Nghiên cứu thu nhận protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Nghiên cứu thu nhận protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

ĐạI HọC Đμ NẵNG

Đỗ Thị Bích Thủy

Nghiên cứu Thu nhận chế phẩm protease

từ một số nguồn khác nhau vμ ứng dụng

trong công nghệ thực phẩm

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm đại cương Mã số : 2.11.00

Tóm tắt Luận án tiến sĩ kỹ thuật

Đà Nẵng - 2006

C«ng tr×nh ®−îc hoµn thµnh t¹i: §¹i häc §µ N½ng

- Th− viÖn Quèc gia

- Trung t©m Th«ng tin Häc liÖu §¹i häc §µ n½ng

- Trung t©m Häc liÖu §¹i häc §µ N½ng

- Th− viÖn Tr−êng §¹i häc N«ng L©m - §¹i häc HuÕ

2 Đỗ Thị Bích Thủy, Trần thị Xô (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của

một số yếu tố lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis”, TC Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2004), 49: tr 1667-1668

3 Đỗ Thị Bích Thủy, Trần thị Xô (2005), “ảnh hưởng sự thay thế nguồn Cacbon và Nitơ tự nhiên lên quá trình sản xuất chế phẩm

protease từ Bacillus subtilis”, TC Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2005), 59: tr 42-43

4 Do Thị Bich Thuy, Tran Thi Xo (2005), “Production, purification

and application of protease from Bacillus subtilis”, Proceedings of Vietnam-Korea international symposium 2005 on Biotechnology and Bio-system-engineering, Ho chi Minh city: 47-52

5 Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xô (2006), “Nghiên cứu quy trình thu

nhận và khảo sát một số tính chất của chế phẩm protease Bacillus subtilis”, ”, TC Nông nghiệp và phát triển nông thôn 87: 41-51

6 Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Luyến (2006), “Nghiên cứu nuôi cấy

trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis để loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ phế liệu tôm”, TC Khoa học – Công nghệ Thủy sản 2-2006: 47-51

7 Đỗ Thị Bích Thủy, Phạm Thị Trân Châu (2006), “Nghiên cứu một

số tính chất proteinase ngoại bào của Bacillus subtilis bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide”, TC Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, KHTN & CN T XXII 3: 1-12

Mở đầu

1 Tính cấp thiết của luận án

Protease là một trong các enzyme công nghiệp quan trọng nhất,

được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm Quá trình thu nhận các chế phẩm enzyme phụ thuộc rất nhiều yếu tố như tính chất nguyên liệu, tác nhân vi sinh vật, điều kiện thu nhận Vì vậy tùy từng trường hợp cụ thể, cần nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp để thu nhận các chế phẩm enzyme phù hợp với mục đích sử dụng Trong thời gian gần đây, trên thế giới, nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu, đưa vào ứng dụng các chế phẩm protease trong công nghiệp chế biến thực phẩm và thương mãi hóa chế phẩm protease ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về enzyme tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng vẫn còn hạn chế và hiện nay chưa có cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng để sử dụng trong các ngành công nghiệp; hầu như các chế phẩm enzyme sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất đều phải nhập ngoại

Trước tình hình phát triển mạnh mẽ của ngành thủy sản cũng như sản xuất nông sản ở trong nước, với định hướng nghiên cứu thiết lập quy trình thu nhận các chế phẩm enzyme và ứng dụng các chế phẩm này trong việc xử lý phế phụ phẩm và chế biến nông sản,

chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ một số nguồn khác nhau và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm”

2 Mục đích của luận án

- Thiết lập được quy trình thu nhận chế phẩm proteinase ở quy mô phòng thí nghiệm có khả năng ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm

- ứng dụng chế phẩm enzyme thu được để loại bỏ protein khỏi phế liệu tôm trong quy trình sản xuất chitin và sử dụng enzyme đó để cải tiến quy trình sản xuất nước chấm từ đậu nành

