#ội dung nghiên cứu Các nghiên cứu được tiến hành ở 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Khởi động - Ảnh hưởng của hàm lượng BAP và αN AA đến khả năng phát sinh củ nhỏ từ mô vảy củ lily.. Giai đo
Trang 1NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
NHÂN GIỐNG HOA LILY BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO
Đỗ Minh Phú, Đoàn Thị Thùy Vân, Đặng Văn Đông, Trịnh Khắc Quang
SUMMARY
Improving lily sorbone propagation technology by
in vitro culture method
The present invention belongs to the field of biotechnology, and is tissue culture method to propagating great amount of Sorbone lily seedlings Sorbone lily scale as explant, after sterilization and cutting into blocks, is inoculated on culture medium with different plant hormones to induce callus and cespitose bud; callus and cespitose bud are proliferated in secondary culture medium until reaching seedling height of 5 cm and forming base bulb; and the seedling is transplanted in grown bulb medium The created and proliferation budlb culture medium includes MS supplemented NAA 0.01 mg/L and BAP 0.4 mg/L The grown culture medium includes MS NAA 0.2 mg/L and BAP 0.03 mg/L The culture conditions include temperature of 25 - 26 deg.C, illuminance of 2000 - 2200 lux, lighting 12 hr/day and pH 5.8
Keywords: Biotechnology, tissue culture, callus, bulb, hormones
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Hoa lily là loại hoa cao cấp, có vẻ đẹp
sang trọng, độ bền cao, hương thơm nhẹ
nhàng và màu sắc phong phú Từ lâu, loài
hoa này đã khẳng định được thế mạnh trên
thị trường thế giới Và đặc biệt, những năm
gần đây, tại Việt Nam hoa lily đã trở thành
loại hoa phổ biến trong những ngày lễ, Tết
cũng như những sinh hoạt thường nhật của
người dân
Hoa lily được nhân giống bằng nhiều
phương pháp khác nhau, trong đó phương
pháp nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
in vitro có nhiều ưu điểm vượt trội Kỹ
thuật này được áp dụng tại các quốc gia và
vùng lãnh thổ có ngành sản xuất hoa tiên
tiến trên thế giới như Hà Lan, Thái Lan, Đài
Loan, Trung Quốc Tuy nhiên, việc áp
dụng công nghệ này tại Việt Nam vẫn còn
nhiều hạn chế nên giá thành củ giống cao,
chất lượng vẫn còn thấp Mặc dù, những
năm gần đây một số cơ quan khoa học như:
Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học - Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Phân Viện Công nghệ sinh học Đà Lạt, Viện Nghiên cứu Rau quả đã và đang nỗ lực nghiên cứu nhân giống lily nhằm tạo ra những sản phNm tốt nhất với giá thành hợp
lý, tuy nhiên kết quả đạt được chưa cao Xuất phát từ những lý do trên, chúng
tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “ ghiên
cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy
in vitro”
Đề tài nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10/2007 đến tháng 6/2009 Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm nuôi cấy mô - Bộ môn Công nghệ sinh học và Vườn ươm thí nghiệm - Bộ môn Hoa cây cảnh - Viện N ghiên cứu Rau quả
Mục đích nghiên cứu: Từ những ưu, nhược điểm các nghiên cứu trước đó, dựa trên nền tảng của quy trình “tạo củ trực tiếp
từ lát cắt vảy củ - Viện Di truyền N ông
