẩn sinh

TTX, gồm Vibrio sp và Pseudomonas sp từ ruột cua Xanthid và tảo biển, sau đó phân lập được từ da cá nóc độc Takifugu poecilonolus [56, 89] Những năm gần đây, hàng loạt các

công bố thu nhận TTX từ vi sinh vật đã mở ra một hướng nghiên cứu mới trong công nghệ sinh học và ứng dụng Thu nhận TTX từ vi sinh vật có thể chủ động sản xuất trong phòng thí nghiệm hoặc trong công nghiệp với số lượng lớn, có độ tinh sạch cao, giá thành giảm

Những loài vi khuẩn có khả năng sinh TTX được phân lập ở các loài sinh vật biển khác nhau (bảng 1.1)

TTX từ vi sinh vật biển

Xu hướng sử dụ

Bảng 1.1 Vi khuẩn sinh TTX phân lập từ một số loài sinh vật biển

floridus

[Noguchi T et al., 1986]

7 Shewanella putrefaciens Ruột cá nóc Takifugu niphobles [Matsui T et al.,

1989]

8 Alteromonas sp

Bacillus sp

Pseudomonas sp và Vibrio sp

Tuyến nước bọt bạch tuộc đốm

xanh (Octopus maculotus)

[Hwang D.F et al., 1989]

vernicularis radiatus

[Myoung-Ja Lee et al., 2000]

[Simon K.D et al., 2009]

14 Bacillus horikoshii Gan cá nóc Đài Loan [Yan Lu, Ruizao Yi

nghiên cứu phân lập các vi sinh vật sản sinh TTX từ cá nóc (Yasumoto, 1987; Matsui, 1989; Jun Wang, 2010)

Từ năm 1987-1995, để xác minh chính xác khả năng sản sinh TTX của một số chủng vi sinh vật, Simidu Usio, Matsui Takashi và Masaaki Kodama đã tiến hành nuôi cấy

thử nghiệm 15 chủng thuộc họ Vibrionaceae, 5 chủng thuộc giống Alteromonas và một chủng E.coli trên môi trường ORI, ở nhiệt độ 20oC trong 24-30 giờ Sau khi phân tích bằng

HPLC, nhóm tác giả này đã xác minh được 15 chủng thuộc họ Vibrionaceae có khả năng

sinh TTX và dẫn xuất TTX [40, 44, 68]

So với các động vật biển khác, hàm lượng TTX trong cá nóc cao hơn, sản lượng cá nóc trên thế giới tương đối nhiều Mặt khác, quá trình đánh bắt, thu mua cá nóc cũng dễ dàng hơn các loài sinh vật khác, do vậy nhiều nghiên cứu đã chọn cá nóc làm vật chủ để thực hiện quá trình phân lập, nuôi cấy vi sinh vật sản sinh TTX

Năm 1995-1996, Matsumura Kendo nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp

chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá nóc Fugu niphobles để thu nhận TTX

với hàm lượng cao Kết quả nghiên cứu đã thu được TTX hàm lượng tương đối cao là 27,2 MU/ml (tương đương 0,6mg/lít) [45, 46]

Năm 2007, B.A Venmathi Maran và cộng sự đã phân lập được hai chủng

Shewanella woodyi và Roseobacter sp từ một loài chân khớp sống ký sinh trên da cá nóc Takifugu pardalis Nghiên cứu của các tác giả cho thấy vi khuẩn sản sinh TTX với một

hàm lượng rất nhỏ, đòi hỏi tiếp tục hướng nghiên cứu, sàng lọc chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh TTX hàm lượng cao Đồng thời, cần phải tìm ra được các điều kiện tối ưu như nhiệt độ, pH, chế độ dinh dưỡng, thời gian nuôi để vi khuẩn đó tạo sinh khối theo ý muốn [13]

Yu Chung Him và cộng sự (2007) đã lên men riêng rẽ 2 chủng vi sinh vật

Microbacterium arabinogalactanolyticum, Serratia marcescens để tìm điều kiện thích hợp

cho quá trình sinh tổng hợp TTX Kết quả nghiên cứu cho thấy: Cả hai chủng vi sinh vật đều có thể sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí và kị khí không bắt buộc Nhưng lại sinh tổng hợp TTX mạnh ở điều kiện hiếu khí, nuôi lắc trên môi trường ORI có bổ sung thêm mô cá nóc độc [94]

Xiao-Jie Wang và cộng sự (2008) đã nuôi cấy thử nghiệm một số chủng vi sinh vật sinh TTX phân lập từ động vật biển chân bụng Kết quả phân lập trên môi trường ORI, môi trường TCBS thu được một số chủng vi khuẩn sinh độc tố TTX với hàm lượng khác nhau Chủng vi khuẩn sinh hàm lượng TTX thấp nhất là 5µg/g, chủng cao nhất là 184µg/g [79]

Trong cùng năm 2008, Peter Hoi-fu Yu và cộng sự (2008) đã sử dụng một số chủng

vi khuẩn Vibrio sinh TTX, nuôi trong các điều kiện thích hợp để thu sinh khối có hàm

lượng TTX cao Kết quả thật bất ngờ khi nhóm nghiên cứu cho rằng có thể thu được từ 0,5mg đến 1,5 mg TTX/1L dịch nuôi vi khuẩn nuôi trong 10 ngày Kết quả nghiên cứu cho thấy triển vọng cho một hướng đi mới cho ngành công nghiệp sản xuất TTX từ vi sinh vật phục vụ cho y dược [61]

