Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây diếp cá suối Gymnotheca Chinensis Decne và lá thành ngạnh trơn Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume ở Việt Nam
Trang 1Bộ giáo dục và đào tạo Viện khoa học
và công nghệ việt nam Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên
H
Hà à à V V Việt iệt iệt Sơn Sơn Sơn
Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học:
1 PGS.TS Hoàng Thanh Hương
2 PGS.TS Nguyễn Hữu Khôi
Phản biện 1: GS TSKH Phạm Trương Thị Thọ, Viện Dược liệu
Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Văn Đậu, ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội Phản biện 3: GS TSKH Trần Công Khánh, ĐH Dược Hà Nội
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt Vào 9 giờ 00 ngày 22 tháng 1 năm 2009
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc Gia Hà Nội
- Thư viện Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam
Trang 3Danh mục các công trình khoa học đã công bố
1 Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hương, Cầm Thị ính, Hà Việt Hải, Ametava Das (2005),
”Thăm dò ảnh hưởng của phân đoạn polyphenol chiết xuất từ lá Thành ngạnh trơn (Cratoxylon cochinchinense) lên sự đáp ứng chuyển dạng lympho bào”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Tập 43, số 6A, tr 110-113
2 Hoàng Thanh Hương, Cầm Thị ính, Hà Việt Sơn (2006), ”Khảo sát phần dịch chiết etyl axetat của lá Thành ngạnh trơn Cratoxylon cochinchinense (Lour.) Blume”, Tạp chí Hoá học, T44, số 1, tr 71-75
3 Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Hữu Khôi (2007), ”Các hợp chất phenolic từ cây diếp cá suối Gymnotheca chinensis Decne”, Tạp chí Dược học, số 379, tr 25-28
4 Hoàng Thanh Hương, Hà Việt Sơn, Nguyễn Hữu Khôi (2007), ”Một số hợp chất glycozit phân lập được từ cây diếp cá Suối Gymnotheca chinensis Decne (Saururaceae)”, Tuyển tập công trình Hội nghị hoá học hữu cơ toàn quốc năm 2007, tr 391-396
5 Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Hữu Khôi, Trần Thị Hiếu (2007), “Một số chất triterpen phân lập được trong phần chiết có hoạt tính chống viêm điều chế từ cây diếp cá suối (Gymnotheca chinensis Decne.)”, Tuyển tập công trình Hội nghị hoá sinh y dược năm 2007, tr.191-195
6 Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Hữu Khôi (2007), ”Khảo sát hoạt tính kháng viêm trên thực nghiệm và ảnh hưởng lên hoạt động cathepsin máu người của phần chiết ethylacetate từ cây thành ngạnh trơn Cratoxylon cochinchinense (Lour.) Blume”, Tuyển tập công trình Hội nghị hoá sinh y dược năm 2007, 187-190
7 Ha Viet Son, Hoang Thanh Huong, Nguyen Huu Khoi (2007), ”Xanthone derivatives from Cratoxylon cochinchinense”, International Workshop on Herbal Medicinal Plants and Traditional Herb Remedies, Hanoi, 20-21 September 2007
8 Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Hữu Khôi (2008), “Nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học cây diếp cá suối Gymnotheca chinensis Decne (Saururaceae)”, Tạp chí Hoá học, Tập 46, số 2, tr 138-141