Trang 2nghiệp” Chúng tôi đã đặt ra mục tiêu của
đề tài:
- Lựa chọn quy trình tốt nhất, đơn giản,
dễ ứng dụng, có khả năng chuyển giao cho
mọi đối tượng, mọi điều kiện sản xuất
- Tối ưu hoá quy trình nhân giống cây
hoa lily cho từng đối tượng giống có triển
vọng và thích nghi với điều kiện khí hậu
của vùng đồng bằng sông Hồng cũng như
các tỉnh phía Bắc
- N âng cao chất lượng củ giống, hạ giá
thành sản phNm N ăng suất lớn, đủ khả
năng cung cấp giống cho thị trường
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
Là giống hoa lily Sorbone Đây là
giống hoa lily thơm, có màu hồng, nhập nội
từ Hà Lan, được Viện N ghiên cứu Rau quả
tuyển chọn và đã được Bộ N ông nghiêp và
Phát triển nông thôn công nhận giống chính
thức tháng 6/2009
2 #ội dung nghiên cứu
Các nghiên cứu được tiến hành ở 3 giai
đoạn:
Giai đoạn 1: (Khởi động)
- Ảnh hưởng của hàm lượng BAP và
αN AA đến khả năng phát sinh củ nhỏ từ mô
vảy củ lily
- Ảnh hưởng của nồng độ đường đến
phát sinh củ nhỏ từ mô vảy củ lily
Giai đoạn 2: (Sự phát triển củ nhỏ)
- Ảnh hưởng của hàm lượng tổ hợp
BAP và αN AA đến khả năng nuôi lớn củ
lily nhỏ
- Ảnh hưởng của nồng độ đường
Saccarose, than hoạt tính, nước dừa đến tốc
độ sinh trưởng của củ giống lily in vitro
Giai đoạn 3: (ngoài vườn ươm)
- Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng
bật chồi của củ giống lily in vitro
- Ảnh hưởng của một số loại phân bón
lá đến sinh trưởng của cây giai đoạn sau
in vitro
3 Phương pháp thí nghiệm
- Lựa chọn và tách các vảy củ từ củ lily mẫu với kích thước dài vảy từ 2-3 cm
- Khử trùng vật mẫu bằng H2O2 hoặc HgCl2
- Môi trường nuôi cấy:
+ Môi trường cơ bản: MS (Murashige and Skoog, 1962) có cải tiến về thành phần đường, agar
+ Môi trường khởi động, tạo củ ban đầu
có bổ sung tổ hợp BAP (6-Benzylaminopurine) hàm lượng 0,01-0,05 mg/l và αN AA (1-N aphtyl acetic acid) 0,1-0,5 mg/l
+ Môi trường nuôi lớn củ là môi trường
cơ bản trên với tổ hợp BAP và αN AA Hàm lượng thay đổi cho phù hợp với mục đích nuôi lớn củ
(BAP: 0,02-1 mg/l; αN AA: 0,1-03 mg/l)
Và các chất bổ sung như: than hoạt tính, nước dừa
- Môi trường được điều chỉnh về pH: 5,8
- N hiệt độ phòng nuôi: 260C ± 2
- Độ Nm không khí: 45 - 50%
- Toàn bộ vật mẫu được đặt trong môi trường tối suốt quá trình nuôi
III KẾT QUẢ N GHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1 Kết quả và những đánh giá chủ yếu ở
giai đoạn in vitro
Ở giai đoạn 1, khi tiến hành tạo vật liệu khởi đầu Căn cứ vào các kết quả nghiên
Trang 3cứu cho thấy: tổ hợp BAP với αNAA ở hàm lượng 0,01 mg/l cho kết quả tốt nhất
Bảng 1 Ảnh hưởng của hàm lượng BAP và α AA đến khả năng phát sinh củ nhỏ
Công thức thí nghiệm αNAA (mg/l) BAP (mg/l) Số củ thu được TB/1 mẫu
A1
0,01
Từ kết quả trình bày tại bảng 1 chúng ta
nhận thấy, tỷ lệ tạo củ nhỏ tăng dần với hàm
lượng của BAP có mặt trong môi trường từ
0,1-0,4 mg/l Khi tăng hàm lượng BAP vượt
ngưỡng 0,4 mg/l, tỷ lệ tạo củ giảm rõ rệt từ
3,32 củ/1mẫu xuống còn 2,81 củ/1mẫu Từ
kết quả này cho chúng ta thấy tác động của
tỷ lệ tổ hợp BAP và αNAA lên khả năng tạo
củ nhỏ Khi tỷ lệ này mất cân đối sẽ có tác
động gây ức chế đến mẫu nuôi cấy
Với tỷ lệ BAP và αNAA là (0,4:
0,01 mg/l) đã cho chúng ta kết quả tạo củ
nhỏ tốt nhất Tuy nhiên thời gian tạo củ khá lâu từ 40-60 ngày, cũng như tỷ lệ phát sinh củ trên một mẫu còn thấp Vấn đề đặt
ra là cần rút ngắn thời gian tái sinh của mẫu, nâng cao chất lượng của củ tạo ra Kết quả ở bảng 2 dưới đây cho thấy nếu ta thay đổi hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy sẽ rút ngắn được đáng kể thời gian phát sinh mẫu cũng như tăng tỷ
lệ phát sinh củ trên một mẫu nuôi cấy Từ
đó rút ngắn được thời gian cho toàn bộ quá trình nuôi cấy
Bảng 2 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến phát sinh củ nhỏ từ mô vảy củ lily
Công thức thí nghiệm Saccarose (g/l) Số ngày sau cấy mẫu
phát sinh củ nhỏ Số củ TB/mẫu
Khi hàm lượng đường tăng dần, thời
gian phát sinh củ nhỏ được rút ngắn từ 5
cho đến 20 ngày Tuy nhiên tỷ lệ tạo củ
chỉ đạt cao nhất khi hàm lượng đường có
trong môi trường là 90 g/l Điều này cho
thấy: hàm lượng đường có tác động rất
lớn đến tỷ lệ tạo củ nhỏ Trong nghiên
cứu quy trình ứng dụng sản xuất, bên
cạnh các chỉ tiêu về chất lượng, yếu tố
thời gian cũng như sản lượng luôn luôn là
Trang 4Bảng 3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α AA đến khả năng phát triển củ lily in vitro
Công thức
thí nghiệm
Số lượng mẫu
αNAA (mg/l)
BAP (mg/l)
Khối lượng củ ban đầu (g)
Khối lượng củ sau 60 ngày nuôi (g)
0,2
Từ những kết quả nghiên cứu, chúng
tôi nhận thấy BAP kết hợp với 0,2 mg/l
αNAA cho kết quả tăng trưởng tốt nhất
Tương tự như nghiên cứu về khả năng tạo
củ nhỏ, kết quả của nghiên cứu này cũng
cho thấy tỷ lệ của tổ hợp BAP và αNAA tác
động rất mạnh lên mẫu nuôi cấy Với hàm lượng của αNAA là 0,2 mg/l, hàm lượng của BAP tăng dần từ 0,01 -1 mg/l đã cho những kết quả rất khác nhau Và đạt được kết quả tốt nhất ở công thức C7 với tỷ lệ BAP: αNAA là 0,03 : 0,2 mg/l
Bảng 4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường, nước dừa và than hoạt tính
đến sinh trưởng của củ lily in vitro
CTTD
Khối lượng củ ban đầu
(g)
Khối lượng củ sau 60 ngày nuôi (g)
Đường Saccarose (g/l)
Nước dừa (ml/l)
Than hoạt tính (g/l)
Từ kết quả ở bảng 4 cho thấy để tăng chất
lượng củ lily in vitro, làm tăng khối lượng củ
tốt nhất, hàm lượng của đường có trong môi
trường là 120 g/l, hàm lượng của nước dừa là
10 ml/l và than hoạt tính là 1,0 g/l
Ảnh 2 Củ lily in vitro sau 60 ngày nuôi
2 Giai đoạn ra ngôi ngoài vườn ươm
Củ đưa từ ống nghiệm ra đất đạt tỷ lệ sống cao sẽ quyết định khả năng ứng dụng của kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp này vào sản xuất củ giống Chính vì vậy, chỉ tiêu đầu tiên và quan trọng nhất của khâu này là xác định được giá thể đưa cây
từ in vitro ra ex vitro Kết quả thu được thể
hiện ở bảng 5
Trang 5Bảng 5 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng bật chồi và sinh trưởng của cây
CTTN Tỷ lệ bật chồi
(%)
Chiều cao cây (cm)
Số lá (cái)
Đường kính củ sau thu hoạch vụ đầu (cm)
Ghi chú: 3 khay/công thức, 30 cây/khay
CT1: Trấu hun + đất phù sa; CT2: Sơ dừa + trấu hun; CT3: Sơ dừa nghiền nhỏ
CT4: Đất phù sa; CT5: Sơ dừa + đất phù sa
Kết quả cho thấy công thức 3 và 4 cho
kết quả tốt nhất Đặc biệt là công thức 3 với
tỷ lệ bật chồi đạt 85,4%, đường kính củ sau
thu hoạch đạt tới 2,3 cm vượt trội so với các
công thức khác, đặc biệt các chỉ số về sinh
trưởng như chiều cao cây cũng như số lá
trên một cây đều đạt chỉ số theo dõi cao
nhất Kết quả này cho thấy, củ lily in vitro
trong giai đoạn vườn ươm cần được trồng
trong môi trường thoáng, xốp và giàu oxi Tuy nhiên phải giữ Nm và thoát nước tốt
Để nâng cao chất lượng cũng như tăng cường khả năng sinh trưởng của cây Trong thời gian vườn ươm, ngoài nghiên cứu các chỉ số về giá thể, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại phân bón lá đến sinh trưởng và phát triển của cây
Bảng 6 Ảnh hưởng của phân bón lá đến sinh trưởng của cây ngoài vườn ươm
CTTN Công thức TN Chiều cao cây
(cm)
Số lá (cái)
Đường kính củ sau thu hoạch
vụ đầu (cm)
Kết quả thu được, trên bảng 6 cho
thấy việc sử dụng các chế phNm phân bón
lá có tác động không đồng đều ở các công
thức khác nhau, một số công thức còn cho
thấy ảnh hưởng xấu đến cây trồng khi so
sánh các chỉ tiêu với đối chứng Tuy
nhiên, phân bón lá “Đầu trâu 502” cho kết
quả khá tốt, các chỉ số như số lá, đường kính củ sau thu hoạch đều cao hơn so với đối chứng Với công thức này, sinh trưởng và phát triển của cây đều vượt trội
so với các công thức khác, đặc biệt là khả năng chịu nhiệt, khi trồng vào các tháng
có nhiệt độ cao
Trang 6Ảnh 3 Củ lily giống Sorbone được xử lý trước khi đưa ra vườn ươm
Trang 7T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
IV KẾT LUẬN
Điều kiện tối ưu cho nhân giống hoa lily Sorbone bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in
vitro là:
- Môi trường cho tạo củ nhỏ lily là: MS + 90 g/l Sacarose + 0,01 g/l NAA + 0,4 mg/l BAP + 6 g/l agar
- Môi trường nuôi lớn củ nhỏ lily là: MS + 120 g/l Sacarose + 0,2 mg/l NAA + 0,03 mg/l BAP + 100 ml/l CW + 1 g/l than + 6 g/l agar
- Nền giá thể tối ưu cho giai đoạn vườn ươm: Sơ dừa nghiền nhỏ
- Phân bón cho cây lily giai đoạn vườn ươm: Phân Đầu trâu 502
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1 Cao Thị Huyền Trang, Dương Minh ga, Đỗ Minh Phú, Đỗ ăng Vịnh, Hà Thị Thuý,
2006 Nghiên cứu tạo củ trực tiếp từ lát cắt vảy củ lily in vitro, T/C Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn 2006/Số 8
2 Dương Tấn hựt, 2006 Hệ thống nuôi cấy bioreactor trong công nghệ sinh học thực
4 (3): 265-283
3 Dương Tấn hựt, Đỗ ăng Vịnh, 2004 Nuôi cấy lỏng và nuôi cấy thoáng khí trong việc gia tăng sự tái sinh chồi và nâng cao chất lượng cây hoa lily (Lilium
longiflorum) Tạp chí Công nghệ sinh học, 2 (4): 487-499
4 guyễn Thị Phương Thảo, 1999 Nghiên cứu tạo củ giống hoa loa kèn trong ống
nghiệm, Tạp chí N ông nghiệp, Công nghiệp, Thực phNm 2/1999 82-84
5 Takateru Ishimori, Yoshiji iimi, Dong-Sheng Han, 2009 In vitroflowering of Lilium
rubellum Baker Scientia Horticulturae, 120, 246-249
6 Rong-Yan Xu, Yoshiji iimi, Dong-Sheng Han, 2006 Changes in endogenous abscisic acid and soluble sugars levels during dormancy-release in bulbs of Lilium rubellum
Scientia Horticulturae, 111, 68-72
7 J.M.Van Tuyl, M.P Van Dien, M.G.M Van Creij, T.C.M.Van Kleinwee, J.Franken
and R.J.Bino: Application of in vitro pollination, ovary culture, ovule culture and
embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses
Plance Science, 74 (1991) 115-126 Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd
#gười phản biện: Trần Duy Quý