Theo kết quả nghiên cứu của Simon và cộng sự (2009) cho rằng độc tố phân tích từ

dịch nuôi vi khuẩn của loài Shewanella sp., phân lập từ cá nóc sau khi nuôi ở nhiệt độ

250C, thời gian 10 ngày trên môi trường MB (Marine Broth), có độc tố có thể giết được chuột 20 gam trong vòng từ 5 đến 7 phút [69]

Năm 2009, Yan Lu và Ruizao YI đã phân lập được 23 chủng vi sinh vật từ gan cá

nóc Chỉ có chủng vi khuẩn Bacillus horikoshii có khả năng sinh TTX, dịch chiết có thể

giết chết chuột trong 3 phút [86]

Năm 2010, Bragadeeswaran S và cộng sự đã phân lập và định tên được ba chủng vi

sinh có khả năng sinh TTX là Bacillus sp., Kytococcus sedentarius và Cellulomonas fimi từ

cá nóc Arothron hispidus [14]

Năm 2011, Vincent Chung-Him Yu và cộng sự đã phân lập được Raoultella

terrigena từ cá nóc Takifugu niphobles có khả năng sản sinh TTX khi nuôi trong môi

trường ORI [76]

Năm 2012, để chứng minh giả thiết TTX được sinh nội bào hay ngoại bào, Yamashita M.Y và cộng sự đã nghiên cứu độc tố TTX và dẫn xuất của nó ở loài sa giông Nhóm tác giả cho rằng TTX được sinh ngoại bào vào cơ thể sa giông là do chuỗi thức ăn hoặc do sinh tổng hợp của vi sinh vật sống trong đó [85]

Như vậy, kết quả các nghiên cứu khẳng định có thể thu nhận TTX từ dịch nuôi cấy

vi sinh vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau, trên các loại môi trường khác nhau Các nghiên cứu trên là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu thu nhận TTX từ vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy quy mô phòng thí nghiệm cũng như quy mô công nghiệp

1.2.2.1 Đặc điểm của một số chủng vi khuẩn sinh TTX

a) Chi Vibrio

Tế bào nhỏ, hơi cong hoặc hình dấu phảy, 0,5-0,8 × 1,4-2,6 µm Chi Vibrio là vi

khuẩn Gram âm, sinh trưởng trong môi trường chứa D-glucose làm nguồn cacbon và NH+

làm nguồn nitơ Oxidase dương tính, chuyển nitrat thành nitrit [72] Một số loài Vibrio có

khả năng sản sinh tetrodotoxin [51, 53, 55, 56, 96]

b) Chi Pseudomonas

Chi Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, di động nhờ roi Tế bào hình que thẳng

hoặc hơi cong nhưng không xoắn, kích thước 0,5 – 1,0 × 1,5 – 5 µm Có loài là hiếu khí bắt buộc, oxi là chất nhận điện tử cuối cùng, kiểu dinh dưỡng là hóa dị dưỡng hữu cơ Trong một vài trường hợp nitrat có thể sử dụng như chất nhận điện tử cuối cùng thì loài đó

là kỵ khí tùy tiện và có kiểu dinh dưỡng là hóa tự dưỡng vô cơ

Oxydase dương tính hoặc âm tính, catalase dương tính Phần lớn không sinh trưởng

được ở điều kiện quá axit (pH 4,5 hoặc thấp hơn) Một số vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas

bị kìm hãm sinh trưởng bởi một số chất hữu cơ như aceton, diacetyl, inosose, dihydroxyacetone, 1,2-cyclohexadione, 1-phenyl-l,2-propanedione và axit ascorbic [72]

Pseudomonas có khả năng sinh độc tố tetrodotoxin và những chất đồng phân với

tetrodotoxin [27, 89]

c) Chi Pseudoalteromonas

Chi Pseudoalteromonas là vi khuẩn Gram âm, thuộc lớp Gammaproteobacteria, di

động nhờ một roi Tế bào hình que thẳng, kích thước 1× 2-3 µm, dạng đơn hoặc cặp Không có dạng bào tử hoặc kết vỏ nang Khuẩn lạc không màu, nhẵn Trao đổi chất hóa dị dưỡng, hiếu khí Đòi hỏi Na+ cho sinh trưởng Những loài thuộc nhóm không sắc tố có hoạt tính enzyme đa dạng và hiếm gặp (carrageenase, chitinase, alginase, cold-active enzyme) Những loài thuộc nhóm có sắc tố có xu hướng đòi hỏi cao hơn về sinh trưởng (một vài loài đòi hỏi cần có axit amin) và có hoạt tính peroxidase hơn hoạt tính catalase Vi

khuẩn thuộc chi Pseudoalteromonas có khả năng sản sinh ra kháng sinh cũng như những

chất có hoạt tính sinh học, như chất 2-heptyl-4-quinolinol, korormycin được tìm thấy có

hoạt tính kháng khuẩn [72] Một vài loài có khả năng sản sinh ra độc tố, trong đó có P

haloplanktis, P tetraodonis được phân lập từ nhím biển, có khả năng sinh tetrodotoxin