9 Hà Việt Sơn, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Hữu Khôi, Cầm Thị ính (2008), “Hợp chất biflavonoid từ lá thành ngạnh trơn Cratoxylon cochinchinense (Lour.) Blume”, Tạp chí Dược học, số 387, tr.35-37
Trang 41
A Khái quát chung về luận án
1. Đặt vấn đề
Giá trị của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học không chỉ
ở công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà còn vì chúng có thể dùng làm các nguyên mẫu hoặc các cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới Thực vật bậc cao luôn là nhóm đối tượng đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học cao do sự đa dạng sinh học và hoá học của chúng Điều này đặc biệt có ý nghĩa với Việt Nam, một nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và nhiều kinh nghiệm trong việc dùng thuốc thảo mộc Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học là con đường ngắn và hiệu quả nhất để tìm kiếm các hoạt chất từ nguồn tài nguyên tái tạo này Những năm gần đây, yếu tố phiên mã NF-κB thu hút được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học do vai trò sinh lý quan trọng của nó trong tế bào, do sự đa dạng trong các nhân tố kích thích hoạt động của nó và sự liên quan trực tiếp tới cơ chế bệnh sinh của nhiều loại bệnh bao gồm cả tim mạch, hô hấp, các bệnh tự miễn, các bệnh viêm nhiễm và ung thư Các dược liệu và các chất có khả năng ức chế hoạt
động của NF-κB đã và đang trở thành một trong những đích quan trọng của việc tìm kiếm thuốc điều trị nhiều loại bệnh, đặc biệt là các thuốc chống viêm nhiễm, thuốc điều trị các bệnh tự miễn, thuốc sử dụng trong phòng và
điều trị ung thư
Dựa trên kết quả sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính ức chế hoạt
động của NF-κB và kinh nghiệm dân gian chúng tôi đã chọn hai cây diếp cá suối Gymnotheca chinensis Decne và thành ngạnh trơn (thành ngạnh nam) Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume là hai cây thuốc mọc hoang dại
có hoạt tính ức chế NFưκB và được sử dụng nhiều trong dân gian để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, viêm cấp và mãn tính là đối tượng nghiên cứu nhằm phát hiện hoạt chất và làm sáng tỏ cơ chế chống viêm của dược liệu
2 Nhiệm vụ của luận án bao gồm:
Điều chế và nghiên cứu hoá học các phần chiết chọn lọc của cây diếp cá suối Gymnotheca chinensis Decne và lá thành ngạnh trơn (thành ngạnh nam) Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume
Đánh giá hoạt tính ức chế NF-κB in vitro của các phần chiết chọn lọc và một số chất tinh khiết phân lập được
Trang 52
Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của các phần chiết liên quan đến hoạt tính ức chế NF-κB như tác dụng đáp ứng chuyển dạng lympho bào
in vitro và tác dụng kháng viêm in vivo
3 ý nghĩa khoa học, thực tiễn và những đóng góp mới của luận án 3.1 ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh trong dân gian của cây diếp cá suối Gymnotheca chinensis Decne và lá thành ngạnh trơn (thành ngạnh nam) Cratoxylum cochinchinense Blume Ngoài ra còn tạo cơ sở khoa học để
