Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học cây xạ đen (celastrus hindsii benth & hook ) và cây cùm rụm răng (ehretia dentata courch

Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học cây Xạ đen (Celastrus hindsii benth. & hook. ) và cây Cùm rụm răng (Ehretia dentata courch)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC

X W

NGUYỄN HUY CƯỜNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ THĂM DÒ

Công trình được hoàn thành tại: Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1 GS TSKH Trần Văn Sung

2 Trịnh Thị Thuỷ

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Quang Đạt

Phản biện 2: GS.TSKH Phạm Trương Thị Thọ

Phản biện 3: PGS.TS Phạm Quốc Long

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: Phòng họp –Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ, 18-Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2009

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện quốc gia

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH

CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ

1 “Nitril glucoside, flavonol glucoside and polyphenolic acids

from Ehretia dentata Courch” Tap chi Hoa hoc (Vietnamese

Journal of Chemistry), 45 (2), 228-232, 2007

2 “Triterpenes from Celastrus hindsii Benth” Tap chi Hoa hoc

(Vietnamese Journal of Chemistry), 45 (3), 373-376, 2007

3 “Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phenolic glycosit

và triterpen từ cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth.)” Tạp chí

Hoá học, 46 (2), 224-228

4 “Isolation and chracterization of triterpens and phenolic

glycoside from Celastrus hindsii Benth” International

Workshop on Herbal Medicinal Plants and Traditional Herb Remedies, 20-21 September 2007, Hanoi, Vietnam, p 85

Công trình được hoàn thành tại: Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1 GS TSKH Trần Văn Sung

2 TS Trịnh Thị Thuỷ

Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Quang Đạt

Phản biện 2: GS TSKH Phạm Trương Thị Thọ

Phản biện 3: PGS TS Phạm Quốc Long

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: Phòng họp - Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18-Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Vào hồi 9 giờ ngày 24 tháng 4 năm 2009

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện quốc gia

A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Ý NGHĨA CỦA LUẬN ÁN

Cây Xạ đen theo cách gọi tên của người dân tộc Mường Hoà

Bình trên thực tế gồm một số cây khác nhau như: Celastrus hindsii,

Ehretia dentata, Ehretia asperula…có tác dụng chữa các bệnh liên

quan đến ung bướu là thành phần chủ yếu trong các bài thuốc gia truyền gồm trên 30 vị khác nhau Việc sử dụng các bài thuốc cổ truyền này trong nhiều năm trước đây đã cho kết quả tương đối khả quan Tuy nhiên cho đến nay mới chỉ có một số ít công bố [3,4,6,8] về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các cây này ở Việt Nam Do

đó, mục tiêu được đặt ra của luận án là: Nghiên cứu thành phần hoá

học và thăm dò hoạt tính sinh học của cây Xạ đen (Celastrus hindsii)

và cây Cùm rụm răng (Ehretia dentata) của Việt Nam

2 MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

+ Phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các chất có trong cây Xạ

đen (Celastrus hindsii) và cây Cùm rụm răng (Ehretia dentata) của

Việt Nam, đồng thời tiến hành một số chuyển hoá hoá học để làm

sáng tỏ cấu trúc của một số chất chính

+ Thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập được từ hai cây trên

3 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

3.1 Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác nhau rất rõ về thành phần

hoá học giữa cây Celastrus hindsii và cây Ehretia dentata

3.2 Từ lá và cành cây Xạ đen (Celastrus hindsii) thu hái tại Quảng

Bình đã phân lập và xác định cấu trúc của 11 chất có khung cacbon khác nhau:

• Bốn chất có khung friedelan là: 3α-friedelanol (86), friedelanon (87), D:A-friedo-oleanon-3,21-dion (88), canophyllol (89)

3-• Năm chất có khung lupan là: lup-20(29)-en-3β-ol (90),

lup-12-en-3β-ol (91), lup-20(29)-en-3-on (lupenon, 92),

lup-12-en-3-on (93) và lup-20(29)-en-3β,11β-diol (94)

• Hai hợp chất khác là: clionasterol (95) và axit glucosyringic (96)

3.3 Từ lá cây Cùm rụm răng (Ehretia dentata) đã phân lập và xác

định cấu trúc của 6 chất thuộc ba khung cacbon khác nhau:

• Nitril glycosid: (-)-ehretiosid A1 (97) [là một đồng phân quang

học của: (+)-ehretiosid A1] và lần đầu tiên được tìm thấy trong thiên nhiên

• Flavonoid glucosid: astragalin (98)

• Hai hợp chất phenolic khác: axit rosmarinic (99) và metyl rosmarinat (100)

• Đã xác định được thành phần chính của sản phẩm CH-1 từ lá

cây Cùm rụm răng (Ehretia dentata) (chiếm 0,566 % so với

mẫu khô) là: bauerenol (101) và α-amyrin (102) Qua phản

ứng oxy hoá CH-1 với CrO3 trong axit acetic băng bauerenol được chuyển hoá thành α-amyrin và thu được dẫn xuất 104,

105 Qua đó đã khẳng định được cấu trúc của hai triterpen gồm: bauerenol (101) và α-amyrin (102) là thành phần hoá

học chính của lá cây Cùm rụm răng

3.4 Đã bước đầu thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập được Kết quả cho thấy chất: lup-20(29)-en-3β,11β-diol (94) có hoạt tính tốt đối với chủng

Staphylococcus aureus

4 BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án gồm 117 trang với 3 chương, 12 bảng, 34 hình, 110 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 10, tiếng Anh: 100) và phụ lục gồm 43 hình phổ Luận án được bố cục như sau: mở đầu: 3 trang, tổng quan: 35 trang, thực nghiệm: 17 trang, kết quả và thảo luận: 46 trang, kết luận:

2 trang, danh mục công trình liên quan đến luận án: 2 trang

B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1 : TỔNG QUAN

Trong phần tổng quan, luận án đã tổng kết các công trình nghiên cứu ở trong nước cũng như trên thế giới về đặc điểm thực vật, ứng dụng trong y học cổ truyền, thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

về hai chi Celastrus và Ehretia Tóm tắt đặc trưng về cấu trúc hoá học

và hoạt tính nổi bật của các chất từ hai chi nghiên cứu Luận án đã tổng kết một số công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của triterpen, là thành phần hoá học chủ yếu của hai cây nghiên cứu

1.1 CHI CELASTRUS, HỌ CHÂN DANH

(CELASTRACEAE)

Các công trình công bố cho thấy thành phần hoá học chủ yếu của

chi Celastrus là các hợp chất friedelan triterpen và các sesquiterpen

dihydro β-agarofuran Hầu hết chúng đều là chất mới có cấu trúc rất

đa dạng và hoạt tính sinh học cao Tổng kết kết qủa nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các cây thuộc chi

Celastrus: C angulatus, C paniculatus, C stephanotifolius và đi sâu

hơn về thành phần hoá học cây Xạ đen (Celastrus hindsii)

1.2 CHI EHRETIA, HỌ VÒI VOI (BORAGIACEAE)

Khái quát chung về chi Ehretia

Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học cho thấy các hợp chất cyanonitril là thành phần hoá học đặc trưng của chi Ehretia Đây là các chất rất hiếm trong thiên nhiên và có nhiều hoạt tính sinh học thú

vị Tổng kết kết qủa nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính

sinh học của 4 cây thuộc chi Ehretia: E buxifolia, E microphyyla, E

2.3 Chiết, tách và số liệu phổ các hợp chất từ cây Xạ đen (Celastrus

hindsii: Mô tả chi tiết quá trình phân lập và liệt kê hằng số vật lý, số

liệu phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (EI-, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-, 13C-NMR) của các hợp chất phân lập được từ

lá và cành cây Xạ đen

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây Xạ đen (Celastrus hindsii)

Pha nước còn lại

-Chiết EtOH-H 2 O (90:10) x 3 lần -Cất loại dung môi EtOH

-Chiết lần lượt với: n-hexan,EtOAc,BuOH (3 lần) -Cất loại dung môi

Cặn chiết

n-hexan

(25,5g)

Cặn chiết BuOH

(15g)

Cặn chiết EtOAc

sephadex LH-20

Mẫu lá xạ đen khô xay nhỏ (600g)

F1,2 F3 F6 F-6, SKC XD-2 F-5, H-2

-Chiết lần lượt với: n-hexan,EtOAc,BuOH (3 lần) -Cất loại dung môi

Cặn chiết

n-hexan

(25,5g)

cặn chiết BuOH

(55g)