Để thực hiện mục đích trên, yêu cầu đặt ra là nghiên cứu chọ nguồn proteinase thích hợp, thực hiện chiết tách, thu nhận chế phẩm enzyme, xác định tính chất và thử nghiệm ứng dụng trên các quy trình sản xuất

3 Nội dung nghiên cứu của luận án

- Nghiên cứu thăm dò, tuyển chọn nguồn nguyên liệu thích hợp

để thu nhận proteinase

- Nghiên cứu thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm proteinase

từ nguồn nguyên liệu đã được tuyển chọn

- Khảo sát một số đặc tính của các chế phẩm proteinase thu

được

- Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme này để xử lý loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm trong quy trình sản xuất chitin và cải tiến quy trình sản xuất nước chấm từ đậu nành truyền thống

4 ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

- Đóng góp dẫn liệu nghiên cứu điều tra nguồn proteinase từ một

số thực vật phổ biến ở Huế và tuyển chọn được một chủng vi khuẩn trong phế liệu tôm có PA trong môi trường cao, đã được định tên là

Bacillus subtilis (tại phòng thí nghiệm vi sinh vật môi trường và thực phẩm Universite Catholique de Louvain Bỉ)

- Là một trong số rất ít công trình ở Việt Nam tiến hành nghiên

cứu phát hiện trực tiếp và đầy đủ hơn các proteinase của Bacillus subtilis từ chế phẩm enzyme thô; sử dụng phương pháp điện di SDS

– PAGE có cơ chất phát hiện được ít nhất 6 băng PA có khối lượng phân tử từ 20 kD đến 67 kD, đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ức chế, hoạt hoá và các ion kim loại hoá trị hai đến mỗi proteinase

- Lựa chọn được điều kiện thích hợp để sử dụng proteinase hoặc

nuôi cấy trực tiếp Bacillus subtilis với phế liệu tôm để tách bỏ

protein, tạo nguyên liệu sạch protein nhằm sản xuất chitin đạt tiêu chuẩn cho sản xuất chitosan

- Lựa chọn được điều kiện thích hợp để sử dụng chế phẩm enzyme thu được (nồng độ 0,044HP/g, nhiệt độ 500C) để cải tiến thành công ở quy mô phòng thí nghiệm quy trình sản xuất nước chấm

từ đậu nành truyền thống; rút ngắn thời gian sản xuất xuống 6 lần và giảm được 1/2 lượng HCl so với quy trình truyền thống ở Huế Do

đó, nếu áp dụng trên quy mô lớn sẽ không chỉ có hiệu quả kinh tế mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường

5 Bố cục của luận án

Luận án gồm 124 trang bao gồm: Mở đầu 2 trang, tổng quan tài liệu 30 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 10 trang, kết quả và thảo luận 79 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang, 153 tài liệu tham khảo Trong luận án có 26 bảng, 56 hình và đồ thị

Chương 1: Tổng quan tμi liệu

1.1 Protease và phân loại

1.2 Nguồn proteinase và tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

1.3 Các phương pháp thu nhận chế phẩm proteinase

1.4 ứng dụng của proteinase

1.5 Tổng quan về Bacillus subtilis

1.6 Tình hình sản xuất chitin, nước chấm trong nước và trên thế giới

Chương 2: Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng

- Các loại hạt và quả được dùng để nghiên cứu được mua trên

địa bàn Thừa Thiên Huế như: Hạt đậu ván (Lablab vulgaris) khô, hạt

đậu ngự (Phaseolus lanatus) tươi, quả su le (Sechium edule), quả vả

(Ficus auriculata), hạt đậu nành

- Phế liệu của quá trình chế biến tôm (PLT) được lấy mẫu ở công ty chế biến thủy sản xuất khẩu Sông Hương (Thừa Thiên Huế) dùng để phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp proteinase cao và khảo sát quá trình loại bỏ protein

