Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà

Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN HOÁ HỌC -

Nguyễn Duy Nhất

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACARIT TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở TỈNH KHÁNH HOÀ

Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ

Mã số: 62 44 27 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

HÀ NỘI - 2008

Công trình được hoàn thành tại:

Phản biện 1: PGS.TS VĂN NGỌC HƯỚNG

Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội

Phản biện 2: PGS.TS LÊ THỊ ANH ĐÀO

Trường ĐH Sư phạm Hà Nội

Phản biện 3: GS.TS.PHẠM THANH KỲ

Trường ĐH Dược Hà Nội

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại:

VIỆN HOÁ HỌC Vào hồi 9 giờ 00 ngày 03 tháng 06 năm 2008

Có thế tìm hiểu luận án tại thư viện: THƯ VIỆN QUỐC GIA

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1.1 Tính cấp thiết của luận án:

Việt Nam có hơn 3.000 km bờ biển với sự thay đổi môi trường sinh thái rất đa dạng, phong phú Trong số các tài nguyên sinh vật biển của Việt Nam thì nguồn rong biển, đặc biệt là rong nâu có ý nghĩa rất quan trọng Theo thống kê

chưa đầy đủ thì chỉ riêng chi Sargassum của ngành rong nâu ở nước ta đã có hơn

70 loài với sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm

Trong số các chất polysacarit có hoạt tính sinh học quí từ rong nâu thì fucoidan rất đáng được quan tâm nghiên cứu Fucoidan là một polysacarit sulfat

có cấu tạo gồm mạch chính chứa α-L-fucose sulfat, ngoài ra có thể có galactose, D-mannose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose và axít D-uronic Những nghiên cứu gần đây cho thấy fucoidan có hoạt tính chống đông cục máu, kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư, chống viêm khớp, giảm mỡ máu, ức chế miễm dịch…

D-Fucoidan chiếm khoảng 4-8% trọng lượng rong nâu khô Theo đó nước ta

có thể khai thác 400 đến 800 tấn fucoidan thô mỗi năm Ngoài ra, trong rong nâu còn có những chất polysacarit khác như alginat, laminaran Đây cũng là những sản phẩm quý dùng trong ngành chế biến thực phẩm và sản xuất mỹ phẩm Đẩy mạnh nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài rong biển Việt Nam, trong đó có rong nâu, tìm ra các công nghệ sử dụng, khai thác có hiệu quả chúng là hoàn toàn phù hợp với chiến lược phát triển kinh tế của Đảng và Chính phủ Đây là vấn đề có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế xã hội rất cao, phù hợp với xu hướng phát triển của quốc tế

Từ những lý do nêu trên, để hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan, nhằm khai thác nguồn tài nguyên biển dồi dào và để tạo ra những chế phẩm phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng chúng tôi đặt vấn đề thực hiện đề tài:

“ Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của polysacarit

trong một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hoà”

1.2.Mục tiêu của của luận án là:

- Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng vi sinh vật

kiểm định của các hợp chất polysacarit từ một số loài thuộc ba ngành rong biển là: rong đỏ, rong lục và rong nâu thu tại tỉnh Khánh Hoà

- Nghiên cứu thành phần polysacarit gồm: alginat, laminaran và

fucoidan của những loài rong nâu thu tại tỉnh Khánh Hoà có hoạt tính gây độc tế bào ung thư

- Nghiên cứu xác định đặc điểm cấu trúc của phân đoạn fucoidan

có hoạt tính gây độc tế bào từ rong nâu thu ở tỉnh Khánh Hoà

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

¾ Tìm ra một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hoà chứa fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào ung thư nhằm định hướng sử dụng làm nguyên liệu điều chế thuốc trị bệnh ung thư

¾ Tổng hợp các phương pháp chiết tách fucoidan trên thế giới, khảo sát các đặc tính hoá lý của fucoidan từ rong nâu Việt nam cung cấp các số liệu thực nghiệm nhằm định hướng cho việc sản xuất fucoidan ở Việt Nam

¾ Từ việc nghiên cứu xác định cấu trúc fucoidan, cung cấp những định hướng

về phương pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan và định lượng fucoidan từ rong nâu Việt Nam