Cặn chiết EtOAc

- 13 pđ (F-1-F-13) -SKC lặp lại, hoặc kết tinh

Mẫu cành xạ đen khô (1700g)

-SKC silicagel, EtOAc: MeOH (90:10- 10:90),

-Kết tinh lại trong MeOH

XD-3 (88)* XD-1 (94)**

F-3, SKC, kết tinh F-8, F-9, SKC

2.4 Chiết, tách, tinh chế và số liệu phổ của các hợp chất từ cây Cùm

rụm răng (Ehretia dentata)

Hình 2.3 Sơ đồ chiết và phân lập các chất từ lá cây Cùm rụm răng

Pha nước còn lại

-Chiết EtOH-H 2 O (90:10) x 3 lần -Cất loại dung môi EtOH

-Chiết lần lượt với: n-hexan,EtOAc,BuOH (3 lần) -Cất loại dung môi

Mẫu lá khô, xay nhỏ

Ehretia dentata

(600g)

-SKC silicagel, n-hexan-EtOAc (90:10→80:20), 12 pđ

2.4.1 Mô tả chi tiết quá trình phân lập và liệt kê hằng số vật lý, số liệu phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (EI-, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-, 13C-NMR) của các hợp chất 97-100

2.4.2 Mô tả chi tiết quá trình phân lập và số liệu phổ của sản phẩm

CH-1 Phần tổng hợp một số dẫn xuất của sản phẩm CH-1 mô tả chi

tiết phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất của α-amyrin và số liệu phổ của các sản phẩm thu được

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương này biện luận và phân tích xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được bằng cách kết hợp các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) như: 1H-, 13C-NMR, DEPT và hai chiều (2D-NMR) như:

1H-1H-COSY, NOESY, HSQC, HMBC

3.1 Cây Xạ đen (Celastrus hindsii)

3.1.1 Xác định cấu trúc các chất được phân lập từ lá

Cấu trúc hoá học của các triterpen: 3α-friedelanol (86), friedelanon (87), 28-hydroxy-3-friedelanon (canophyllol, 89), lup-

3-20(29)-en-3β-ol (lupeol, 90), lup-12-en-3β-ol (91), lupenon (92) ; 12-en-3-on (93) được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp

lup-phổ: FT-IR, EI-, ESI-MS, phổ 1H- và 13C-NMR và so sánh với tài liệu (Bảng 3.1.1 và 3.1.2)

- 3α-Friedelanol (86): Kết hợp phổ khối ESI-MS (píc m/z 411

[M+H-H2O]+) và phổ 13C-NMR, DEPT đã xác định được công thức

phân tử của chất 86 là C30H52O Phổ hồng ngoại FT-IR cho hấp thụ mạnh, đặc trưng với đỉnh rộng, tù của nhóm OH (3478 cm-1) Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy phân tử có 30 nguyên tử cacbon bao gồm 8xCH3, 11xCH2, 5xCH, 6xCq Kết hợp công thức phân tử (C30H52O)

và phổ 13C-NMR, gợi ý cho thấy chất 86 là một triterpen có khung

friedelan Điều này cũng được khẳng định thêm qua 7 tín hiệu singlet của nhóm metyl gắn với cacbon bậc 4 và một dublet của nhóm metyl gắn với cacbon bậc 3 trong phổ 1H-NMR

- 3-Friedelanon (87): Phổ 1H- và 13C-NMR của 87 khá phù hợp so với 86, ngoại trừ khác biệt do có sự hiện diện của nhóm xeton (δC

213,2) và không thấy có tín hiệu của nhóm carbinol (CHOH) So sánh

số liệu phổ 1H- và 13C-NMR với các tài liệu đã công bố [12], đã xác

định được cấu trúc của chất 87 là 3-friedelanon

- Sản phẩm XD-2 (90+91): Sản phẩm ký hiệu là XD-2 chỉ cho một

vết tròn trên sắc ký lớp mỏng ngay cả khi chạy lặp lại 2-3 lần bằng các

hệ dung môi khác nhau và không thể tách tiếp bằng sắc ký cột Phổ FT-IR của XD-2 cho hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxy (3405cm-1)

Phổ khối EI-MS chỉ có một píc ion phân tử ở m/z 426 [M]+ (24) cho biết các chất này có cùng khối lượng phân tử Nhóm hydroxy ở vòng

A được khẳng định thêm qua các tín hiệu ở δH 3,21 (H-3α) và δC

79,01/79,03 (C-3) trong phổ 1H- và 13C-NMR Phổ NMR của đồng

phân có hàm lượng lớn hơn là chất 90 (chiếm gần 50 %) có tín hiệu

của một nhóm metylen có nối đôi (=CH2,δH 4,56; 4,68 và δC 109,33;

150,95), trong khi chất có hàm lượng thấp hơn là chất 91 (chiếm gần

35 %) chỉ có một proton gắn với nối đôi (>C=CH-, δH 5,18 và δC

121,75; 145,19), các tín hiệu còn lại của hai chất khá tương tự nhau

Cấu hình tại C-19 được thấy rõ qua tín hiệu dublet của triplet ở δH2,37

(dt, J=11,1; 5,8 Hz, H-19β) Để khẳng định thêm cấu trúc của hai chất này chúng tôi đã tiến hành axetyl hoá sản phẩm XD-2 bằng anhydrit axetic trong pyridin ở nhiệt độ phòng để thu được dẫn xuất axetat (ký hiệu là XD-2Ac) Kết hợp các phương pháp phổ và chuyển hoá hoá học chúng tôi đã xác định được cấu trúc của hai triterpen, thành phần

chính của XD-2 là lupeol (90) và lup-12-en-3β-ol (91)

- Sản phẩm H-2 (92+93): Phổ FT-IR của H-2 cho hấp thụ đặc

trưng của nhóm xeton (1708 cm-1) Phổ khối EI-MS có píc ion phân tử

ở m/z 424 [M]+ cho biết chất này có cùng khối lượng phân tử và có ít

hơn chất 90 và 91 hai nguyên tử hidro, gợi ý cho thấy có thể đây là

hỗn hợp của lupeon và lup-12-en-3-on Phổ 1H- và 13C-NMR của H-2

(92+93) rất giống với phổ của XD-2 (90+91), chỉ khác là phổ của H-2

không có tín hiệu của nhóm >CH-OH mà thay vào đó là tín hiệu của nhóm xeton (δC216,76/216,71) Các tín hiệu khác ở δC 120,51; 144,3

cho thấy chất có hàm lượng lớn hơn (93) có nối đôi ở C12=C13 (Δ12),

trong khi chất có hàm lượng nhỏ hơn (92) có nối đôi ở C20=C29

[Δ20(29)], được thấy rõ qua cặp tín hiệu ở δC149,81 (C-20) và 108,40 (C-29) Các tín hiệu còn lại của hai chất khá tương tự nhau Sự xuất

hiện của sản phẩm XD-2 (90+91) và H-2 (92+93) có thể giải thích

được bởi quá trình sinh tổng hợp các hợp chất triterpen trong tự nhiên

3.1.2.Các chất được phân lập từ cành cây Xạ đen

- D:A-friedo-oleanan-3,21-dion (21-oxofriedelan-3-on, 88): Phổ FT-IR của chất 88 cho hấp thụ của nhóm xeton (>C=O, 1710 cm-1)

Phổ khối EI-MS cho píc ion phân tử ở m/z 440 [M]+, kết hợp với phổ

13C-NMR và DEPT đã xác định được công thức phân tử của chất 88 là

C30H48O2 Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy chất 88 có 30 cacbon bao

gồm: 8xCH3, 10xCH2, 4xCH, 8xCq (có 2 nhóm xeton δ 218,85 và

212,96 ppm) Phổ 1H-NMR có một metyl dublet (δ 0,89, d, J=6,5 Hz,

Me-23), bảy tín hiệu đơn của nhóm metyl gắn với cácbon bậc bốn (δ

0,73, 0,88, 1,05x2, 1,08, 1,17, 1,16) và có hai nhóm metylen cạnh xeton (δ 2,41, 1H, ddd, J= 5, 7, 14 Hz, H-2A; 2,31, 1H, dd, J= 7; 14

Hz, H-2B và δ 2,60, 1H, d, J= 13 Hz, H-22A; 1,81, 1H, d, J= 13 Hz,

H-22B) Để xác định chính xác vị trí của hai nhóm xeton chúng tôi đã

sử dụng phổ hai chiều HMBC, NOESY và 1H-1H-COSY Phổ HMBC cho thấy các tương tác xa của C-3 như sau: δ 212,96/Me-23 (δH 0,89), H-2A,B (δH 2,41; 2,31) và C-21(δC 218,85)/Me-28 (δH 1,16), Me-29 (δH

1,17), H-18 (δ 1,82) Như vậy cấu trúc của chất 88 được xác định là

D:A-friedo-oleanan-3,21-dion (21-oxofriedelan-3-on) Chất này lần

đầu tiên được phân lập từ cây Kokoona zeylanica và được bán tổng hợp từ D:A-friedo-oleanan-3-on-21-ol và 3α,21α-diacetoxy-D:A-

friedo-oleanan qua phản ứng oxy hoá bằng CrO3 [92]

H 1

2

3

6 7

8 9 10 11 12 13 14 15 16

17 18

19 20

21 22

O

89: Canophyllol

1 2

3

4 5 6 7 8

9 10

11 12 13 14 15 16

17 18

20

21 22

H

91: R = H, Lup-12-en-3β -ol

91a: R = Ac, Lup-12-en-3β-yl axetat

- Lup-20(29)-en-3β,11β-diol (94): Phổ FT-IR của chất 94 có hấp

thụ đặc trưng của nhóm hydroxy (3363 cm-1) và olefinic metylen (>C=CH2, 1641, 3070 cm-1) Phổ EI-MS có pic ion phân tử ở m/z 442

Phổ khối EI-MS có ba mảnh ion quan trọng tại m/z 219 (13), 203

(17), 189 (25), gợi ý cho thấy đây là một triterpen có khung lupan

H

1 2 3

4 56 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

19 2022

23 24

Mảnh ion m/z 203 cho thấy có một nhóm hydroxy ở vòng A-B; ion

m/z 219 được tạo thành bởi sự phân cắt vòng C, cho thấy nhóm

hydroxy thứ hai gắn ở vòng C-E (Hình 3.4) Phổ 1H- và 13C-NMR của

94 là khá phù hợp với số liệu phổ của lup-20(29)-en-3β,11α-diol

(94a), ngoại trừ có sự thay đổi đáng kể về độ chuyển dịch hóa học tại

C-11 và vùng lân cận (C-9 và C-12) Tương tác không gian của H-11α

/H-3α, Me-27, Me-30 cho thấy cấu hình tương đối của nhóm OH-11

là β và kết luận được cấu trúc của 94 là lup-20(29)-en-3β,11β-diol

- Clionasterol ( γ-sitosterol, 95): Phổ FT-IR của chất 95 cho đỉnh

hấp thụ rộng, tù ở 3410 cm-1 cho thấy phân tử có nhóm hydroxy Phổ

khối EI-MS có pic quan trọng ở m/z 273 [M-C10H21], cho thấy phân tử

dễ dàng bị phân cắt mạch nhánh So sánh phổ 13C-NMR của chất 95

với phổ của β-sitosterol ta thấy phổ của hai chất này phù hợp với nhau, nhưng có sự chuyển dịch đáng kể ở C-24, cho thấy cấu hình của

C3 được xác định là β-OH, và cấu hình của C24 là S

- Axit glucosyringic (96): Phổ khối ESI-MS (ion dương) của chất

96 có pic ion ở m/z 383 (100) [M+Na]+ Kết hợp với phổ 13C-NMR và

phổ DEPT đã xác định được công thức phân tử của chất 96 là

C15H20O10 Phổ ESI-MS có pic ion của aglycon ở m/z 199

[M+H-162]+ cho thấy phân tử có một gốc đường glucose Phổ 1H-NMR có hai singlet ở δ7,39 (H-2 và H-6) và tín hiệu singlet của hai nhóm metoxy ở δ3,92 (6H, 2xOCH3) Phổ HMBC có tương tác của C-4 và proton anome H-1' (δC 169,66/δH 5,09), trong khi C-7 có tương tác với

cả hai proton H-2, H-6 (δC 169,66/δH 7,39)