Nghiên cứu sự phân huỷ sinh học hợp chất Hydrocarbon mạch vòng ở một số vi khuẩn quang hợp tía phân lập tại Việt Nam

Nghiên cứu sự phân huỷ sinh học hợp chất Hydrocarbon mạch vòng ở một số vi khuẩn quang hợp tía phân lập tại Việt Nam

ViÖn C«ng nghÖ sinh häc

§inh ThÞ Thu H»ng

Nghiªn cøu Sù ph©n hñy sinh häc hîp chÊt hydrocarbon m¹ch vßng ë mét sè vi khuÈn quang hîp tÝa

ph©n lËp t¹i viÖt nam

Chuyªn ngµnh: Hãa sinh häc

Tãm t¾t LuËn ¸n tiÕn sü sinh häc

Hµ Néi, 2007

Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn:

PGS.TSKH Trần Văn Nhị PGS.TS Trương Nam Hải

Phản biện 1: GS.TSKH Phạm Thị Trân Châu, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phản biện 2: GS.TSKH Lê Do9n Diên, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông

nghiệp Việt Nam

Phản biện 3: GS.TS Đặng Thị Thu, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án tiến sỹ cấp Nhà nước, tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Vào hồi 9 giờ, ngày 30 tháng 11 năm 2007

- Thư viện Quốc Gia Hà Nội

Mở đầu

1 Tính cấp thiết của đề tài

Các hợp chất thơm rất phổ biến trong tự nhiên, đồng thời chúng còn là những sản phẩm từ các hoạt động của con người Mặc dù hợp chất thơm tổng hợp chiếm một lượng rất nhỏ trong môi trường nhưng cấu trúc của chúng rất khó bị phân hủy bởi các quần x9 vi sinh vật (Heider và

đtg, 1999) Một vài hợp chất trong số này có thể gây đột biến, quái thai hoặc ung thư (Paxeus và đtg, 1992) Tuy nhiên, nhiều hợp chất thơm có thể được phân hủy bởi vi sinh vật do chúng có những hệ thống hóa sinh khác nhau (Bosma và đtg, 2001; Zhang và đtg, 2005)

Cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu về phân hủy hợp chất thơm thông qua benzoate (BA) trong điều kiện kỵ khí được tiến hành ở vi khuẩn quang hợp tía (VKQHT) hoặc vi khuẩn khử nitrate VKQHT thuộc nhóm vi khuẩn thủy sinh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện

kỵ khí bằng cách quang hợp nhưng không thải oxy Nhóm vi khuẩn này

có các kiểu trao đổi chất rất linh hoạt nên chúng phân bố rộng r9i trong

tự nhiên Đặc biệt, VKQHT có khả năng sử dụng BA, các axit vòng no

và vòng thơm làm nguồn carbon (C) cho sinh trưởng (Harwood và Gibson, 1986; 1988) Nhiều enzym tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí BA ở VKQHT và những gen m9 hóa cho các enzym này đ9 được nghiên cứu (Geissler và đtg, 1988; Gibson và đtg, 1990; 1997; Larimer

và đtg, 2004; Pelletier và Harwood, 1998) Những nghiên cứu về gen đ9 góp phần xác định đặc tính của các enzym tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí BA, xác định được tính đa dạng trong loài và hiểu rõ bản chất của những phản ứng không thông thường xảy ra ở VKQHT (Egland và

đtg, 1997; 2001; Oda và đtg, 2004; Samanta và đtg, 2005)

ở Việt Nam, nhóm VKQHT đ9 và đang được chú trọng trong các nghiên cứu phân loại (Vũ T.M.Đức và đtg, 2004); khử sulfur ở đáy ao nuôi thủy sản (Võ T.Hạnh và đtg, 2004); xử lý nước thải giàu hữu cơ