sử dụng chúng có hiệu quả và đóng góp vào hướng nghiên cứu thuốc gắn liền với tác dụng ức chế hoạt động của yếu tố phiên mã NF-κB
3.2 Những đóng góp mới của luận án
cây diếp cá suối Đã phân lập và xác định được cấu trúc của 14 chất, trong đó có một chất mới là gymnothezit (GT3, 14) và một chất đã được phát hiện từ sinh vật biển nhưng lần đầu tiên tìm thấy ở thực vật trên đất liền là curcudiol (GE7, 7)
cấu trúc 15 chất trong đó có hai chất mới là cratoxanton A (CE6, 20) và cratoxanton B (CE7, 21) Ngoại trừ mangiferin (CT5, 29), các hợp chất còn lại cũng lần đầu tiên được phân lập từ lá thành ngạnh trơn
sát hoạt tính ức chế sự hoạt hoá NF- κB in vitro của các phần chiết và một số chất phân lập được từ hai cây dược liệu
tính ức chế NF-κB như tác dụng ức chế chuyển dạng lympho bào in vitro, tác dụng chống viêm cấp (viêm cơ đùi chuột bằng dextran), viêm
chữa bệnh trong dân gian của dược liệu mà còn làm sáng tỏ cơ chế chống viêm của các phần chiết etylaxetat (GE & CE) đồng thời khẳng
định vai trò của NF–κB trong đáp ứng miễn dịch và đáp ứng viêm
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 130 trang, có 17 bảng và 28 hình minh họa Phần mở
đầu (2 trang), chương 1: tổng quan tài liệu (30 trang), chương 2: nguyên liệu
và phương pháp nghiên cứu (4 trang), chương 3: thực nghiệm (25 trang),
Trang 63
chương 4: kết quả và thảo luận (55 trang), kết luận (2 trang) Danh mục các công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang) Tài liệu tham khảo 11 trang với 128 tài liệu trong và ngoài nước Phần phụ lục với 84 hình phổ
B nội dung của luận án
Mở đầu
Phần mở đầu trình bày lý do chọn đề tài, đối tượng nghiên cứu và ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Chương 1 Tổng quan tài liệu
Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về:
Nghiên cứu phát triển thuốc chống viêm
2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất: Phần này trình bày các phương pháp
áp dụng để phân lập các chất tinh khiết như phân bố dung môi, sắc ký cột 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất: đã sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại như MS, UV, IR, 1D-NMR, 2D-NMR
2.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học:
Nghiên cứu tác dụng ức chế NF-κB in vitro theo phương pháp assay trên dòng tế bào RAW 264.7
Seap- Nghiên cứu ảnh hưởng của các phần chiết lên sự đáp ứng chuyển dạng lympho bào in vitro theo phương pháp của Mancini
Nghiên cứu tác dụng chống viêm trên động vật thực nghiệm: tác dụng chống viêm cơ, tác dụng chống viêm gan trên chuột bị nhiễm
Trang 7Mô tả chi tiết các quá trình:
Điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật
Nghiên cứu hoá học các phần chiết chọn lọc từ cây diếp cá suối
Nghiên cứu hoá học các phần chiết chọn lọc từ lá thành ngạnh trơn
Nghiên cứu hoạt tính sinh học
Chương 4: Kết quả và thảo luận
4.1 Điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật
nhỏ Bột khô nguyên liệu thực vật được tiến hành ngâm chiết ở nhiệt độ phòng 5 lần với MeOH (mỗi lần 3 ngày) Tổng dịch chiết được cất loại
EtOAc và n-butanol Cất loại dung môi các dịch chiết và đông cô phần nước thu được các phần chiết n-hexan, etylaxetat, n-butanol, nước ký hiệu là GH,
GE, GB, GN từ cây diếp cá suối (G chinensis) và CH, CE, CB, CN từ lá thành ngạnh trơn (thành ngạnh nam - C cochinchinense) Kết quả thử TLC cho thấy thành phần phần chiết n-butanol và nước khá giống nhau Bởi vậy nghiên cứu tiếp theo sẽ được tiến hành với các cặn tổng GB + GN ký hiệu là
Trang 85
Hình 4.2 Sơ đồ phân tách phần chiết GE1a
Kết tinh lại trong CHCl 3
Kết tinh lại trong CHCl 3
CC, SiO 2 , n-hexan/CHCl 3 / Me 2 CO (25/40/40)
TLC, SiO 2 , CHCl 3 /MeOH (6/1)
TLC, SiO 2 , CHCl 3 /MeOH (6/1) và kết tinh lại trong axeton
CC, RP-18, MeOH/H 2 O (98/2), TLC, SiO 2 , Me 2 CO/ EtOAc (1/1)
4.2.1.2 Xác định cấu trúc các hợp chất
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 11 hợp chất đ−ợc tách ra từ GE, các hợp chất này lần đầu tiên đ−ợc phân lập từ cây diếp cá suối
(1)
3 4
12 13 15 17
23 24
GE2 (β-amyrin)
(3)
HO
C O O H 1
6 7 9 10
14 15 17
GE3 (axit ursolic)
(4)
O
COOH
C O
H 3 C
1
6 8 10
15 17
23 24 25 29 30
GE4 (axit β-axetoxy ursolic)
B1
B2
B3
B4 (1b)
A CHCl3,
Trang 96
NH O O HN
7 6 5 4 3
12
(7)
GE7 (Curcudiol)
2 3 5
10 1' 2' 3' 4' 5'
O
O OH
6
10 1' 2' 3' 4' 5'
O
O OH
H 3 CO
(9)
GE9 (5-hydroxy-7, 4’-dimetoxy flavon)
2 3 5
10 1' 2' 3' 4' 5' 6'
O
O OH
H 3 CO HO
(10)
GE10 (5,6- dihydroxy-7-metoxy flavon)
1 3 4 5
10 2
3 1' 2' 3' 4' 6'
H OH OH H
H
H 3 CO HO OCH 3
OH OCH 3
Trang 106'
H O OH H
GT1 (lyoniresinol-3-α-L-rhamnopyranozit)
1'' O
OH OH
CH 2
C
OH OH
O O
OH
OH
2 ' a
1 3
5 6
α β
2'' 3''
1''' 2''' 3''' 4''' 5'''
GT2 (Isoacteoside)
1 3 5 7
OH
O
H
H OH
OH OH
1' 1''
4' 5'
2'' 3'' 4'' 5''
GT3 (1-(O-α- L-arabinopyranozyl (1-6) β-D-glucopyranozyl)- 4-(2-propenyl)benzen)
Chất mới đặt tên là gymnothezit
Xác định cấu trúc hoá học của chất mới GT3 (14)
Trang 11(ppm)
Vị trí
δδδ
J (Hz)
δδδ
J=9.0Hz, H-2 & H-6) và 7.13 ppm (2H, d, J=9.0Hz, H-3 & H-5) cho biết có mặt vòng thơm đối xứng với hai nhóm thế ở vị trí C-1 và C-4 Điều này được khẳng định qua phổ DEPT cũng như tương tác giữa H-2 & H-3, H-5 & H-6 trên phổ COSY và các tương tác giữa H-2 & H-6 với C-4 và H-3 & H-5 với C-1 trên phổ HMBC
(2-propenyl) Các tương tác giữa H-8 & H-7, H-8 & H-9 trên phổ COSY cũng như tương tác của các proton H-7 với C-9, C-3, C-5 và C-4 trên phổ HMBC
đã khẳng định cấu tạo của nhóm thế trên cũng như cho biết vị trí gắn kết với vòng thơm là C-4
Trang 129
11 cacbon của mạch đường đôi pentozylhexozơ Thuỷ phân axit GT3 và kiểm tra bằng TLC với các đường chuẩn đã xác định được các hợp phần của mạch
đường là D-glucozơ và L-arabinozơ Vấn đề đặt ra là phải xác định các vị trí, cấu hình liên kết glycozit cũng như dạng tồn tại của các đường đơn Tương
nhóm thế thứ hai là 1-O-[L-arabinozyl-(1-6)] D-glucozyl