[30]

d) Chi Micrococcus

Chi Micrococcus là cầu khuẩn Gram dương, thuộc họ Micrococcaceae tồn tại phổ

biến trong môi trường đất, nước, không khí, nước biển và da của động vật có xương sống Kích thước tế bào khoảng 0,5-3 µm, thường tồn tại thành cặp hoặc bốn tế bào, không di động, hô hấp hiếu khí bắt buộc Phần lớn sinh sắc tố carotenoid Khuẩn lạc nhỏ, lồi, có nhiều sắc tố khác nhau: màu trắng, vàng, da cam, vàng nâu hoặc đỏ nhạt tùy vào những loài khác nhau Sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 22-25oC, nồng độ muối 5% Catalase dương tính, oxidase dương tính, coagulase âm tính, kháng furazolidone, dễ bị ảnh hưởng của

thuốc kháng sinh Micrococcus có thành tế bào dày, chiếm 50% sinh khối tế bào Bộ gen của Micrococcus giàu guanine và cytosine, chiếm khoảng 65-75% [38] Một số loài trong chi Micrococcus sinh tetrodotoxin [18]

e) Chi Shewanella

Chi Shewanella là vi khuẩn Gram âm, không sinh nội bào tử, có khả năng di động,

sống hiếu khí hay kỵ khí không bắt buộc, dễ phát triển trên các môi trường nuôi cấy không cần bổ sung NaCl hay các tiền tố hữu cơ kích thích sự sinh trưởng [13, 43, 69]

Tế bào có dạng hình que ngắn, kích thước 0,5 - 0,8 × 0,7- 2,0µm Khuẩn lạc tròn, bóng, lồi, mép khuẩn lạc trơn nhẵn [13, 43, 69]

Chi Shewanella là vi khuẩn sinh trưởng tốt trong giải nhiệt độ rộng từ 4 - 30oC Có khả năng sinh lipase, ornithine decarboxylase Không có khả năng lên men đường D-glucose và N-acetylglucosamine nhưng có khả năng đồng hóa D-glucose, cellobiose, maltose, sucrose, N-acetylglucosamine và gluconate Phản ứng catalase và oxidase dương tính [13, 43, 69]

1.2.2.2 Phương pháp phân loại vi khuẩn

Trước đây, phân loại vi khuẩn được thực hiện chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa theo khóa phân loại Bergey, đòi hỏi thời gian dài, phân loại gặp rất nhiều khó khăn và thiếu chính xác Gần đây, với kỹ thuật sinh học phân tử phát triển, có thể xác định trình tự các đoạn gen đặc hiệu trên phân tử ARN ribosom, ADN, giúp phân loại và xác định nguồn gốc các loài vi khuẩn chính xác Tuy nhiên, mỗi phương pháp truyền thống hay hiện đại đều có ưu nhược điểm khác nhau Để khắc phục các nhược điểm của mỗi phương pháp phân loại, ngày nay, các nhà khoa học đã dùng kết hợp cả phương pháp phân loại truyền thống bằng cách sử dụng các bộ kit thử sinh hóa API và cải tiến các phương pháp phân tích sinh học phân tử như sử dụng kỹ thuật lai phân tử với các mẫu đầu

dò đặc hiệu, kỹ thuật ADN microarray, để phân loại vi khuẩn một cách chính xác và thuận tiện cho mục đích sử dụng [8, 12, 22, 62, 75]

1.3 CÔNG NGHỆ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH TTX TỪ CÁ NÓC

1.3.1 Tổng hợp TTX theo phương pháp hóa học

Năm 1972, Kishi và cộng sự đã tổng hợp thành công TTX bằng phương pháp hóa học, gồm 15 bước với các phản ứng ketin hóa (ketalization), phản ứng khử (Meerwein-Ponndorf-Verley reduction), oxy hóa selenium (selenium oxidation), phản ứng epoxidation, phản ứng ghép vòng Diels-Alder và các kỹ thuật khác [32] Quá trình tổng hợp này được bắt đầu từ dẫn xuất của benzoquinone và kết thúc bằng việc guanidyl hóa dihydrofuranamine phức tạp và sau đó là quá trình oxy hóa cắt liên kết đôi dihydrofuran,

gắn nitrogen tự do vào vòng hemiaminal và khử acetyl Kết quả thu được TTX, nhưng hoạt tính của TTX tổng hợp hóa học lại rất thấp, nó phụ thuộc vào góc quay cực trong quá trình tổng hợp Cùng là TTX nhưng nếu ở dạng hemilactal thì TTX có độc tính cao, nếu ở dạng lacton thì TTX không có độc tính Nếu TTX tồn tại cả hai dạng hemilatal và lacton, độc tính của TTX tùy thuộc vào tỷ lệ giữa hai dạng hemilatal và lacton Do, quá trình tổng hợp hóa học TTX khá phức tạp và tốn kém, nên hạn chế khả năng ứng dụng trong thực tiễn [52]

1.3.2 Tách chiết và tinh sạch TTX từ cá nóc

Khi công nghệ nuôi cấy vi sinh vật sản sinh TTX chưa được phổ biến, nguyên liệu sử dụng cho quá trình tách chiết và tinh sạch TTX từ cá nóc độc là chủ yếu Do cá nóc độc có trong mô hàm lượng TTX tương đối cao so với một số động vật khác Mặt khác, sản lượng khai thác cá nóc độc lớn, có thành phần loài độc đa dạng, phân bố rộng hơn các loài động vật biển khác có TTX