¾ Qua nghiên cứu quan hệ cấu trúc hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan, cung cấp thêm cơ sở dữ liệu định hướng cho phương pháp sản xuất fucoidan dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư từ rong nâu Việt nam

1.4 Những đóng góp mới của luận án:

Luận án là công trình đầu tiên hoàn thành được các nghiên cứu sau:

¾ Đã phát hiện được 6 loài rong nâu phổ biến tại Khánh Hoà có hoạt tính gây độc tế bào ung thư và đã xác định được thành phần hoá học bao gồm các polysacarit (alginat, fucoidan, laminaran) của chúng

¾ Đã hoàn thành qui trình chiết fucoidan thô và tách một số phân đoạn fucoidan tinh hơn từ 5 loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hoà

¾ Đã nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và gây độc tế bào với tế bào ung thư màng tim, ung thư phổi và tế bào ung thư gan của một số loài rong biển phổ biến của Khánh Hoà và một số phân đoạn fucoidan từ chúng

¾ Đã sử dụng chương trình pascal và thiết bị LC-ESI-MS nhiều lần để nghiên

cứu xác định được cấu trúc của phân đoạn fucoidan từ sargassum swartzii và sargassum polycystum

¾ Xác định được khi fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào thì nhóm sulfat ở vị trí axial (C-4) là chủ yếu và trong mạch có chứa đơn vị cấu trúc hexose-axít glucuronic

1.5 Bố cục của luận án:

Luận án dày 142 trang với 19 bảng số liệu, 37 hình vẽ và 138 tài liệu tham khảo được kết cấu như sau:

Danh mục các từ viết tắt, danh mục bảng và hình vẽ: 8 trang Đặt vấn đề:

2 trang Tổng quan (chương I): 40 trang Đối tượng nghiên cứu và thực nghiệm (chương II): 23 trang Kết quả và thảo luận (chương III): 56 trang Danh mục các công trình đã công bố của tác giả có liên quan đến luận án: 1 trang Tài liệu tham khảo: 12 trang

Ngoài ra luận án còn có phần phụ lục gồm 80 trang

II NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương I: TỔNG QUAN

Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu tham khảo phần tổng quan trình bày các vấn đề sau:

- Giới thiệu chung về rong biển, thành phần hoá học, phân bố, sản lượng của rong biển trên thế giới

- Các cấu trúc của fucoidan đã được nghiên cứu

- Các nghiên cứu hoạt tính sinh học của fucoidan

- Các phương pháp chiết và sản xuất fucoidan trên thế giới

- Các phương pháp xác định thành phần hoá học của rong nâu và xác định cấu trúc của fucoidan đã được công bố

- Nhận xét chung về các phương pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan đã công bố, các khó khăn khi ứng dụng các phương pháp này vào nghiên cứu cấu trúc fucoidan từ rong nâu Việt nam, đề xuất giải pháp nghiên cứu cấu trúc fucoidan từ rong nâu Việt nam

Chương II: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Rong nâu gồm các loài phổ biến tại tỉnh Khánh Hoà, các loài rong khác ở Khánh Hoà và các vùng lân cận

Bảng 2.1 Tên loài rong và ký hiệu mẫu trong các thực nghiệm:

Loài rong Ký hiệu polysacarit sulfat trong khảo sát hoạt tính tính gây độc tế bào ung thư Ký hiệu fucoidan có hoạt

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

Chiết và tách phân đoạn các polysacarit:

Chiết các polysacarit :