Cấu hình liên kết (α- hoặc β-) và dạng tồn tại của các đường đơn (pyranozit hoặc furanozit) được xác định thông qua hình dạng và hằng số tương tác của tín hiệu ứng với các proton anome Vì tín hiệu cộng hưởng của H-1’ và H-1’’ đều ở dạng doublet với hằng số tương tác lớn (J~7.0Hz) nên nhóm thế gắn vào C-1 sẽ là 1-O-[ α-L-arabinopyranozyl - (1-6)] D-β-glucopyranozyl Như vậy cấu trúc của GT3 sẽ là 1-O-([α-L-arabinopyranozyl
- (1-6)] D-β-glucopyranozyl)-4-(2-propenyl) benzen Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và được đặt tên là Gymnothezit (14)
Trang 131 3 5 7
OH
O
H
H OH OH
1'
1''
(14)
2' 3' 4' 5'
2'' 3'' 4'' 5''
(1f) (3d)
Trang 14O OH
HO
2 3 5
10 1' 6' 5' 4'
3'
2'
(16)
CE2 ((+)- dihydro kaempferol)
OH
OH
OH
O O OH
HO
2 3 5
10 1' 6' 5' 4'
3' 2'
HO
2' 3' 4' 5' 6' 1'
10 9 8 6 4 2
CE4 (kaempferol)
9a 8
6
2
2' 5' 9
furano] xanton
9a 8 6
4 2
2' 3' 5'' 4' 9
2' 3'
5' 6'
9
(21)
3 4 5
7
9a
4a 8a
O
CE7 (4,5-dihydroxy-2,3
[2’-hydroxy-4,4’-dimetyl dihydro pyrano] xanton )
Chất mới, đặt tên là cratoxanton B
O HO
OH O OH
OH OH
(22)
2 3 5
10 1' 2' 3' 4' 5' 6'
CE8 (quercetin)
7
2'' 4''
1''' 3''' 5'''
CE9 7,4′,4′′′-trimetoxy-5, 5’’, 7′’-trihydroxy (3, 8′′)
OH OH OH O
H
5 8 10 2 3
3' 1' 4' 6'
(24)
2'' 4''
Trang 15(25)
2 3 5
10
1'
2' 3'
4' 6'
1'' 2'' 3''
4''
5''
OH OH
CE11 quercetin-3-O-β-rhamnopyranozit (quercitrin)
(26)
OH
OH O
O O
O OH OH
OH
HO
2 3 9 10 5 7
1'
2' 3'
4' 6'
1'' 2'' 3''
4'' 5''
CE12 kaempferol-3-O-α-L- arabinofuranozit
(juglanin)
(27)
OH
OH O
O HO
O O
7 8
1'
2' 3' 4' 5' 6'
1'' 2''
3''
4'' 5''
CE13 (kaempferol-3-O-β-D- glucopyranozit)
Xác định cấu trúc hoá học của các chất mới CE6 (20) và CE7 (21) Hợp chất CE6 (20)
phổ của chất CE5 chứng tỏ đõy cũng là một dẫn xuất thế xanton cú chứa
nguyờn tố C nhưng phổ khối EI-MS lại cú pic ion phõn tử ở m/z 328 So với
cỏc dữ liệu phổ NMR và MS cú thể suy ra cụng thức phõn tử của hợp chất
giữa cỏc pic ion phõn tử của hai chất Như vậy (CE6) chớnh là dẫn xuất hydroxy ở mạch nhỏnh vũng furan của chất CE5 Sự thay thế một nguyờn tử hydro bằng nhúm OH làm cho tớn hiệu cộng hưởng của C-2’ dịch chuyển về
Trang 16được hợp chất phõn lập được là dẫn xuất 4’-hydroxy của CE5 và cú cấu trỳc 1,5 dihydroxy-3,4 [2’-hydroxymetyl-3’,3’-dimetyl dihydro furano] xanton Chất này lần đầu tiờn được phõn lập từ tự nhiên và được đặt tờn là cratoxanton A (20)
Hợp chất CE7 (21)
Hợp chất CE7 có dạng chất rắn bột màu trắng, điểm nóng chảy
tương ứng với dao động của nhóm OH và ở 1658 tương ứng với dao động của nhóm C=O Phổ ESI-MS cho các tín hiệu (m/z): 327 và 351 ứng với ion [M-
NMR xuất hiện tín hiệu riêng biệt của 18 cacbon, kết hợp với phổ DEPT xác
Trang 176.22(1H, s, H-1); 7.27 (1H, dd, J=8.0 Hz, 1.5 Hz, H-6); 7.23 (1H, dd, J=8.0
Hz, 8.0 Hz, H-7); 7.63 (1H, dd, J=1.5 Hz, 8.0 Hz, H-8) tương ứng với các
có liên kết trực tiếp Phổ HSQC xuất hiện đầy đủ các tương tác của các cacbon
và hydro có liên kết trực tiếp của CE7 Phổ HMBC cũng xuất hiện các tín hiệu
đặc trưng cho các tương tác xa giữa hydro và cacbon
Chất này lần đầu tiờn được phõn lập từ tự nhiên và được đặt tờn là cratoxanton B (21)