Tách chiết và tinh sạch TTX là công nghệ phức tạp, khó khăn Trước đây, phương pháp tách chiết TTX là sử dụng dung dịch amoniac hoặc ethanol ether để kết tủa TTX trong dung dịch axit, nhưng sản phẩm thu được có độ tinh khiết chưa cao Một số phương pháp tinh sạch TTX được sử dụng chủ yếu:

Năm 1964, Goto.T và cộng sự tinh sạch TTX bằng phương pháp sắc ký trao đổi cột IRC-50 Các tác giả sử dụng dung dịch axit axetic 10% để giải hấp phụ độc tố TTX Phân đoạn chứa độc tố được tiếp tục sắc kí bằng cột than hoạt tính, thu phân đoạn có chứa độc tố rồi cô đặc, sau đó được hoà tan bằng một lượng nhỏ dung dịch axit axetic, được chuẩn với dung dịch amoniac, để trong phòng lạnh một thời gian sẽ thu được tinh thể TTX [24]

Năm 1977, Elam K.S và cộng sự cho mẫu cá nóc chứa độc tố vào túi thẩm tích Spectropor, sắc ký trên cột IRC – 50, lại tiếp tục sắc ký trên cột Sephadex G-10, đem đông khô, rồi hoà tan lại trong dung dịch methanol/axit axetic 1,5%, lọc qua màng Whatman No

42 để thu độc tố TTX [20]

Pavel Ka L.A và cộng sự tiến hành thẩm tích độc tố qua màng Spectropor (mol: 6.000 -8.000), đông khô, lại hoà tan trong dung dịch axit axetic để sắc ký trên Biogel-P2 Phân đoạn chứa độc được thu lại, đem đông khô để tiến hành sắc ký lọc gel trong bước tiếp theo [60]

Năm 1978, Sheumack D.D và cộng sự tinh sạch TTX như sau: Hoà tan mẫu chứa độc tố TTX trong dung dịch axit axetic 0,1M (pH=6,0) Ly tâm loại bỏ phần không tan, dịch ly tâm có chứa độc tố dùng để sắc kí trên cột CM-SephadexC-25 kích thước cột 2,5x40 cm, dạng NH4+ Sử dụng gradient nồng độ dung dịch axit axetic 0,1-0,4 M (pH= 6,0) Thu phân đoạn có chứa độc tố rồi đông khô để tiếp tục sắc ký lại 2 đến 3 lần để thu độc tố TTX [66]

Năm 1980, Zaisev và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật sắc ký cột để tinh sạch TTX Sau khi sắc ký trên cột Catimit dạng NH4+, phân đoạn chứa độc tố được cô đặc, xử lý, lại được sắc ký trên cột anionit dạng OH- Quá trình tinh sạch trên 2 loại cột (catimit và anionit) được lặp lại 2 – 3 lần để thu được TTX tinh khiết [95]

Năm 1982, Noguchi và cộng sự đã thu nhận và tinh sạch TTX bằng cách lấy dịch chứa độc tố sau khi đã loại bỏ mỡ bằng chloroform, được xử lý với than hoạt tính, thu phân đoạn chứa độc tố rồi tiếp tục sắc kí trên cột trao đổi ion IRC-50 dạng NH4+, thu phân đoạn

có chứa độc tố Các phân đoạn chứa độc được đông khô, sau đó hoà tan tiếp bằng dung dịch axit axetic để sắc kí trên cột SephadexG-15 Phân đoạn có chứa độc tố TTX được đem đông khô, sau đó hoà tan trong dung dịch etanol axit hoá, cho thêm diethyl ete tỉ lệ 1/2 (1V dịch mẫu: 1V dịch diethyl ete) lắc đều hỗn hợp này rồi để trong lạnh Kết quả thu được dạng độc tố kết tinh, lọc tách kết tinh rửa bằng methanol từ 2-3 lần sẽ thu được độc tố TTX [57]

Năm 1985, Shiomi K và cộng sự đã tinh sạch TTX bằng cách tách độc tố TTX thô, cô đặc, sau đó cho lên cột sắc ký Bio Gel-P2, thu phân đoạn chứa độc tố, rồi lại sắc ký trên cột Bio Rex-70 (H+) Phân đoạn chứa độc tố được thu lại dùng để sắc ký lớp mỏng với

hệ dung môi pyridin: ethyl acetat: nước (75/35/15/30) Cuối cùng dịch chứa độc tố được điện di trên gel xenlulo-acetat với đệm Tris-HCl 0,08M, pH = 8,7 [67]

Maruyama J và cộng sự đã tinh sạch bằng cách sử dụng dichloromethane để loại

bỏ mỡ từ mẫu độc tố Sau đó cô đặc, rồi hoà tan trong dung dịch axetic 1% trong metanol, chuẩn pH về 5,2 bằng NaOH Dịch thu được bổ sung thêm 200g than hoạt tính khuấy đều rồi để lạnh Sử dụng dung dịch giải hấp phụ axetic/metanol để thu độc tố Phân đoạn có chứa độc tố được đưa lên cột IRC-50 để sắc kí Thu phân đoạn chứa độc tố từ sắc kí cột này xử lý lại với than hoạt tính như trên Thu phân đoạn chứa độc tố từ than hoạt tính đông khô rồi hoà tan trong dung dịch amonium-acetat 0,1 M (pH=6) rồi lại đưa dịch này nên cột sắc kí CM- SephadexC-15 (NH4+) kích thước cột 2,6 x 30cm Sử dụng gradient nồng độ 0,1-0,4 amonium acetat (pH=6), thu phân đoạn có chứa độc tố đông khô, tiếp đó sắc kí trên cột Bio-Rex70 (H+), thu phân đoạn chứa độc tố rồi sắc kí lại trên cột này 2-3 lần thu được độc tố kết tinh [39]

Năm 1986, Mosher H.S và cộng sự tinh sạch độc tố bằng cách đồng nhất mẫu cá nóc độc trong dung dịch, ly tâm hoặc lọc loại bỏ cặn, thu dịch và cô đặc, sẽ có hàm lượng TTX khoảng 1000MU/mg Phân đoạn này được thẩm tích trong nước cất, thu phân đoạn có chứa độc tố TTX rồi sắc ký trên cột silicid axit với hệ dung môi chloroform/metanol, thu phân đoạn chứa độc tố và tiếp tục tinh sạch bằng phương pháp điện di trong dung dịch axit Thu phân đoạn có chứa độc tố TTX rồi cô đặc Phân đoạn này được hòa tan trong dung dịch axit axetic 1,6% rồi cho thêm tiếp etanol vào theo tỷ lệ 1/2 Ly tâm loại bỏ phần không tan Phần dịch chứa TTX được tủa với ether-etylic để trong lạnh, sau đó thu độc tố kết tinh [47]

Năm 2003, Yu C.F và cộng sự đã sử dụng than hoạt tính hấp phụ TTX, sau đó tách rửa 3 lần bằng axit axetic 1% trong 20% ethanol Phân tách bằng cột Bio-Gel P2 (2x50cm)

và cột trao đổi iôn Bio-Rex 70 [92]

Năm 2011, Xiao-Wu Chen và cộng sự đã tiến hành tách chiết, tinh sạch, nhận dạng

và định lượng sự có mặt của TTX trong mẫu cá nóc độc bằng hệ thống LC-MS mà không cần phải qua các công đoạn thu phân đoạn, xác định TTX từng phân đoạn rồi tiến hành tinh sạch qua cột Đây là hướng nghiên cứu tinh sạch tương đối mới mẻ, sử dụng sự phân tách của dung môi trên chính cột sắc ký chạy trên hệ thống LC-MS Phương pháp này có thể tách chiết, tinh sạch được một lượng mẫu nhỏ dành cho quá trình thử nghiệm trong điều kiện chuẩn [80]

Ở Việt Nam, mặc dù vấn đề ngộ độc thực phẩm nói chung và ngộ độc cá nóc đang

là mối quan tâm của toàn xã hội Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu về độc tố TTX còn ít

Năm 1994, Lê Quang Huấn và cộng sự đã công bố về phương pháp tách chiết TTX

từ một vài loài cá nóc thu thập được ở biển miền Trung Tác giả đã đưa ra quy trình tách chiết và tinh sạch TTX: Dịch nghiền mẫu cá nóc chứa độc tố thô sau khi đã loại bỏ mỡ bằng chlorofom được sắc ký bằng than hoạt tính cho vào màng lọc thẩm tích Tiến hành thẩm tích trong phòng lạnh, dịch thẩm tích thu được đem đông khô Sử dụng phân đoạn thẩm tích có chứa độc tố để sắc ký trên cột IRC-50, thu phân đoạn có chứa độc tố từ IRC-

50 tiếp tục sắc ký trên cột Sephadex G-15 để thu phân đoạn chứa độc tố, đông khô để tiếp tục sắc ký lại 2-3 lần thu độc tố TTX Sản phẩm TTX thu được có độ tinh khiết còn thấp (khoảng 65,2-67,6%) [5]

Năm 2002, Đỗ Tuyết Nga và cộng sự theo dõi độc tố tetrodotoxin trong 3 loài cá nóc thu ở Cửa Bé (Nha Trang, Khánh Hòa) theo tháng trong năm 2002, đồng thời tiến hành nghiên cứu, xác định cơ chế sản sinh độc tố TTX và hàm lượng độc tố trong cá nóc Kết quả nghiên cứu bước đầu đã xác định tetrodotoxin là độc tố ngoại sinh, có hàm lượng rất cao trong mùa cá nóc mang trứng, nhất là vào thời kỳ trứng thành thục sinh dục [7]

Năm 2002, Nguyễn Hữu Hoàng và cộng sự đã cải tiến phương pháp tách chiết và tinh sạch TTX Tác giả đã sử dụng phương pháp sắc ký để loại bỏ các tạp chất và thu được TTX có độ tinh sạch là 67% Mặc dù, sản phẩm TTX có độ tinh sạch so với thế giới

là chưa cao, đây cũng là dấu hiệu đáng mừng khi các nhà khoa học trong nước đang ngày càng chú trọng đến quá trình nghiên cứu, tinh sạch TTX [4]

Năm 2004-2006, Nguyễn Văn Lệ và cộng sự đã nghiên cứu phân tích hàm lượng TTX trong 35 loài cá nóc Việt Nam Kết quả cho thấy 14 loài chưa phát hiện thấy độc; 21 loài chứa độc với các mức độ khác nhau: 10 loài độc tính mạnh, 7 loài độc tính trung bình

và 4 loài độc tính nhẹ [6]

Năm 2009, Đái Duy Ban và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng tetrodotoxin làm thuốc

hỗ trợ điều trị các bệnh tim mạch, ung thư, nghiện ma túy, nghiện thuốc lá, nghiện rượu và HIV/AIDS [2, 71]

Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy thu nhận và tinh sạch TTX từ cá nóc độc còn gặp nhiều khó khăn do chưa chủ động được nguồn nguyên liệu (sản lượng khai thác cá nóc độc ngày càng giảm, hàm lượng TTX có trong các mô cá nóc phụ thuộc theo giai đoạn sinh trưởng, mùa vụ, vùng địa lý và theo loài) Vì vậy, hướng nghiên cứu sinh tổng hợp TTX từ

vi sinh vật là hướng đi triển vọng và bền vững, hứa hẹn đáp ứng được nhu cầu sử dụng TTX ngày càng tăng trong thực tiễn

1.4 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH TTX TỪ VI SINH VẬT

Myoung-Ja Lee và cộng sự (2000) tách TTX từ dịch chiết vi khuẩn theo phương pháp: dịch chiết được loại béo bằng diclorua metan, lớp dịch trong đem cô quay chân không để loại bỏ diclorua metan Dịch huyền phù được đưa vào máy phá siêu âm 10 phút Hỗn hợp được đun nóng trong bể cách thủy, sau đó làm lạnh tới nhiệt độ phòng, rồi lọc qua màng Amicon Diaflo YM-2, đem cô dưới áp suất chân không và được làm lạnh đông Dịch

cô đặc này được hòa tan trong axit axetic 0,03 M và cho lên chạy sắc ký cột Bio-Gel P2 2x94 cm bằng bơm đẳng dòng (Kyowa Seimitsu, Nhật bản) Các phân đoạn được tập trung lại và đem đông khô [51]

Yu Chun-Fai và cộng sự (2004) Phân tách TTX từ dịch nuôi vi khuẩn như sau: Môi trường nuôi vi khuẩn được ly tâm (3000 vòng/phút) trong 15 phút để loại bỏ các tế bào vi khuẩn lắng cặn Dịch nổi đem cô thể tích xuống còn 100 ml rồi đem trộn lẫn với cùng thể tích than hoạt tính đã được rửa bằng nước cất Khuấy trộn và lọc qua phễu Buchner Rửa than hoạt tính trên phễu bằng nước cất, TTX được giải hấp phụ bằng 3 lần thể tích axit axetic 1% trong etanol 20% Dịch giải hấp đem cô và đông khô Hòa tan dịch đông khô trong axit axetic 0,03M và bơm lên cột sắc ký lọc gel Bio-Gel P2 (Bio-Rad) 2 x 50 cm đã được cân bằng axit axetic 0,03M Các phân đoạn có độc tố sau khi được kiểm tra bằng phương pháp thử sinh học trên chuột được tập trung lại, đem cô và đông khô Dịch đông khô tiếp tục được hòa tan lại trong 10 ml axit axetic 0,03M và bơm lên cột sắc ký trao đổi cation Bio-Rex 70 (dạng H+, Bio-Rad) TTX được giải hấp phụ bằng axit axetic nồng độ gradient tuyến tính 0-0,03M Các phân đoạn có độc tố được tập trung lại và cô dưới áp suất nhằm giảm thể tích còn 10 ml Dịch này đem thử sinh học trên chuột và xác định TTX bằng các phương pháp HPLC [93]

Theo phương pháp Zhenglong Wu và cộng sự (2005) tiến hành, độc tố được tách từ

các tế bào vi khuẩn và từ xạ khuẩn Actinomycietes theo phương pháp cải tiến nhỏ từ các

phương pháp đã công bố: dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút/4oC trong 30 phút để thu các tế bào vi khuẩn Cặn vi khuẩn rửa 3 lần bằng nước cất sau đó đem khuấy đục trong 0,1% axit axetic, phá tế bào bằng thiết bị siêu âm, đun sôi 100oC trong 10 phút, làm mát và ly tâm để tách TTX Dịch nổi đem siêu lọc qua bộ lọc 3000 Da (Thượng Hải, Trung Quốc) Dịch lọc sau khi được chỉnh pH đến 5,5 đem bơm lên cột than hoạt tính Độc tố hấp phụ trong than được giải hấp phụ bằng axit axetic 1% trong methanol 20% Dịch giải hấp đem cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45oC, đông khô, rồi hoàn nguyên trong một lượng nhỏ nước cất và chạy sắc ký cột Bio-Gel P2 (1 x 80 cm) Sử dụng axit axetic 0,03M để rửa giải và thu các phân đoạn 2 ml Các phân đoạn có độc sau khi đã được xác

định bằng thử sinh học trên chuột sẽ được tập trung lại và làm đông khô Dịch đông khô tiếp tục được hòa tan trong axit axetic 0,03M, bơm lên cột sắc ký trao đổi cation Bio-Rex

70 (dạng H+, 1 x 90 cm), rồi giải hấp bằng axit axetic nồng độ gradient tuyến tính 0-0,05M Dịch giải hấp được đông khô lần nữa và đem thử sinh học trên chuột và xác định TTX bằng các phương pháp phân tích HPLC hoặc LC-MS [96]

B.A Venmathi Maran và cộng sự (2007) đã tiến hành tách chiết TTX từ sinh khối vi sinh vật như sau: dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm 3000 vòng/phút trong 30 phút, sinh khối

vi khuẩn đem trộn lẫn với 30 ml axit axetic 0,1% và sau đó phá tế bào bằng máy rung siêu

âm trong 10 phút Dịch thu được đem đun trong bể cách thủy 10 phút, làm mát ở nhiệt độ phòng và ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút Dịch nổi được cô dưới áp suất chân không, rồi bơm lên cột Sep-Pak plus C18 (Waters) Thu phần không liên kết (phân đoạn I) cô tới khô và sau đó hòa tan trong lượng nhỏ nước cất Đối với phần dịch nổi, cho thêm 30 ml axit axetic 0,1% và đun trong nồi cách thủy hỗn hợp này 10 phút, làm mát ở nhiệt độ phòng và sau đó ly tâm như mô tả ở trên Phần dịch nổi đem đi cô chân không, chỉnh pH tới 5,5 bằng NaOH 1N và sau đó bơm lên cột than hoạt tính đã rửa bằng nước cất ( ϕ2,5 x

30 cm) và rửa bằng nước cất Phân đoạn giải hấp bằng axit axetic 1% trong 20% etanol được đem cô tới khô dưới áp suất chân không, đem lọc bằng bộ siêu lọc (Ultra-free C3, Millipore) có kích thước 3000 Da Phân đoạn thu được dưới 3000 Da này là phân đoạn II Các phân đoạn I và II được phân tích trên các hệ thống HPLC, GC-MS, LC-MS [13]

Bragadeeswaran S và cộng sự (2010) đã tách chiết và tinh sạch TTX có trong dịch ngoại bào như sau: dịch nuôi vi khuẩn thu được sau khi nuôi cấy trong tối, yếm khí 10 ngày được ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ tế bào, dịch nổi được cô chân không giảm thế tích Hấp phụ dịch nổi bằng than hoạt tính, rửa giải hấp phụ với thể tích 3 lần bằng axit axetic 1% trong etanol 20% Cô quay chân không giảm thể tích và loại béo Độc tố thô được hòa tan trong 10ml axit axetic 0,03M Tinh sạch bằng cột Bio-Gel P2, rửa giải hấp phụ bằng axit axetic 0,03M Các phân đoạn chứa độc tố được gom lại, cô quay giảm thể tích và hòa tan trong 10ml axit axetic 0,03M [14]

Nhìn chung, hầu hết các nghiên cứu ở trên mới chỉ dừng ở công đoạn tách chiết, tinh sạch TTX phục vụ cho quá trình phân tích, xác định để nhận dạng TTX ở vi sinh vật Còn nghiên cứu của Deng Y và cộng sự (2008), của Yu Chung Him (2007) lại chỉ chú ý tìm điều kiện nuôi cấy vi khuẩn sinh TTX hàm lượng cao nhất mà không nêu hàm lượng TTX thu được từ các công đoạn tách chiết, tinh sạch [16, 94]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng

2.1.1.1 Cá nóc độc

Ba loài cá nóc độc Việt Nam thuộc nhóm có độc tính mạnh, sản lượng lớn:

- Cá nóc vằn Takifugu oblongus

- Cá nóc xanh chấm cam Torquigener pallimaculatus

- Cá nóc đầu thỏ mắt to Lagocephalus lunaris

Các cá thể được phân loại, lựa chọn trong giai đoạn sinh sản, bảo quản sống, vận chuyển về phòng thí nghiệm phục vụ cho quá trình phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh TTX

Hình 2.1 Buồng trứng của cá nóc Torquigener pallimaculatus trong mùa sinh sản

2.1.1.2 Vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật được phân lập từ 4 mô (trứng/tinh sào, gan, ruột, da và thịt) của ba loài cá nóc độc Việt Nam: cá nóc vằn, cá nóc xanh chấm cam và cá nóc đầu thỏ mắt

to

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Hải sản, Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường ĐHBK Hà Nội, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Kitasato - Nhật Bản Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu, gồm: hệ thống HPLC

(Shimazu, Nhật), hệ thống LC\MS-MS (Hitachi - Nhật), hệ thống cô quay chân không (Bio-rad), máy cất nước 2 lần (Đức), bộ lọc dung môi (Đức), cột sắc ký các loại (Wako), tủ sấy (Memmer, Đức), máy ly tâm lạnh (Đức), pipette các loại (Bio-rad), màng lọc mẫu microcon, Sepak (Wako), hệ thống lên men 2 và 5 lít (MD-250, L E Marubishi, Nhật Bản), máy đo pH (pH meter F-22, Horiba, Nhật Bản), tủ cấy vi sinh vật (Nuaire, Mỹ), tủ

ấm (Binder, Đức), máy lắc ổn nhiệt (Certomat BS-1, Đức), nồi hấp vô trùng (Hirayama, Nhật Bản),

2.1.3 Hóa chất và môi trường nghiên cứu

2.1.3.1 Hóa chất

Các hoá chất dùng trong nghiên cứu phòng thí nghiệm thuộc loại tinh khiết ở mức

độ phân tích hoặc là hóa chất chuyên dụng Phần lớn chúng có nguồn gốc từ các hãng như Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difco (Mỹ), Wako (Nhật), Bio-rad (Mỹ), như: NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3, MgSO4, KCl, FeSO4, CaCO3, HCl, NaOH, NH4OH, CHCl3 tinh khiết,

CH4O, C2H6O, C2H4O2, HFBA, Bio-Gel P2, Bio-Rex 70, than hoạt tính (Merck),…

2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

¾ Môi trường Marine dịch thể (g/l): Pepton-5; Cao men-1; FeC6H6O7-0,1; 19,45; MgCl2 -8,8; Na2 SO4 -3,24; CaCl2 -1,8; KCl-0,55; NaHCO3 -0,16; KBr-80mg; SrCl2