2.2 Phương pháp nghiên cứu

* Các phương pháp vi sinh vật: Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh

tổng hợp proteinase ngoại bào cao trên môi trường thạch gelatin; cấy tăng sinh và nuôi cấy để thu nhận enzyme trong môi trường lỏng, xác

định mật độ tế bào sau thời gian nuôi cấy bằng cách đo mật độ hấp

thụ ở bước sóng 600nm

* Các phương pháp phân tích hóa sinh: Xác định hoạt độ

proteinase theo phương pháp Anson cải tiến, xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry, xác định hàm lượng ni tơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl, tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp sắc ký lọc gel, điện di protein trên gel SDS-polyacryamide (SDS-PAGE) theo Leammli và điện di phát hiện proteinase theo Heusen và Dowdle

* Phương pháp vật lý: Xác định hàm lượng kim loại nặng bằng

phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

* Các phương pháp thống kê: Phương pháp phân tích phương sai

(Analysis of variance (ANOVA)), phương pháp tối ưu hoá theo quy hoạch thực nghiệm

Chương 3: Kết quả nghiên cứu vμ thảo luận

3.1 thăm dò hoạt độ proteinase (pa) của một số nguồn khác nhau

HP/100 gam tươi

Sai số

HP/100 gam chất khô

((*): Đối với đậu ván được tính trên 100g nguyên liệu ướt sau khi ngâm 50 g

nguyên liệu khô trong 6 giờ)

Từ kết quả thăm dò sơ bộ, chúng tôi tiến hành kết tủa bằng ethanol, đông khô để thu chế phẩm và tính giá thành tương đối

Kết quả cho thấy giá thành tính trên 1 đơn vị hoạt độ của chế phẩm tách từ su le là ít nhất, chỉ bằng khoảng 1/3 của đậu ván và 1/2 của vả và đậu ngự

Như vậy, các kết quả thăm dò hoạt độ proteinase từ các đối tượng thực vật cho thấy su le là nguồn thu nhận có hiệu quả nhất

3.1.2 Thăm dò một số nguồn vi sinh vật để thu proteinase

Từ 50 chủng vi khuẩn phân lập được, có 11 chủng có khả năng sinh tổng hợp proteinase ngoại bào Trong đó có 1 chủng được định

tên là: Bacillus subtilis, không gây bệnh và không sinh độc tố được

chọn để nghiên cứu thu nhận chế phẩm và so sánh hiệu quả với các

đối tượng thực vật Chủng này tạo PA trong môi trường lỏng thịt - pepton (MTCB) cao nhất sau 24 giờ nuôi cấy Chế phẩm enzyme thu

được sau khi kết tủa bằng cồn (ETC) từ chủng này trong MTCB có giá thành tương đối là 4974 đồng/1gETC và 170 đồng/HP (rẻ hơn 1,8 lần so với chế phẩm thu nhận từ su le)

3.2 Nghiên cứu thiết lập quy trình thu nhận chế

phẩm proteinase từ B subtilis

3.2.1 Nghiên cứu thiết lập môi trường tối ưu cho PA cao của B subtilis:

3.2.1.1 ảnh hưởng của nguồn carbon

Bổ sung các nguồn carbon như: tinh bột hòa tan, maltose, lactose, saccharose, dextrose với hàm lượng 0,5% vào MTCB đồng thời khảo sát trên mẫu đối chứng (ĐC) là MTCB Sau khi nuôi cấy 24 giờ, tiến hành xác định PA của dịch môi trường nuôi cấy bằng phương pháp Anson cải tiến (Hình 3.7)

0,096 0,156

0,052 0,016 0,016 0,0160

0,05

0,1

0,15

0,2

(ĐC: mẫu đối chứng, MTCB; TB: Tinh bột; Mal: Maltose; Dex:

Dextrose; Lac: Lactose; Sac: Saccharose)