(Trần V.Nhị và đtg, 2000); tách chiết hoạt chất sinh học (Lê Q.Huấn và

đtg, 1999) và khả năng sinh trưởng trên BA trong điều kiện kỵ khí (Đỗ T.T.Uyên và đtg, 2002) Tuy nhiên, những nghiên cứu về sự phân hủy các hợp chất thơm ở VKQHT vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu

Vì vậy, trong luận án này chúng tôi đặt ra nhiệm vụ: “Nghiên cứu

sự phân hủy sinh học hợp chất hydrocacbon mạch vòng ở một số vi khuẩn quang hợp tía phân lập tại Việt Nam” nhằm góp phần tìm hiểu

về sự phân hủy một số hợp chất thơm đơn nhân của VKQHT và định hướng ứng dụng chúng trong công nghệ sinh học môi trường

2 Mục tiêu của đề tài:

Tìm hiểu khả năng phân hủy một số hợp chất thơm đơn nhân ở VKQHT phân lập từ một số khu vực ô nhiễm khác nhau

Nghiên cứu gen m9 hóa enzym chìa khóa benzoate-CoA ligase (BadA) tham gia vào quá trình phân hủy BA ở VKQHT

Nghiên cứu sự biểu hiện gen badA, tính chất của enzym tái tổ hợp

3 Nội dung nghiên cứu:

Tuyển chọn VKQHT có khả năng tồn tại và sinh trưởng trên một số hợp chất thơm đơn nhân như: BA, phenol và một số dẫn xuất, đồng thời đánh giá khả năng sử dụng và phân hủy những hợp chất này ở những chủng được lựa chọn

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số đại diện VKQHT

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (oxi, ánh sáng, nguồn C ) đến khả năng phân hủy BA và 4-hydroxybenzoate (4-OHBen) ở chủng VKQHT đại diện

Xác định sự có mặt của enzym chìa khóa benzoate-CoA ligase trong quá trình phân hủy BA ở chủng VKQHT đại diện

Tách dòng gen badA của chủng VKQHT đại diện, biểu hiện gen badA trong E coli và xác định một số tính chất của enzym BadA tái

tổ hợp

4 Những đóng góp mới của luận án:

Đây là công trình nghiên cứu có hệ thống đầu tiên về sự phân hủy và

sử dụng một số hợp chất thơm đơn nhân ở VKQHT phân lập ở miền Bắc Việt Nam

Phát hiện được 2 chủng VKQHT có khả năng phân hủy mạnh 3-chlorobenzoate (3-CBA) với đồng cơ chất là BA hoặc 4-OHBen,

đồng thời chúng có khả năng sử dụng 3-CBA là nguồn C duy nhất

Xác định được gen badA m9 hóa cho enzym chìa khóa

benzoate-CoA ligase trong con đường phân hủy kỵ khí BA ở một chủng VKQHT đại diện có mức độ tương đồng cao nhất 93,3% so với gen tương ứng đ9 được công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế

5 Bố cục của luận án

Luận án gồm 136 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1 Tổng quan tài liệu (35 trang); Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3 Kết quả (50 trang với 9 bảng và 39 hình); Chương 4 Bàn luận (9 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Tài liệu tham khảo (21 trang gồm 13 tài liệu tiếng Việt, 194 tài liệu tiếng Anh)

Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Các hợp chất thơm và sự phân hủy sinh học