NaCl 34mg; H3BO3-22mg; Na2SiO3-4mg; NaF-2,4mg; Na2HPO4-1,6mg; NH4NO3-8mg, H2O- 1lit, pH 7,6 [63]

¾ Môi trường TYP dịch thể : 1,6 % Trypton, 1,6% Cao men, 0,25% K2HPO4, 3% NaCl [63]

¾ Môi trường ORI dịch thể (g/l): Protease peptone-2; Bacto cao men-2; Phyto peptone-1; Na2S2O3-0,4; Na2S2O2.5H2O-1; FeC6H6O7-0,08; nước biển 750ml/l; pH 7,6 [63]

¾ Môi trường Zobell dịch thể (g/l): Bacto peptone-0,5; Cao men-0,1; FeC6H6O7-0,01;

K2HPO4-0,2; NaCl-20; H2O 1lit; pH 7,5-7,6 [63]

¾ Môi trường TCBS dịch thể : 0,5% Cao men; 0,5% sữa peptone; 0,5% peptone, 1% FeC6H6O7; 2% Saccharose; 1% NaCl, 1% Na2S2O3; 0,5% muối mật; 0,3% Natri cholate; 0,1% FeC6H6O7; 0,004% Thymol blue; pH 8,6 [63]

¾ Môi trường MT1 (g/l): Pepton -6; Bacto cao men- 10; Sucrose- 20; KH2PO4- 2,5; NaCl- 10; FeC6H6O7- 0,08; nước cất 1lit; pH 5-5,5 [63]

¾ Môi trường MT2 (g/l): Bacto peptone-4; cao nấm men- 10; glucose- 10; cao thịt bò- 4; nước biển- 750ml [63]

¾ Môi trường LB (g/l): tryptone - 10; cao nấm men- 5; NaCl-10

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xác định độc tố của 3 loài cá nóc độc bằng HPLC

Phân tích độc tố TTX bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Các phân tích lặp lại 3 lần

Có thể mô tả sơ lược về phương pháp như sau:

Đồng nhất mẫu mô cá nóc với axit axetic 1%, thể tích axit axetic gấp 3 lần khối lượng mô Đun cách thủy trong 10 phút Ly tâm 10.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút, thu dịch nổi Lọc qua cột Sepak Phân tích hàm lượng TTX bằng HPLC với các điều kiện sau [41]:

- Detector huỳnh quang

Đun cách thủy 10 phút để làm đông tụ protein Để nguội và lọc bỏ phần keo tụ thu được dịch chiết trong, màu vàng

Điều chỉnh pH của dịch chiết về khoảng 6,0-6,5 bằng dung dịch amoniac và lọc bỏ phần kết tủa để thu phần dịch trong Cho dịch chiết qua cột trao đổi ion Amberlite IRC-50 Sau khi toàn bộ dịch chảy hết qua cột, rửa cột bằng nước khử ion cho đến khi không còn protein trong dịch ra khỏi cột Sau đó rửa giải chất ra khỏi cột bằng dung dịch axit axetic 2% Thu dịch rửa giải, cho hấp phụ với than hoạt tính Sau đó giải hấp bằng dung dịch 2% axit axetic trong cồn Điều chỉnh pH của dung dịch Kết tinh TTX hoặc lấy dung dịch đi đo LC-MS [41]

2.2.2.2 Phương pháp phân tích TTX trên LC-MS

Dung dịch thu được sau khi giải hấp khỏi than hoạt tính được định mức thể tích, sau đó lấy một lượng nhỏ đem chiết pha rắn với SPE C18 và đưa vào máy LC-MS [80]

Cột phân tích: Zorbax Eclipse XDB C18 4,6x150mm

Nhiệt độ cột : 35 oC

Tốc độ dòng 0,3 ml/phút

Hệ dung môi gradient acetonitril/H2O (0-50%)

Bơm mẫu tự động: 5µl/lần Detector MSD Ion trap với chế độ quét tự động và bẫy mảnh ở Positive, mảnh bẫy được chọn là 320

Áp suất đầu phun: 30psi Nhiệt độ làm khô: 325oC

Hệ nén khí dung có tốc độ dòng 8l/phút Khoảng quét phổ: 150-400 m/Z

2.2.2.3 Phương pháp xác định tính chất của TTX

TTX kết tinh được đem hòa tan trong dung môi 4% CD3COOD/D2O

Đo phổ cộng hưởng từ nhân trên máy Bruker, tần số 500MHz, các phổ đo được là 1H, 13C, COSY, NOESY, HMBC,

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh TTX

2.2.3.1 Thu thập mẫu

Ba loài cá nóc độc biển Việt Nam thường bắt gặp là Lagocephalus lunaris,

Torquigener pallimaculatus, Takifugu oblongus được thu thập tại Cát Bà- Hải Phòng, Nha

Trang-Khánh Hòa Cá nóc được phân loại bằng phương pháp phân tích sinh học theo Nguyễn Văn Lệ [6] Mẫu cá nóc được bảo quản sống đưa về phòng thí nghiệm Mỗi cá thể được phân tách riêng rẽ các bộ phận (gan, ruột, da và trứng/tinh sào) để phục vụ quá trình phân lập vi khuẩn từ các bộ phận của cá nóc