Hình 3.7: ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ proteinase trong

dịch môi trường nuôi cấy của chủng B subtilis

Nguồn C (0,5%)

ĐC TB Mal Dex Lac Sac

Kết quả này cho thấy khi thêm tinh bột hoà tan vào MTCB,

PA đạt được cao nhất so với sự bổ sung các nguồn C khác; PA của dịch môi trường nghiên cứu lớn hơn so với mẫu đối chứng 1,6 lần (Hình 3.7)

3.2.1.2 ảnh hưởng của nguồn ni tơ

Tiến hành bổ sung vào môi trường cơ bản (đối chứng) các hợp chất N vô cơ (NH4NO3, NH4Cl) và N hữu cơ (cao nấm men, casein), thu dịch môi trường nghiên cứu và tiến hành xác định PA (Hình 3.8)

Từ kết quả ở hình 3.8 cho thấy casein là nguồn nitơ có tác dụng làm tăng PA mạnh nhất, hoạt độ đạt cao hơn hai lần so với mẫu đối chứng

0,096

0,192

0,032

0,016 0,016 0

Thực hiện khảo sát sự ảnh hưởng của các amino acid đến PA

Bacillus subtilis bằng cách bổ sung các amino acid khác nhau với

nồng độ 7 mmol/l vào MTCB Sau khi nuôi cấy, hoạt độ proteinase của dịch môi trường nuôi cấy có bổ sung amino acid đều giảm so với mẫu đối chứng (MTCB)

Hình 3.8: ảnh hưởng của nguồn ni tơ khác nhau đến hoạt độ

proteinase của dịch môi trường nuôi cấy B subtilis

3.2.1.4 Nghiên cứu thăm dò ảnh hưởng của sự kết hợp đồng thời nguồn carbon và ni tơ đến hoạt độ proteinase của dịch môi trường nuôi cấy B subtilis

* ảnh hưởng của sự kết hợp một số nguồn dinh dưỡng đến hoạt độ proteinase của dịch môi trường nuôi cấy B subtilis:

Thử nghiên cứu kết hợp bổ sung các nguồn dinh dưỡng đã khảo sát ở trên vào MTCB

Các mẫu thí nghiệm được nuôi cấy 24 giờ và xác định PA của dịch môi trường nuôi cấy Quá trình bố trí thí nghiệm và kết quả được thể hiện ở bảng 3.8

Bảng 3.8: ảnh hưởng của sự kết hợp một số nguồn carbon và ni

tơ đến hoạt độ proteinase của dịch môi trường nuôi cấy B subtilis

Nguồn C (%)

Nguồn N (%)

tn

TB Mal Cas CN

PA (HP/ml)

* ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột và cao nấm lên hoạt độ

Bảng 3.9: ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột và cao nấm đến

hoạt độ của dịch môi trường nuôi cấy B subtilis

Kết trên bảng 3.9 cho thấy ở nồng độ cao nấm 0,5% và tinh bột 1,5%, hoạt độ enzyme thu được đạt cực đại (0,504 HP/ml)

Từ kết quả thu được ở trên, chúng tôi tiếp tục khảo sát thay đổi

đồng thời hàm lượng tinh bột và cao nấm xung quanh 1,5% (1,25%; 1,5%; 1,75%; 2%; 2,25%) và 0,5% (0,1%; 0,3%; 0,5%; 0,7%; 0,9%) nhằm tìm được hàm lượng thích hợp nhất Kết quả cho thấy khi sử dụng 0,1% cao nấm phối hợp với 1,75% tinh bột PA đạt cao nhất Kết quả trên cho phép xác định được thành phần môi trường thích hợp nhất (MTTƯCB) gồm: 1% Pepton, 0,3% cao thịt, 0,5% NaCl, 0,1% cao nấm, 1,75% tinh bột hòa tan