Dựa vào các phương pháp chính để chiết polysacarit sulfat đã được công

bố, chúng tôi tiến hành chiết theo phương pháp sử dụng dung dịch axít loãng, kết tủa fucoidan từ dịch chiết bằng dung dịch Cetavlon 10% trong nước Kết tủa được

ly tâm, rửa với nước để tách laminaran và mannitol Dịch sau khi tủa fucoidan được cho chạy qua cột IRA-480, fucoidan còn sót lại sẽ được hấp phụ lên cột, nước qua cột được kết tủa laminaran bằng cách thêm vào 8 lần thể tích EtOH, dùng hệ thống màng siêu lọc (MWCO) ta xác định được trọng lượng phân tử trung bình của laminaran tách chiết theo phương pháp này nhỏ hơn 10kDa Với

loài S polycystum ta thu được mẫu laminaran ký hiệu là 50down Laminaran từ loài S swartzii ký hiệu là 50up, từ loài S mcclurei ký hiệu là Revf Kết tủa

cetavlon-fucoidan được cho vào dung dịch CaCl2 3M, NaCl 3M và đun nóng

600C khuấy liên tục trong 2 h, để yên qua đêm Kết tủa Cetavlon-fucoidan bị phá huỷ giải phóng ra fucoidan tan trong dung dịch, đồng thời canxi alginat được tách

ra dưới dạng kết tủa nếu có lẫn axít alginic

Ly tâm để thu dịch có chứa fucoidan Hai lần thể tích EtOH so với thể tích dịch lọc được đưa vào và khuấy trộn trong 30 phút Để yên qua đêm, kết tủa fucoidan được tạo thành

Gạn lọc thu kết tủa và tiếp tục rửa bằng EtOH 80% (v/v) đến khi không còn ion Cl- trong nước rửa, hút chân không đến khan nước và sấy kết tủa ở 450C,

áp suất -1 bar trong 18 giờ ta thu được các fucoidan có trọng lượng phân tử khác nhau, 9 fucoidan thô từ 9 mẫu rong nâu có ký hiệu là A1 đến A7, W2 và G1, 7 polysacarit sulfat từ 5 loài rong đỏ và 2 loài rong lục được ký hiệu là G2 đến G8 Hiệu suất chiết trung bình của fucoidan khoảng 40g /kg rong khô đối với rong khô

Tách phân đoạn fucoidan:

5g fucoidan thô chiết từ rong nâu Sargassum swartzii được hoà tan vào 1lít nước

Vừa khuấy vừa thêm cetavlon (cetyltrimetylammoniumbromid) 10% vào đến khi không còn tủa tạo thành (khoảng 60-80ml) Khuấy tiếp tục qua đêm Kết tủa được

ly tâm lấy ra Hoà tan tủa trong 600ml NaCl 0.5M khuấy đều qua đêm, tủa được tách riêng, Hai lần thể tích EtOH so với thể tích dịch lọc được đưa vào dịch lọc và khuấy trộn trong 30 phút Để yên qua đêm, kết tủa fucoidan được tạo thành Gạn lọc thu kết tủa và tiếp tục rửa bằng EtOH 80% (v/v) đến khi không còn ion

Cl- trong nước rửa, sau đó tiếp tục rửa kết tủa bằng aceton và sấy kết tủa ở 450C,

áp suất -1 bar trong 30 phút ta thu được phân đoạn F05 Tương tự như vậy với dung dịch 1, 1.5, 2, 2.5M NaCl thu được phân đoạn F10, F15, F20, F25 Fucoidan

từ Sargassum polycystum được giải phóng trên kết tủa với cetavlon bằng các dung

dịch NaCl 1M và 2M thu được hai phân đoạn PF10 và PF20

Dung dịch 10 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 2)

Dung dịch NaCl 1M khuấy 24 giờ, ly tâm

Dung dịch 15 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 3)

Dung dịch NaCl 1.5M khuấy 24 giờ, ly tâm

Dung dÞch 20FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 4)

Dung dịch NaCl 2M khuấy 24 giờ, ly tâm

Dung dịch 25 FUCOIDAN-CETAVLON (kết tủa 5)

Dung dịch NaCl 2.5M khuấy 24 giờ, ly tâm

(Nếu kết tủa còn thì tiếp tục rửa giải bằng dung dịch NaCl có nồng độ cao hơn)

Hình 2.2.1: Sơ đồ tách phân đoạn fucoidan trên kết tủa cetavlon

Sàng lọc hoạt tính:

Đánh giá hoạt tính kháng sinh (Antimicrobial assay)

Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng sinh, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu polysacarit trên phiến

vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vanden Berghe và Vlietlinck Mẫu thô

có MIC ≤ 200μg/ml, mẫu tinh có MIC ≤ 50μg/ml là có hoạt tính

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity activity assay)