1.2 Vi sinh vật phân hủy hợp chất thơm trong điều kiện hiếu khí

1.3 Vi sinh vật phân hủy hợp chất thơm trong điều kiện kỵ khí

1.3.1 Vi khuẩn hô hấp kỵ khí

1.3.2 Vi khuẩn lên men

1.3.3 Vi khuẩn sinh metan

1.3.4 Vi khuẩn quang hợp tía

1.4 Quá trình phân hủy hợp chất thơm trong điều kiện kỵ khí

1.4.1 Các con đường ngoại vi của quá trình phân hủy kỵ khí

1.4.2 Con đường phân hủy kỵ khí BA trung tâm

1.5 Các gen liên quan đến con đường phân hủy kỵ khí BA ở VKQHT

1.5.1 Tổ chức và sắp xếp các gen chức năng

1.5.2 So sánh con đường phân hủy kỵ khí BA ở VKQHT

Rhodopseudomonas palustris với vi khuẩn khử nitrate

1.5.3 Điều hòa quá trình phân hủy kỵ khí BA

1.6 Phương pháp quan trắc phân tử (molecular monitoring)

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng, vật liệu: các chủng VKQHT được phân lập từ một số nguồn thải; các chủng E coli DH5α và BL21; các plasmid pCR2.1

và pET32a(+); các cặp mồi fD1 và rD1, badAf và badAr

2.2 Hóa chất: tất cả các loại hóa chất được cung cấp bởi các h9ng có uy tín như Fermentas, Merck, Invitrogen, Sigma

2.3 Các phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật: phân lập, nuôi cấy VKQHT

và nghiên cứu đặc điểm sinh học của VKQHT theo Bergey (1989), đánh giá sinh trưởng của VKQHT theo mật độ quang học

ở bước sóng 660 nm và hàm lượng protein

2.3.2 Phương pháp hóa sinh: tách chiết enzym (Geissler và đtg, 1988),

tinh sạch protein bằng phương pháp sắc kí ái lực, điện di protein, xác định hàm lượng protein (Bradford, 1976), xác định hoạt độ

Burk)

2.3.3 Phương pháp sinh học phân tử: tách chiết DNA genom và

plasmid, kỹ thuật PCR, điện di DNA, nối ghép gen, biến nạp, tinh sạch DNA, biểu hiện gen (Sambrook và Russell, 2001)

2.3.4 Phương pháp phân tích hóa học: các hợp chất thơm (chiết bằng

dung môi và đo hấp thụ cực đại ở bước sóng vùng tử ngoại), ion

2.3.5 Phương pháp thống kê sinh học

Chương 3 Kết quả và bàn luận 3.1 Tuyển chọn các chủng VKQHT có khả năng sinh trưởng

trên môi trường chứa benzoate

Từ nước và trầm tích của 7 nguồn thải khác nhau, chúng tôi đ9 tách

và làm sạch được 32 chủng VKQHT có khả năng sinh trưởng trên BA ở những mức độ khác nhau Trong đó, có 9 chủng có khả năng sinh trưởng mạnh trên hợp chất này là: NMS49, MI1, VH121, VA31, QP21, NĐ71, NMG16, ĐG217 và ĐG218 Các chủng này được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo

3.2 Khả năng phân hủy và sử dụng một số hợp chất thơm đơn

3.2.2 Khả năng sử dụng BA và 4-OHBen

3.2.2.1 Khả năng sử dụng BA và 4-OHBen

Khi môi trường có bổ sung BA hoặc 4-OHBen ở nồng độ từ 2ữ10

mM, sự tích luỹ sinh khối của cả 9 chủng VKQHT nghiên cứu đều tăng lên so với đối chứng (chỉ chứa acetate - AA- là nguồn C) sau 96 hoặc 48 giờ nuôi cấy Sự sinh trưởng của chúng giảm dần và dừng lại khi nồng

độ hai hợp chất bổ sung này vượt quá 12 mM Khi BA hoặc 4-OHBen

được thay thế cho các nguồn C khác như AA, succinate và ethanol, những chủng VKQHT này đều có khả sử dụng hai hợp chất thơm này là nguồn C duy nhất trong điều kiện quang dưỡng giống như một số

VKQHT đ9 được nghiên cứu trước đây (Gibson và Harwood, 1988,

1995; Sasikala và Ramana, 1998) Tốc độ sinh trưởng của chủng đại

diện MI1 trên môi trường chứa một số nguồn C (≈ 1 g/l) khác nhau

trong 9 ngày được trình bày ở Hình 3.1

Hình 3.1 Sinh trưởng của chủng MI1 trên

môi trường chứa một số nguồn C (≈ 1 g/l)

khác nhau: AA 17 mM (
); BA 8 mM

( ▲ ); 4-OHBen 7,25 mM (●); không C (  )

Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện

quang dưỡng trong 9 ngày

chủng NMS49 và MI1 có khả năng phân hủy 91 và 99% chất này Kết

quả thu được phù hợp với các kết quả đ9 được công bố đối với các chủng

VKQHT phân lập ở các địa điểm ô nhiễm khác (Elder và đtg, 1992a;

Harwood và Gibson, 1988; Madigan và đtg, 1988)

3.2.3.1 Khả năng tồn tại và sinh trưởng của VKQHT trong môi trường

chứa các hợp chất chlorobenzoate (CBA)

Sau 96 giờ nuôi cấy, sinh trưởng của các chủng VKQHT bị ức chế

trong môi trường chứa 4-CBA/ 3-CBA/ 2-CBA ở nồng độ 4 mM và hầu

Thời gian (giờ)

Bảng 3.1 Khả năng phân hủy BA và 4-OHBen ở một số chủng VKHQT

Hợp chất thơm

Chủng

Hàm lượng

bị phân hủy (mM)

Hiệu suất (%)

Hàm lượng

bị phân hủy (mM)

Hiệu suất (%) NMS49 1,82 91 1,95 97,5 VH121 1,37 68,5 1,58 79 MI1 1,98 99 1,97 98,8 NMG16 1,76 88 1,83 91,3 QP21 1,38 69 1,85 92,6 VA31 1,41 70,5 1,80 90 NĐ71 1,76 88 1,88 93,8

ĐG218 1,78 89 1,83 91,3

ĐG217 1,45 72,5 1,95 97.5 Chú thích: các hợp chất thơm được thử nghiệm ở nồng độ 2 mM và được xác định lượng còn lại trong môi trường nuôi cấy sau

72 giờ

như dừng lại khi trong môi trường chứa > 8 mM Mặc dù sinh trưởng của các chủng VKQHT nghiên cứu không bị ức chế khi các hợp chất CBA ở nồng độ < 2 mM nhưng không quan sát được sự tăng sinh khối

so với môi trường chỉ chứa AA là nguồn C Tuy nhiên, sự tích lũy sinh khối của 8 chủng (trừ chủng ĐG217) với BA là nguồn C đều tăng lên so với đối chứng khi môi trường có bổ sung thêm các hợp chất CBA ở nồng

độ từ 0,5ữ2 mM Trong điều kiện này, các chủng VKQHT nghiên cứu (trừ chủng ĐG217) đều có khả năng sinh trưởng tốt trên 4-CBA/ 3-CBA/ 2-CBA ở nồng độ 1 mM (Hình 3.2)

BA BA + 4-CBA BA + 2-CBA BA + 3-CBA

Hình 3.2 Biểu đồ sinh trưởng của 9 chủng VKQHT trên môi trường chứa hỗn hợp BA và một trong các hợp chất CBA BA: benzoate 2 mM; BA + 4-CBA: benzoate 2 mM + 4-chlorobenzoate 1 mM; BA + 2-CBA: benzoate 2 mM + 2-chlorobenzoate 1 mM; BA + 3-CBA: benzoate 2 mM + 3-chlorobenzoate 1 mM

Tất cả 9 chủng VKQHT nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường cơ bản nhưng các hợp chất CBA được thay thế cho các nguồn C khác như AA, succinate hoặc ethanol đều không có khả năng sử dụng các hợp chất CBA là nguồn C duy nhất Tuy nhiên, sau 7ữ8 lần cấy chuyển liên tiếp sang môi trường chứa 3-CBA hai chủng NMS49 và VH121 có khả năng sử dụng 3-CBA là nguồn C duy nhất cho sinh trưởng quang dị dưỡng Kết quả này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu của một

số tác giả khác (Kamal và đtg, 1990; Oda và đtg, 2001, 2004; vander Woude và đtg, 1994)

3.2.3.2 ảnh hưởng của 3-CBA đến sự sinh trưởng của VKQHT trên môi

trường chứa một số nguồn carbon khác nhau

Các chủng vi khuẩn quang hợp tía

a Sinh trưởng trên môi trường chứa AA

Sinh trưởng của 5 chủng VKQHT (VH121, NMS49, NMG16, QP21 và VA31) trên môi trường bổ sung 3-CBA (1 mM) chậm nhưng vẫn đạt cực đại sau 72 giờ nuôi cấy tương tự như khi chúng sinh trưởng trên môi trường chứa AA là nguồn C Kết quả thu được còn cho thấy 3-CBA không những không làm tăng mà còn ức chế sinh trưởng của VKQHT ở giai đoạn đầu (từ 24ữ48 giờ) (Hình 3.3) Hiện tượng này có thể là khi có mặt AA trong môi trường nuôi cấy các chủng VKQHT không sử dụng 3-CBA

AA AA + CBA

AA AA + CBA

AA AA + CBA

AA AA + CBA

AA AA + CBA

Nguồn C trong mụi trường

b Sinh trưởng trên môi trường chứa 4-OHBen

Kết quả thu được cho thấy 3-CBA cũng ức chế quá trình sinh trưởng của các chủng VKQHT ở giai đoạn đầu (Hình 3.4) Tuy nhiên sau 72 giờ, hai chủng NMS49, và VH121 bắt đầu tăng sinh khối so với

đối chứng Sự tăng sinh khối này được nhận thấy một cách rõ rệt ở tất cả các vi khuẩn nghiên cứu sau 96 giờ Sự tăng sinh khối so với đối chứng ở các chủng khác nhau được thể hiện ở mức độ đồng đều 20ữ30% Như vậy, sinh trưởng của các chủng VKQHT cũng bị ức chế khi bổ sung 3-CBA ở giai đoạn đầu nhưng sau một thời gian thích nghi, quá trình sinh trưởng của chúng đều tăng

Nguồn C trong mụi trường

c Sinh trưởng trên môi trường chứa BA

Cũng như trên môi trường chứa AA hoặc 4-OHBen, sinh trưởng của 5 chủng VKQHT trên môi trường chứa BA (2 mM) bị 3-CBA ức chế

ở giai đoạn đầu (Hình 3.5) Nhưng sau 48 giờ, sinh trưởng của 3 chủng NMS49, VH121, NMG16 trong môi trường bổ sung 3-CBA (1 mM) bắt

đầu tăng lên so với đối chứng Tuy nhiên, các chủng khác nhau có sự tăng sinh khối ở mức độ không giống nhau so với đối chứng, trong đó chủng VH121 có sự tăng sinh khối cao nhất (52,8%)

mạnh ở các giai đoạn tiếp theo Kết quả thu được ở thí nghiệm này có thể là VKQHT cần một chất có vai trò như một đồng cơ chất (co-substrate) và một giai đoạn thích nghi để chúng có thể sử dụng được 3-CBA cho sinh trưởng Vai trò của một đồng cơ chất trong quá trình phân hủy một số hợp chất thơm chứa clo cũng đ9 được quan sát ở một số

vi khuẩn như Pseudomonas sp và R palustris (Haigler và đtg, 1992; Kamal và đtg, 1990; Oda và đtg, 2004)

3.2.3.3 Khả năng phân hủy 3-CBA của các chủng VKQHT

Năm chủng nghiên cứu đều có khả năng phân hủy hợp chất 3-CBA trên môi trường chứa nguồn C là BA hoặc 4-OHBen (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Khả năng phân hủy hợp chất 3-CBA bởi 5 chủng VKQHT

BA 4-OHBen Nguồn

C

Chủng

Hàm lượng 3-CBA còn lại (mM)

Hiệu suất (%)

Hàm lượng 3-CBA còn lại (mM)

Hiệu suất (%)

NMS49 0,176 82,4 0,555 44,5 VH121 0,017 98,3 0,533 46,7 NMG16 0,564 43,6 0,577 42,3 QP21 0,706 29,4 0,527 47,3 VA31 0,843 15,7 0,716 28,4 Chú thích: các hợp chất thơm được thử nghiệm ở nồng độ1 mM

Tuy nhiên, khả năng phân hủy 3-CBA trên hai nguồn cơ chất sinh trưởng BA và 4-OHBen của chúng rất khác nhau Trong cả hai trường hợp, chủng phân hủy 3-CBA yếu nhất là VA31 Khả năng phân hủy 3-CBA của các chủng còn lại gần như tương đương khi môi trường có mặt 4-OHBen Hai chủng NMS49 và VH121 có khả năng phân hủy mạnh hợp chất 3-CBA trong sự có mặt của BA Trong điều kiện này, chúng có khả năng chuyển hóa 3-CBA mạnh hơn khoảng 2 lần so với trên môi trường chứa 4-OHBen Cùng với sự tăng sinh khối, hàm lượng

Hình 3.6 Khả năng chuyển hóa 3-CBA của

chủng đại diện VH121 (■): nồng độ 3-CBA

thời gian thí nghiệm (144 giờ) (Hình 3.6) Chủng VH121 có khả năng phân hủy ≈ 50% lượng 3-CBA có trong môi trường sau 72 giờ và 1 mM hợp chất này được phân hủy hết sau 120 giờ trên môi trường chứa BA (1 mM).

Như vậy, 5 chủng trong nghiên cứu này đều có khả năng sử dụng 3-CBA là nguồn C cho sinh trưởng ở những mức độ khác nhau với đồng cơ chất là BA hoặc 4-OHBen Theo một số nghiên cứu, nhóm vi khuẩn VKQHT không những có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đơn giản mà còn có khả năng khoáng hóa các hợp chất thơm chứa clo như axit halocarboxylic, chlorobiphenyl và các hợp chất CBA (Kamal và đtg, 1990; Khanna và đtg, 1992; Oda và đtg, 2001, 2004)

Tóm lại, khả năng sinh trưởng trên một số hợp chất thơm đơn nhân

và sử dụng các chất này cho sinh trưởng ở những chủng VKQHT trong nghiên cứu này đ9 được xác định Đồng thời, khả năng phân hủy BA, 4-OHBen và 3-CBA cũng đ9 được khảo sát trong điều kiện các hợp chất này được sử dụng là nguồn C duy nhất hoặc đồng chuyển hóa Tổng hợp kết quả nghiên cứu khả năng tồn tại, sinh trưởng và sử dụng các hợp chất thơm theo các cơ chế khác nhau được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.3

3.3 Đặc điểm sinh học của một số chủng đại diện

Tế bào của các chủng NMS49, VH121 và MI1 có một số đặc điểm hình thái như những loài thuộc chi Rhodopseudomonas: có dạng hình gậy, kích thước 0,6ì1,7 ữ 1,25ì2,6 àm; chuyển động tịnh tiến, phân cực, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và phân chia tế bào bất đối xứng; dịch huyền phù của các chủng này có màu đỏ và có phổ hấp thụ cực đại ở: 375, 468, 493, 520-545, 589, 803-805, 862-868 nm Chúng có khả năng sinh trưởng hiếu khí trong tối nhưng khi đó khả năng tổng hợp bacteriochlorophyll a của chúng bị ức chế mạnh Trong môi trường nuôi cấy, tế bào của ba chủng NMS49, VH121 và MI1 thường tạo thành các cụm tế bào giống hình bông hoa như đ9 được mô tả đối với một vài