3.2.2 ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ lên PA của B

Nuôi cấy Bacillus subtilis trong MTTƯCB có điều chỉnh pH

ban đầu, đồng thời thay đổi nhiệt độ nuôi cấy khác nhau

Sau khi nuôi cấy 24, PA của dịch MTNC được xác định ở điều kiện dung dịch đệm pH 7,4

Kết quả cho thấy: Chủng B subtilis khi được nuôi cấy trong

MTTƯCB tạo nên PA cao khi pH môi trường nằm trong khoảng 6 - 8 (cao nhất ở pH 6), ở nhiệt độ 350C

Hàm lượng

tinh bột(%)

Hàm lượng

cao nấm (%)

3.2.3 Xác định thời điểm sinh PA cao nhất khi nuôi cấy B subtilis

trong môi trường tối ưu cơ bản ở điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp

Thực hiện khảo sát xác định thời điểm thu nhận enzyme bằng cách xác định PA của dịch nuôi cấy ở các thời gian khác nhau (Hình 3.9)

3.2.4 Nghiên cứu quá trình tách và tinh chế sơ bộ proteinase từ

dịch môi trường nuôi cấy (MTNC) của B subtilis

3.2.4.1 ảnh hưởng của nồng độ ethanol và pH dịch môi trường nuôi cấy

đến khả năng thu nhận chế phẩm proteinase kết tủa (Hình 3.10)

Thời gian nuôi cấy(giờ)

Hình 3.9: Kết quả khảo sát sự biến đổi của PA khi nuôi

B subtilis trong môi trường tối ưu cơ bản

3.2.4.2 ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 và pH dịch môi trường nuôi cấy đến hiệu quả thu nhận chế phẩm proteinase kết tủa (Hình 3.11)

Hoạt lực enzyme thu được khi dùng ethanol kết tủa cao hơn 1,12 lần so với trường hợp dùng (NH4)2SO4 Trong các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi chọn ethanol làm tác nhân để thu nhận chế phẩm enzyme

3.2.4.3 Tinh sạch sơ bộ chế phẩm enzyme thu được sau khi kết tủa bằng ethanol (ETC) qua cột Sephadex G-100 (đã được cân bằng với

dung dịch đệm Tris – HCl 0,05M, pH 7,6, kích thước cột 80x15cm, tốc độ chảy 17ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn là 2ml)

Kết quả cho thấy rằng, sau khi sắc ký qua Sephadex G – 100, ETC được tách thành 2 đỉnh protein nhưng chỉ một đỉnh có PA, đỉnh

I (từ phân đoạn 15 đến phân đoạn 33) (hình 3.12)

Thu các phân đoạn có PA (chế phẩm enzyme thu được sau sắc

ký lọc gel (ESG)), xác định protein tổng số, hoạt độ proteinase, tình hoạt độ riêng, độ sạch và hiệu suất thu hồi enzyme (Bảng 3.13)

pH dịch MTNC

Nồng độ (NH4)2SO4

Hình 3.11: ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 và pH dịch môi trường nghiên cứu đến hiệu quả thu nhận enzyme

Protein tổng (mg)

Hoạt độ riêng (HP/mg)

Độ sạch (lần)

Hiệu suất thu hồi enzyme (%) Dịch

MTNC

8,91 104,713 0,080 1,000 100,000

ETC 11,16 47,121 0,237 2,222 125,252

ESG 7,080 0,993 7,132 89,150 79,460

3.2.5 Quy trình thu nhận proteinase từ môi trường nuôi B

Chế phẩm ETC thu được theo các điều kiện thích hợp đã khảo

sát ở các phần trên, sau khi phân tích các chỉ tiêu về an toàn thực

phẩm và xác định hoạt độ, giá thành của sản phẩm chúng tôi có được

kết quả trình bày trên bảng 3.14

0 0,05 0,1 0,15 0,2

Hình 3.12: Sắc ký đồ của chế phẩm ETC qua cột Sephadex G-100