Chất có hoạt tính thì giá trị IC50≤20μg/ml đối với chế phẩm thô và ≤4 μg/ml đối với chế phẩm tinh

Xác định thành phần hoá học:

Xác định độ ẩm, hàm lượng protein thô, chất béo thô theo AOAC

Chiết polysacarit từ rong nâu để xác định thành phần trong rong:

Thành phần các polysacarit của rong nâu được xác định theo các phương pháp của A I Usov và Tatiana N Zvyagintseva Bột rong khô được khuấy với dung dịch HCl 0.2M ở 700C trong 1giờ (tỉ lệ rong:dung dịch axít=1:200 w/v), ly tâm tách bã rong và chiết lại thêm một lần nữa điều kiện như lần trước Ly tâm tách dịch lọc trộn chung với lần chiết trước, thẩm tách với nước cất bằng MWCO 1kDa Dung dịch này dùng phân tích thành phần fucoidan và laminaran (ddA)

Bã rong còn lại nấu với dung dịch Na2CO3 3M cũng với tỉ lệ nước : rong như trên, đun ở 700C 1giờ dung dịch thu được dùng xác định hàm lượng alginat (ddB)

Xác định hàm lượng fucoidan bằng phương pháp so màu:

Đưa vào 1ml dung dịch sau khi thuỷ phân với H2SO4 0.5M ở 950C trong 2.5 giờ có chứa ít nhất 50μg methylpentose được đựng trong ống thử

(16x150mm) đã làm lạnh với nước đá 4,5ml hỗn hợp 1 thể tích nước và 6 thể tích axít sulfuric đậm đặc Hỗn hợp sau đó được làm ấm lên 20-22oC trong vài phút, giữ 3phút trong nước đang sôi, cuối cùng được làm lạnh bằng nước máy Đưa vào dung dịch để nguội 0.1ml dung dịch cystein hydrochloride (3% w/w trong nước), lắc đều Một màu vàng xanh nhạt xuất hiện và bền vững trong 24h

Hiệu số hấp thụ E3960-E4300 tỉ lệ với nồng độ methylpentose trong dịch đo, nồng độ methylpentose được tính theo chuẩn là dung dịch fucose

Hàm lượng fucoidan trong mẫu rong bằng tỉ số hàm lượng fucose trong mẫu rong chia cho hàm lượng fucose trong fucoidan chuẩn

% fucose trong dịch chiết (w/w)

% fucoidan trong dịch chiết (w/w)=

% fucose trong fucoidan chuẩn (w/w) (fucoidan chuẩn được chuẩn bị ở phần chiết và phân đoạn polysacarit)

Xác định hàm lượng laminaran

Tách laminaran ra khỏi dung dịch chứa polysacarit ion âm:

Dung dịch A chứa laminaran polyuronan và fucoidan được đưa qua cột

polyteflon Laminaran bị giữ lại trên cột, rửa nước qua cột đến khi hết tạo kết tủa

với cetavlon Dung dịch EtOH 15-20% được dùng để giải hấp laminaran, dung dich rửa giải đươc thêm 8 lần thể tích EtOH để kết tủa laminaran Ly tâm loại EtOH, sau đó acetone được đưa vào rửa tiếp hai lần nữa, kết tủa được sấy khô trong chân không, đây chính là lượng laminaran có trong dung dịch A

Xác định hàm lượng alginat:

Dung dịch B, polyuronat được tách khỏi dung dịch hỗn hợp polysacarite của rong nâu bằng kết tủa với axít acetic, tỉ lệ dung dịch: acid =50:30 Tủa keo axít alginic được ly tâm lấy ra, rửa bằng axít acetic40%, trung hoà bằng NaOH 1M, sau đó kết tủa alginat bằng 2 lần thể tích ethanol so với dung dịch alginat hoà tan, rửa kết tủa bằng ethanol 80%, tiếp theo aceton, sấy chân không ta thu được natri alginat

Xác định hàm lượng polyphenol trong rong biển:

6-10g bột rong được chiết với 250ml EtOH 80%(v/v) trong Soxhlet 32 giờ Hàm lượng polyphenol tổng được xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau 1ml dịch chiết, 2.5ml thuốc thử Folin-Ciocalteau được thêm vào trong ống 50ml Sau khi khuấy và để yên 3 phút; 7.5ml dung dịch

Na2CO3 20% được đưa thêm vào Sau khi lắc mạnh và để yên hai giờ ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch màu xanh trong cuvét có độ dày 0,5 cm tại bước sóng 765nm, đối chứng với mẫu trắng trên máy quang phổ UV-VIS Hàm lượng các hợp chất polyphenol được tính theo tanic axít

Phân tích thành phần đường của fucoidan:

a Mẫu fucoidan khô (0.2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào 0.02mg inositol, 0.3 ml TFA 2M, thuỷ phân trong 2h ở 120oC Cho bay hơi đến khô trong dòng khí ở nhiệt độ 40oC rồi thêm 0.5 ml MeOH cho bay hơi, lặp lại hai lần

b Cho vào trong ống nghiệm, có chứa sản phẩm fucoidan đã thuỷ phân, 0.3ml NaBH4 0.25M vừa pha xong trong NH4OH 1M rồi để yên 30 phút ở 20oC Thêm vào hỗn hợp phản ứng 0.5ml axít axetic 10% trong metanol, cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần

c Axetyl hoá các đường bằng 0.2ml dung dịch Ac2O:pyridin = 1:1(v/v) ở 100oC trong 20 phút Cho bay hơi hỗn hợp phản ứng, thêm vào 0.5ml toluen, cho bay hơi đến khô, lặp lại hai lần Chiết sản phẩm đã axetyl hoá bằng axetat etyl Xác định thành phần đường bằng sắc ký khí trên máy GC-17A Shimadzu, với các đường chuẩn Fuc, Rha, Xyl, Man, Glc, Gal được xử lý tương tự như xỷ lý mẫu

Xác định dạng của axít uronic

a Mẫu fucoidan khô (0.2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào 0.02

mg inositol, 0.3 ml TFA 2M, thuỷ phân trong 2h ở 120oC Cho bay hơi đến khô trong dòng khí ở nhiệt độ 40oC rồi thêm 0.5 ml MeOH, cho bay hơi, lặp lại hai lần

b Cho vào ống nghiệm có chứa sản phẩm fucoidan đã thuỷ phân, 0.3ml NaBH4

0.25M vừa pha xong trong NH4OH 1M rồi để yên 30 phút ở 20oC Thêm vào hỗn hợp phản ứng 0.5ml axít axetic 10% trong metanol cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần

URONIC AXIT

+C¸C ALDOSE

ALDONIC AXIT+C¸C ALDITOL

ALDONIC AXIT+NHùA

ALDONIC AXIT +HCl

ALDONOLACTON

NHùA ANIONIT

HCl NHùA

Hình 2.2.2: Sơ đồ xác định dạng của axít uronic

c Sản phẩm khô trong ống nghiệm được hoà tan bằng 3ml nước cất, dung dịch

đó được đưa vào cốc có chứa sẵn khoảng 0.3g nhựa trao đổi ion dạng acetat, khuấy đều trong một giờ, tách lấy phần dịch, lặp lại một lần nữa với khoảng 0.2g nhựa mới Nhựa của hai lần khuấy gom lại, rửa với nước cất khoảng 5 lần khối lượng nhựa

d Lacton hoá axít aldonic.Nhựa đã hấp thụ axít aldonic được rửa giải với 2ml HCl 1N khuấy 30 phút ở nhiệt độ phòng, nhựa đã giải hấp được lọc bỏ bằng giấy lọc Whatman GFA Dịch lọc được cho bay hơi đến khô ở 400C trong dòng khi đã được lọc sạch Giai đoạn bay hơi dung dịch HCl 1N này đã chuyển hoá axít aldonic thành aldonolacton Phần khô trong ống nghiệm được tiếp tục sấy khô trong chân không khoảng12 giờ có mặt KOH để loại bỏ hoàn toàn HCl

e Aldonolacton được hoà tan bằng vài giọt natri borat 10mM, pH=7.5 và 10mg NaBH4 trong 0.5ml đệm borat Phản ứng khử mở vòng lacton diễn ra trong 1giờ ở nhiệt độ phòng NaBH4 được loại bỏ bằng cách cho bay hơi với axít acetic băng đến khô, sau đó thêm 1ml axít axetic 10% trong metanol cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa Cho vào ống nghiệm 0.5 ml MeOH, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần

f Acetyl hoá giống như trong phần phân tích thành phần đường

Xác định thành phần acetat alditol bằng sắc ký khí trên máy GC-17A Shimadzu FID với cột không phân cực Chế độ nhiệt: 1600C, giữ 2 phút Tăng đến

2800C, 100C/phút, giữ 20 phút để rửa cột Các pic đường sẽ ra hết sau khoảng 7

phút, glucosamin nếu có sẽ ra ở hơn 8 phút

Trong luận án này, mẫu hỗn hợp fucoidan của Sargassum polycystum và Sargssum swartzii được trộn chung theo tỉ lệ 1:1 (w/w) để xác định thành phần

đường Cũng mẫu đó chuẩn bị mẫu để xác định axít uronic, tuy nhiên khi chạy sắc

ký khí ta chạy thành phần đường một lần, sau đó đưa chung mẫu xác định thành phần đường và mẫu xác định axít uronic vào cùng một lần chạy nữa Sự tăng lên của loại đường nào trong mẫu hỗn hợp so với mẫu xác định thành phần đường sẽ cho ta biết loại axít uronic nào có mặt trong fucoidan

Sự có mặt của alditol1 làm cho pic acetate alditol1 trong sắc ký đồ các thành phần đường của fucoidan có diện tích tăng lên, điều đó chúng tỏ dạng của axít uronic trong fucoidan chính là dạng của aldose1

Phương pháp phenol- axít sulfuric (Dubois-1956) xác định tổng cacbon hydrat

Đưa 1ml dung dịch có hàm lượng cacbon hydrat khoảng 10-100μg vào ống so màu, thêm 1ml phenol 4%, 5ml axít sulfuric đậm đặc khoảng 95.5% (d=1.84) được thêm nhanh vào (khoảng 10-20 giây), để yên 10 phút, sau đó lắc ống so màu và tiếp tục để yên 10-20 phút trong nước 25-300C, đo mật độ quang ở 487nm Chuẩn dùng dung dịch glucose hoặc galactose

Xác định hàm lượng sulfat và axít uronic

Phương pháp chuẩn độ đơn giản của Scott rất hữu dụng trong phân tích hàm lượng sulfat trong các polysacarit Phương pháp xác định được tiến hành như sau: fucoidan (0.5 mg) được hoà tan trong nước khử ion, chuẩn độ bằng dung dịch cetyl pyridium chlorid (cpc) 1% với microburet và quan sát trên nền đen Độ đục của dung dịch tăng dần lên đến khi kết tủa xuất hiện đột ngột Chuẩn độ song song hai mẫu: với fucoidan (0.5 mg) hoà tan trong dung dịch nước ta cần A ml dung dịch cpc, với fucoidan (0.5 mg) hoà tan trong dung dịch H2SO4 0.025M ta cần B ml cpc Hàm lượng sulfat được tính theo B và hàm lượng axít uronic được tính theo hiệu A - B

Các thiết bị phân tích hoá lý sử dụng trong các thí nghiệm

Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AVANCE 500 tại Viện Hóa học Tetrametylsilan (TMS) (cho 1H) hoặc tín hiệu dung môi (cho 13C) được dùng làm nội chuẩn Các mẫu fucoidan được đo với

D2O/0.1% CF3COOD Phổ hồng ngoại đo trên máy IMPACT 410 của hãng NICOLET (Mỹ) Mẫu được hoà tan lượng rất nhỏ trong methanol và phổ ESI-MS được đo trên thiết bị LC/MSD iontrap 1100 tại Viện Hoá học

2.3.Xác định cấu trúc fucoidan theo dữ liệu phổ khối ESI-MS nhiều lần:

Xác định cấu trúc đại diện của phân đoạn bằng dữ liệu phổ ESI-MS nhiều lần dạng ion dương, trên cơ sở các mảnh tạo thành từ phép đo MS3 phải có công thức phân tử và công thức cấu tạo chứa trong mảnh từ phép đo MS2 tương ứng Tương

tự các mảnh từ phép đo MS2 phải có công thức phân tử và công thức cấu tạo chứa trong mảnh từ phép đo MS tương ứng Giải pháp có thể tóm tắt theo các ví dụ sau Xét phân tử:

O H O H

O

OH O C

3

O OHO OH OH O

H O H H

OH O OH

O H

O O

H

H O

O S

Trọng lượng phân tử bằng: 98+164+180+194-3.18

Nếu mảnh cĩ cấu trúc như trên bị bắn phá trong quá trình chạy phổ ESI-MS, mất

đi e phân tử nước, kết hợp với n proton và f ion Na+ tạo thành mảnh cĩ điện tích bằng (n+f)+, số khối của mảnh được tính:

vị trí của fuc sẽ thay bằng Rha), axít uronic ký hiệu là uro, axít sulfuric ký hiệu là sul Một đoạn mạch gồm x phân tử fuc, y phân tử hex, z phân tử uro và t phân tử sulfuric axít, cĩ số khối là m/z bị bắn phá trong quá trình chạy phổ ESI-MS, mất

đi e phân tử nước, kết hợp với n proton và f ion Na+ tạo thành mảnh cĩ điện tích bằng (n+f)+, số khối của mảnh được tính như sau:

m/z = [x.164+y.180+z.194+t.98 –(x+y+z+t-1)x18 –e.18+1.n+23.f]/(n+f)

để tìm được các giá trị x, y, z, t, e, n, f ta lập bảng sau:

Bảng 2.1: bảng tính thành phần mảnh cho số khối 358

Khối lượng phân tử của đoạn mạch đầy đủ điện

tích Stt

x y z t x.164+y.180+z.194+t.98 – (x+y+z+t-1)x18

e n f

(n+f)

số khối

Thực tế khi tính tốn các khối lượng phân tử đường đơn là:

164.156: phân tử lượng của fuc

180.156: phân tử lượng của hex

194.139: phân tử lượng của axít uronic

98.079: phân tử lượng của H2SO4

18.015: phân tử lượng của H2O

Trong bảng chỉ ghi phần nguyên cho đơn giản

Cho các giá trị của x, y, z, t, e, n, f thay đổi từng đơn vị sẽ thu được hết các thành phần để mảnh có số khối 358 Tuy nhiên vấn đề rất khó khăn là số phép thử quá lớn và đôi khi đến vài năm cũng không đủ thời gian để tìm ra nghiệm Giải quyết vấn đề này luận án sử dụng chương trình pascal chạy trên máy vi tính tương đối mạnh để tìm hệ nghiệm Với một mảnh có số khối m/z, nếu xét đến mảnh có điện tích không quá 3 thì x không thể vượt quá q1=(3.m/z)/164, y không thể vượt quá q2=(3.m/z)/180, z không thể vượt quá q1=(3.m/z)/194 và t không thể vượt quá 2.x (chỉ xét gốc fucose nhiều nhất có 2 nhóm sulfat, tuy nhiên có thể thay đổi các giá trị này, đó là trường hợp mỗi fucose có đủ 2 sulfat ngoài ra sulfat còn có mặt ở các gốc hexose và axít uronic)

Đoạn chương trình pascal tính toán x, y, z, t cho một mảnh có số khối m/z được viết như sau :

{đặt f:=-(n-1) to 3 để khi n bắt đầu từ 0 thì f phải bắt đầu từ 1 nếu không mảnh sẽ

có điện tích ban đầu bằng không và chương trình bị lỗi chia cho 0}

có bao nhiêu tổ hợp nghiệm

Sau khi tìm được các hệ nghiệm tiếp tục tiến hành các bước tiếp theo:

Ví dụ:

Tìm "công thức cộng" :

Mảnh có số khối 358 bị bắn phá →341.3 + 283.2 + 209.2 +192.2 + 143.8

Mảnh 358.2 có 3 thành phần: