Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans

Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN

1) Nguyễn Quang Huy, Phạm Thanh Nga, Phan Tuấn Nghĩa, 2005 Tìm hiểu

tác dụng chống sâu răng của dịch chiết vỏ cây Sao Đen (Hopea odorata

Roxb) Tạp chí Dược học 45 (350): 13-19

2) Nguyen Quang Huy, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2005

Inhibition of acid production by Streptococcus mutans of some medicinal

plant extracts Tạp chí Khoa học 21(2): 161-168

3) Nguyen Quang Huy, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2006,

Antibacterial activity of some medicinal plants against dental caries

pathogen Streptococcus mutans The first international conference on

science and technology for sustainable development of the greater Mekong

Sub-region, Khon Kaen, Thailand p 10

4) Nguyen Quang Huy, Phung Thi Thu Huong, Pham Anh Thuy Duong, Phan

Tuan Nghia, 2006 Inhibitory effects of Syzygium resinogsum Gagnep

extracts on caries-inducing properties of Streptococcus mutans Tạp chí

Khoa học 22 (4): 131-136

5) Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Văn Quang, Phan Văn

Kiệm, 2007 Các oligostilben từ vỏ cây sao đen Hopea odorata Roxb Tạp

chí Dược học 47 (372):37-39

6) Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Văn Quang, Phan Văn

Kiệm, 2007 Axít asiatic từ cây sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep và

tác dụng của nó lên vi khuẩn Streptococcus mutans Tạp chí Dược học 47

(375):19-22

7) Nguyễn Quang Huy, Phùng Thị Thu Hường, Phan Tuấn Nghĩa, 2007 Phân

lập và nhận dạng một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ người Việt

Nam Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 291-297

8) Đỗ Thị Huê, Bùi Thanh Duyên, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa,

2008.Tác dụng của acid asiatic từ cây Sắn thuyền lên vi khuẩn Streptococcus

mutans H2 phân lập từ người Việt Nam Hội nghị toàn quốc Hóa sinh và

Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghệ thực phẩm

15-17/10-2008 trang 56-59

26

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

NGUYỄN QUANG HUY

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THỨ CẤP TỪ

THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG Streptococus mutans

Chuyên ngành: HOÁ SINH HỌC

Mã số: 62.42.30.15

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2009

Công trình này được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học

1 PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa

2 TS Dương Văn Hợp

Phản biện

1

2

3

Luận án sẽ được bảo vệ trước hội đồng cấp nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2009

Có thể tìm luận án tại

Thư viện Quốc gia Việt Nam

Trung tâm thông tin- Thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

Sâu răng là một trong số các bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và

đang có xu hướng tăng lên đặc biệt ở các nước đang phát triển Sự gia tăng của

căn bệnh này là do những thay đổi trong lối sống, thói quen sinh hoạt, chế độ ăn

uống hàng ngày và tuổi thọ trung bình Theo số liệu điều tra gần đây của Viện

Răng Hàm Mặt Trung ương, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc các bệnh về

răng, miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng và viêm quanh răng Bệnh sâu

răng không chỉ gây ảnh hưởng tới tình trạng sức khoẻ của người bệnh mà còn

gây ra nhiều chi phí tốn kém trong chữa trị.Tổ chức Sức khỏe thế giới (WHO) đã

xếp sâu răng là một trong số các căn bệnh nguy hiểm của loài người Nhiều

chương trình nghiên cứu cũng như khuyến cáo nhằm mục đích ngăn ngừa và

phòng chống bệnh này đã được WHO thực hiện trong những năm qua Mặc dù tỷ

lệ sâu răng trong cộng đồng dân cư đã giảm đi đáng kể nhưng vẫn còn duy trì ở

mức cao và đòi hỏi phải có những biện pháp dự phòng tốt hơn nữa để đạt mục

tiêu mà WHO đưa ra

Cách tốt nhất để hạn chế bệnh sâu răng là vệ sinh răng, miệng thường xuyên

và đúng cách cùng với việc hạn chế dùng các thức ăn, đồ uống có nhiều đường

Tuy vậy, phương pháp vệ sinh răng miệng, thói quen ăn uống không phải lúc nào

cũng thực hiện được, vì vậy việc sử dụng các chất có khả năng kháng khuẩn như

fluo, axit yếu, muối kim loại là một biện pháp để phòng chống sâu răng Trong

số các chất kháng khuẩn được sử dụng thì fluo là chất có hiệu quả hơn cả.Tuy

nhiên, việc sử dụng fluo lâu dài hay với nồng độ cao có thể dẫn đến chứng nhiễm

fluo (fluorosis) làm men răng ố vàng và trở nên sần sùi (Hamilton, 1990; Aeba,

2002) Chính vì những lý do đó mà xu hướng hiện nay là tìm kiếm các hợp chất

mới, có thể thay thế một phần fluo mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao Hiện

nay, việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có tác dụng bảo vệ răng miệng đang

là xu hướng được quan tâm nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn

Việt Nam có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó rất nhiều

loài có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao Từ ngàn xưa, cộng đồng các

dân tộc trên đất nước ta đã có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ

sức khỏe chống lại bệnh tật trong đó có bệnh sâu răng (Đỗ Huy Bích và tập thể,

2

2004; Đỗ Tất Lợi, 2001; Lã Đình Mỡi và tập thể, 2001) Tuy nhiên, đến nay việc tìm kiếm các hợp chất mới chưa mang lại nhiều kết quả như mong muốn Hơn nữa, các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của các hợp chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn sâu răng hiện vẫn còn thiếu

Đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi

khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans” của chúng tôi nằm trong xu thế

nghiên cứu chung của thế giới và Việt Nam.Việc tiến hành đề tài này là cần thiết

và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh về răng, miệng đặc biệt là bệnh sâu răng

Mục tiêu: Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là điều tra tác dụng chống sâu răng

của dịch chiết một số loài thực vật ở Việt Nam thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của chúng lên các quá trình sinh lý, hoá sinh, một số enzyme và hệ

enzyme có liên quan của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans, từ đó

nghiên cứu cách tách chiết, tinh sạch một vài hợp chất thứ cấp từ thực vật và đi sâu tìm hiểu tác dụng chống sâu răng của chúng

Nội dung nghiên cứu

• Nghiên cứu điều tra ảnh hưởng một số dịch chiết thực vật lên quá trình

sinh axit gây sâu răng của Streptococcus mutans và tác dụng giết chết vi

khuẩn này của các dịch chiết

• Tách chiết, tinh sạch, xác định cấu trúc và nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật từ các loài được điều tra lên các quá trình sinh lý,

hoá sinh của vi khuẩn S mutans cũng như một số enzyme và phức hệ

enzyme đích, liên quan đến tính chất gây sâu răng của vi khuẩn này

• Phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ bệnh phẩm của

người Việt Nam bị sâu răng và bước đầu nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật thu được lên một số quá trình sinh lý, hoá sinh cũng như một số enzyme và phức hệ enzyme liên quan của chủng vi

khuẩn Streptococcus mutans phân lập được

Ứng dụng thực tiễn của đề tài

Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp các dẫn liệu về khả năng kháng khuẩn sâu răng của một số dịch chiết thực vật, hợp chất tinh sạch từ

lá Sắn thuyền và vỏ Sao đen có ở Việt Nam góp phần ứng dụng hiệu quả hơn

trong việc bảo vệ răng, miệng

Đóng góp mới của đề tài

• Đây là công trình nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có tác dụng chống

sâu răng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, phát triển của vi khuẩn gây sâu

răng Streptococcus mutans GS-5

• Đây là công trình nghiên cứu có tính hệ thống về tác dụng của dịch chiết

vỏ cây Sao đen và lá cây Sắn thuyền lên vi khuẩn gây sâu răng S mutans

GS-5

• Đây là công trình đầu tiên công bố về việc tách chiết, tinh sạch, xác định

công thức hoá học và tác dụng chống sâu răng của hợp chất hopea phenol,

malibatol A từ vỏ Sao đen và axit asiatic từ lá Sắn thuyền thông qua việc

đánh giá tác dụng của chúng lên sự sinh axit, khả năng giết vi khuẩn và tác

dụng của chúng lên hoạt độ một số enzyme đích trong việc sinh và chịu

axit của vi khuẩn S mutans GS-5

• Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu phân lập và nhận dạng đến loài một

số chủng vi khuẩn S mutans từ người Việt Nam

Bố cục của luận án:

Luận án gồm 136 trang, 10 bảng số liệu, 47 hình, 209 tài liệu tham khảo

tiếng Việt và tiếng Anh Bố cục luận án gồm: mở đầu (3 trang), tổng quan tài

liệu (36 trang), nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết quả

nghiên cứu và bàn luận (59 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), tài liệu tham

khảo (21 trang) và phần phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan

Sâu răng là bệnh gây ra bởi vi khuẩn trên mảng bám răng, điển hình là

Streptococcus mutans Những vi khuẩn này sử dụng các carbohydrate, chủ yếu là

đường glucose để lên men tạo ra axit lactic S mutans có thể tồn tại và sinh

trưởng trong môi trường pH thấp, có thể duy trì hoạt động trao đổi chất mạnh và

tạo ra axit Axit hình thành sẽ gây ra sự hòa tan các khoáng chất có trong men

răng vốn được cấu tạo bởi hydroxylapatide liên kết với ion canxi tích điện dương

và ion phosphate tích điện âm, dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng (Gibbons và Van, 1975; Nguyễn Dương Hồng, 1997) Mặt khác, trên răng các vi khuẩn trong khoang miệng và sản phẩm của chúng cùng với những mảnh vụn thức ăn tạo thành mảng bám răng Mảng bám răng không chỉ là nguyên nhân gây ra sâu răng mà còn là một yếu tố chủ yếu gây bệnh nha chu (Kolenbrander, 2000)

Bệnh sâu răng là một trong 3 bệnh được tổ chức Sức khỏe thế giới (WHO) khuyến cáo về mức độ nguy hiểm chỉ đứng sau bệnh tim mạch và ung thư Trong các thập niên trước, tỷ lệ người mắc bệnh sâu răng khá cao đặc biệt ở trẻ em Trung bình mỗi trẻ em dưới 12 tuổi có từ 8 đến 10 răng sâu hoặc răng đã bị mất

do sâu Tới năm 1997, số người mắc bệnh sâu răng ở lứa tuổi trung niên từ 35 đến 44 tuổi tại các nước công nghiệp phát triển vẫn còn ở mức rất cao, chỉ số DMFT (phản ánh số răng sâu, số răng mất hay trám răng do sâu) ở Canada, Nhật Bản, Úc và các nước Bắc Âu là 13,9, ở Mỹ là hơn 9 (Trịnh Đình Hải, 2004) Hiện nay số bệnh nhân mắc bệnh sâu răng còn cao là do mức sống ngày càng cải thiện, nhiều loại bánh kẹo và sản phẩm có đường được sử dụng

Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Nguyễn Dương Hồng năm 1977 ở

Hà Nội cho thấy có tới 77% trẻ em 6 tuổi có sâu răng, tỷ lệ này ở thanh niên là 48% Đến năm 1990 theo Võ Thế Quang và tập thể, tỷ lệ sâu răng ở lứa tuổi 12

là 57%, tỷ lệ viêm lợi và viêm quanh răng là 95% và ở lứa tuổi từ 35 đến 44 thì

tỷ lệ này cao tới 99,26% Theo kết quả điều tra sức khoẻ răng miệng toàn quốc lần thứ 2 năm 2001 thì chỉ số DMFT (phản ánh số răng sâu, số răng mất hay trám răng do sâu) của nhóm tuổi 18-34 là 3,64 và chỉ số này tăng theo độ tuổi, cụ thể độ tuổi từ 34-44 và trên 45 tương ứng là 5,06 và 8,26 Đối với trẻ em tỷ lệ sâu răng vĩnh viễn là 54,89% và người lớn tỷ lệ này là 75,2% Tỷ lệ người có răng khoẻ mạnh ở Việt Nam chỉ đạt mức dưới 10%

WHO đã đưa ra mục tiêu cho toàn cầu phấn đấu đến năm 2010 chỉ số DMFT dưới 1 Tại Việt Nam, mục tiêu phấn đấu đến năm 2010 ở độ tuổi 5-6 có 50% trẻ

em không bị sâu răng, ở độ tuổi 18 có 85% người giữ được toàn bộ răng, ở tuổi

từ 35-44 tuổi giảm 50% số người không còn răng và trên 65 tuổi giảm 25% số người không còn răng

1.2 Vi khuẩn S mutans và khả năng gây sâu răng

Những vi khuẩn có khả năng lên men đường thành axit lactic tồn tại trong

khoang miệng được xem là nguyên nhân gây sâu răng Chúng chủ yếu thuộc 3

nhóm vi sinh vật: Streptococcus, Lactobacillus và Actinomyces Trong số những

vi khuẩn này, S mutans được coi là nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng do vi

khuẩn này luôn được phát hiện trong nước bọt, mảng bám răng của người và có

số lượng rất cao ở những vùng răng bị sâu Đặc trưng gây sâu răng của S mutans

chính là khả năng sinh axit mạnh và chịu axit tốt của vi khuẩn này, cho nên trong

môi trường có đường, S mutans tạo ra axit làm tan men răng dẫn đến sâu răng

Khả năng thích nghi hay chịu axit của S mutans liên quan đến nhiều cơ chế

khác nhau, quan trọng nhất là hoạt động của các bơm proton, đặc biệt là

F-ATPase, nhằm bơm proton ra ngoài, duy trì pH nội sinh (pHi) luôn cao hơn so

với pH môi trường F-ATPase của S mutans được phát hiện là có sự thay đổi

trong cấu trúc để thích nghi hoạt động tốt ở pH thấp (Sturr và Marquis, 1992)

Ngoài ra, S mutans còn có một số cơ chế thích nghi axit khác như: tăng cường

tổng hợp các chaperonin hỗ trợ sự hình thành cấu trúc không gian đúng của các

protein (Jayaraman và tập thể, 1997), tăng cường sinh tổng hợp các enzyme sửa

chữa ADN bị tổn thương do axit (Haln và tập thể, 1999) haythay đổi thành phần

lipid của màng tế bào để làm giảm khả năng thấm proton (Quivey và tập thể,

2000) Nhờ vậy, S mutans vẫn có thể tồn tại và sinh axit khi pH môi trường

giảm xuống dưới 4

Hơn nữa S mutans cũng có các đặc điểm để chống chịu các stress về oxy

hóa, để tồn tại và phát triển Các vi khuẩn đường miệng sinh axit lactic thiếu các

cytochrome, các protein chứa nhân hem và enzyme catalase nhưng vẫn có thể

sinh trưởng trong môi trường có chứa các gốc oxy tự do vì chúng có hệ thống

các enzyme bảo vệ như NADH oxidase, Superoxide dismutase (Higuchi 1992,

1999)

Việc phân lập, phát hiện sự có mặt S mutans đóng vai trò quan trọng trong

việc chẩn đoán và điều trị bệnh sâu răng Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được

nghiên cứu, áp dụng trong phân lập và nhận dạng các chủng S mutans ở người

Gần đây kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) kết hợp kỹ

6

thuật PCR đã được áp dụng cho phép nhận dạng chính xác và nhanh chóng loài

S mutans (Sato và tập thể, 2003)

1.3 Các biện pháp chống sâu răng

Việc loại bỏ mảng bám răng bằng cơ học (như đánh răng) có tác dụng ngăn chặn sự hình thành mảng bám răng và là biện pháp phòng chống sâu răng đơn giản nhất Tuy vậy việc thay đổi thói quen ăn uống và duy trì vệ sinh răng miệng thường xuyên rất khó thực hiện Do vậy, hàng loạt các biện pháp khác nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đã được nghiên cứu và ứng dụng Các biện pháp

này chủ yếu dựa trên việc làm giảm số lượng S mutans trên mảng bám răng, giảm khả năng sinh axit của S mutans, hạn chế việc hình thành mảng bám răng,

trám bít các hố rãnh Các biện pháp được sử dụng trong việc chống sâu răng gồm: sử dụng chất kháng khuẩn tổng hợp; sử dụng vaccine phòng chống sâu răng; sử dụng các hợp chất tự nhiên, các chất thay thế đường Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm, không có phương pháp nào là hoàn thiện và vì vậy cần

có sự kết hợp của các phương pháp

Trong số các phương pháp nêu trên thì việc sử dụng các hợp chất tự nhiên đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm Nhiều loài thực vật và hợp chất tự nhiên có đặc điểm kháng khuẩn sâu răng đã và đang được phát hiện và nghiên cứu (Chen và tập thể 1989, Matsumoto và tập thể 1999, Xiao và tập thể 2007 )

1.4 Các chất thứ cấp từ thực vật

Các hợp chất thứ cấp từ thực vật là các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được sinh ra bởi thực vật Chúng là các chất hoá học được tổng hợp và chuyển hoá từ các chất trao đổi bậc nhất như axit amin, protein, axit nucleic, carbohydrate, lipid hoặc từ các sản phẩm trung gian của quá trình đường phân, chu trình Kreb (Lã Đình Mỡi và tập thể, 2001)

Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học và các thuộc tính lý học của chúng mà các chất thực vật thứ sinh được phân loại thành 3 nhóm chất chính là nhóm terpene, nhóm các hợp chất phenolic và nhóm alkaloid Tác dụng sinh học của các hợp chất thực vật thứ sinh rất đa dạng và phong phú Một số hợp chất thực vật thứ sinh được khai thác về tác dụng chống oxy hoá, tác dụng kháng khuẩn, chống

viêm và thậm chí ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, HIV (Park và tập

thể, 2006, Dai và tập thể, 1998) Chen và tập thể (1989) đã nghiên cứu tác dụng

của 79 dịch chiết thực vật lên vi khuẩn S mutans và phát hiện 3 loài M

australia, L octovalvis và T orientalis chứa các hợp chất có tính kháng S

mutans cao nhất Nhiều hợp chất nhóm flavonoid trong cây Erythirina variegata,

Ormosia monosperma được phát hiện có tác dụng giết nhiều loài vi khuẩn đường

miệng Song và tập thể (2007) phát hiện thấy dịch chiết của cây Polygonum

cuspidatum có chứa các hợp chất thuộc nhóm terpenoid, phenolic, glycoside

không những có khả năng ức chế sự phát triển S mutans mà còn ức chế sự hình

thành mảng bám răng Vasconcelos và tập thể (2006) phát hiện thấy các hợp chất

từ dịch chiết cây xoài và cây neem có tác dụng ức chế sự phát triển các loài

nhóm Streptococcus như S salivarius S mitis và S sanguis Gần đây ở Việt

Nam, Nguyễn Thị Mai Phương và tập thể (2005) đã phát hiện các chất

polyphenol trong vỏ cây măng cụt có tác dụng ức chế các enzyme của quá trình

đường phân của S mutans Nhìn chung, các nghiên cứu về hoạt tính kháng

khuẩn sâu răng của các hợp chất thực vật chưa đi sâu về cơ chế tác động của

chúng lên vi khuẩn gây sâu răng

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Chủng vi khuẩn S mutans GS-5, S sanguis NCTC-10904, S gordonii

ATCC 10558, S rattus FA-1 là quà tặng của giáo sư Robert E Marquis, Đại học

Rochester, New York, Mỹ

Các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân bị sâu răng người Việt Nam (để phân lập

vi khuẩn gây sâu răng S mutans) được lấy từ Khoa Răng Hàm Mặt, Bệnh viện

Bạch Mai, Hà Nội

Các mẫu thực vật Chàm tía (CTI), Hương nhu trắng (HNT), Kim ngân

(KNG), Quỷ trâm thảo (QCT), Sài đất (SDA) được thu thập từ Vườn Dược liệu

của Đại học Dược Hà Nội Mẫu lá Sắn thuyền (STA) được thu thập từ vườn

Thuốc Đông y ở Trung Văn, Từ Liêm, Hà Nội Mẫu vỏ Sao đen (SDE) được thu

thập từ tỉnh Đồng Nai Các mẫu thực vật được định tên bởi TS.Trần Đình Nghĩa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Các hóa chất dùng cho nghiên cứu chủ yếu được mua từ hãng Sigma (Mỹ)

có độ tinh sạch dùng cho phân tích

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nuôi cấy và bảo quản tế bào vi khuẩn trên môi trường chứa tryptone 3%, cao nấm men 0,5% glucose 1% và môi trường chứa tryptic soy agar

2.2.2 Phân lập vi khuẩn gây sâu răng S mutans từ các bệnh nhân sâu răng người

Việt Nam trên môi trường Mitis salivarius kết hợp nuôi cấy ở pH axit

2.2.3 Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus mutans phân lập từ mẫu bệnh nhân sâu

răng người Việt Nam bằng phân tích hình thái kết hợp các phương pháp PCR-RFLP

2.2.4 Nuôi cấy biofilm trên môi trường chứa tryptone, cao nấm men và sucrose 2.2.5 Xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn bằng cách đo độ giảm pH môi trường trong điều kiện dư thừa glucose

2.2.6 Xác định độ gây chết vi khuẩn bởi các chất tác dụng thông qua việc đánh giá số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của vi khuẩn còn lại (N) sau các khoảng thời gian khác nhau so với số CFU ban dầu (No) Khi đó giá trị D là khoảng thời gian để có giá trị Log N/No = -1 (tương ứng với mức 90% số vi khuẩn bị giết chết so với ban đầu)

2.2.7 Xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn thông qua việc đếm

số CFU sau các khoảng thời gian khác nhau ở pH thấp

2.2.8 Xác định mức độ tiêu thụ oxy của tế bào trong điều kiện dư thừa glucose bằng điện cực oxy

2.2.9 Xác định hoạt độ một số enzyme chính liên quan đến đặc trưng sinh axit

và chịu axit thông qua sự chuyển hóa của các chất đặc hiệu

2.2.10 Xác định thành phần một số hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết thực vật bằng các phản ứng đặc trưng

2.2.11 Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất bằng phân tích phổ cộng hưởng

từ hạt nhân (NMR) với sự giúp đỡ của Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học Việt Nam

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng kháng khuẩn sâu răng

3.1.1 Khả năng ức chế của dịch chiết một số thực vật lên sự sinh axit của S

mutans

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng 7 loài thực vật là: Chàm tía

Strobilanthes cusia B (CTI), Hương nhu trắng Ocimum gratissimum L (HNT),

Kim ngân Lonicera japonica T (KNG), Quỷ trâm thảo Bidens pilosa L (QCT),

Sài đất Verbesina calendulaceae L (SDA), Sắn thuyền Syzygium resinosum G

(STA) và Sao đen Hopea odorata R (SDE) Cả 7 loài này đều là những cây

thuốc có khả năng chống viêm và được ứng dụng trong các bài thuốc dân gian để

chữa các bệnh có liên quan đến răng miệng (Đỗ Tất Lợi, 2001; Đỗ Huy Bích và

tập thể, 2001) Bộ phận được sử dụng để thu dịch chiết là lá, riêng với Sao đen

bộ phận sử dụng là vỏ

Cơ chế gây bệnh sâu răng của S mutans là do tác dụng làm mòn men răng

bởi axit được vi khuẩn sinh ra trong quá trình phân giải đường Do vậy, để xác

định tác dụng chống sâu răng của các dịch chiết thực vật, bước đầu chúng tôi tìm

hiểu ảnh hưởng của chúng tới quá trình sinh axit của S mutans Kết quả thu

được (bảng 3.2) cho thấy dịch chiết bằng H2O và ethanol của cả 7 loài thực vật

đều có tác dụng ức chế sinh axit của S mutans GS-5, thể hiện ở giá trị pH cuối

cùng cao hơn mẫu kiểm tra không có dịch chiết Dịch chiết bằng ethanol có tác

dụng ức chế mạnh hơn, chứng tỏ hoạt chất chính gây ức chế sự sinh axit của S

mutans hoà tan tốt hơn trong ethanol Đặc biệt, dịch chiết ethanol của Sao đen

(SDE) và Sắn thuyền (STH) thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit tốt nhất

Huyền dịch tế bào S mutans sau khi loại bỏ các dịch chiết SDE và STH, vẫn còn

tác dụng ức chế sự sản xuất axit, chứng tỏ tác dụng ức chế là không thuận

nghịch Trong điều kiện trên mảng bám răng, các chất tác dụng thường xuyên bị

pha loãng bởi nước bọt, tác dụng ức chế không thuận nghịch sự sinh axit của S

mutans của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền có giá trị ứng dụng cao

Bảng 3.2 Tác dụng của một số dịch chiết thực vật lên sự sinh axit của S

mutans GS-5

Giá trị pH cuối cùng STT Loại dịch chiết

ở nồng độ 10% (w/v) Chiết bằng ethanol Chiết bằng nước

1 Mẫu đối chứng 4,01 ± 0,06 3,98 ± 0,04

10

3 Hương nhu trắng 4,92 ± 0,26 4,25 ± 0,08

5 Quỷ châm thảo 5,20 ± 0,07 4,36 ± 0,08

Các giá trị sau ± là giá trị SD với n =5

3.1.2 Khả năng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 bởi các dịch chiết thực vật Kết quả thí nghiệm diệt khuẩn S mutans GS-5 ở pH 4 (hình 3.5) và pH 7

(hình 3.6) cho thấy ở nồng độ 10%, dịch chiết cả 7 loài thực vật trong nghiên

cứu đều có tác dụng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 ở các mức khác nhau Trong

đó dịch chiết KNG, SDE và STH có tác dụng cao hơn so với các dịch chiết còn lại, và tác dụng này ở pH 4 cao hơn ở pH 7, thể hiện ở chỗ thời gian để 90% quần thể tế bào bị tiêu diệt bởi dịch chiết ứng với giá trị D từ 5 đến 7 phút trong

khi ở các mẫu dịch chiết khác giá trị D là trên 10 phút Khả năng diệt S mutans

GS-5 của các dịch chiết ở pH 4 cao hơn pH 7 là một điều khá thú vị vì đây là một tác dụng mong muốn của các hợp chất chống sâu răng, bởi pH thấp (dưới 4) mới có tác dụng bào mòn men răng dẫn đến sâu răng (Gibbons và Van, 1975)

-8 -6 -4 -2 0

Thời gian ( phút)

Hình 3.5 Khả năng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 của các dịch chiết tại pH 4 Ký

hiệu (I) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n = 3

-2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0

Thêi gian (phót)

Hình 3.6 Khả năng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 của các dịch chiết tại pH 7 Ký

hiệu (I) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n = 3

3.1.3 Khả năng ức chế sự hình thành biofilm S mutans GS-5 của các dịch chiết

thực vật

Sự hình thành biofilm ở mẫu thí nghiệm kém hơn rõ rệt so với đối chứng Ở

mẫu đối chứng vi khuẩn S mutans mọc dày đặc tạo thành lớp màng bám trên

tấm kính, còn mẫu thí nghiệm vi khuẩn mọc thưa và ít hơn So sánh sinh khối tế

bào trên biofilm nhận thấy sinh khối biofilm của mẫu thí nghiệm tăng lên ít hơn

so với mẫu đối chứng (bảng 3.3) Đặc biệt với mẫu xử lý bằng dịch chiết Sao đen

hay Sắn thuyền, lượng sinh khối tế bào tăng lên tương ứng 12,1% và 20,5% của

mẫu đối chứng (tức là sự hình thành biofilm đã bị ức chế tương ứng 87,9% và

79,5%) Đây là phát hiện có ý nghĩa thực tiễn, do có nhiều chất có tính kháng

khuẩn ở dạng huyền dịch nhưng không có tác dụng với các tế bào ở dạng biofilm

vì bị hạn chế về khả năng khuyếch tán và rất khó kiểm soát khi sử dụng các chất

kháng khuẩn thông thường như hiện nay

Bảng 3.3 Tác dụng của dịch chiết thực vật lên sự hình thành biofilm ở S

mutans GS-5

chứng

CTI HNT KNG QCT SDA SDE STH

% sinh

khối tăng

100 65,8 78,9 54,1 60,8 48,2 12,1 20,5

% ức chế 0 34,2 21,1 45,9 39,2 51,8 87,9 79,5

3.1.4 Tác dụng của các dịch chiết thực vật phối hợp với fluo lên S mutans GS-5

Trong các chất kháng khuẩn bảo vệ răng miệng, fluo được Tổ chức Y tế thế giới khuyến cáo sử dụng do vừa có khả năng kháng khuẩn vừa có khả năng tái tạo làm bền men răng Florua natri (NaF) là thành phần chính được sử dụng trong thuốc đánh răng hay nước súc miệng Dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đây của Phan và tập thể (2001) về tác dụng của fluo, chúng tôi đã lựa chọn

và sử dụng các dịch chiết với nồng độ 10% phối hợp với NaF ở nồng độ 0,25

mM (thấp hơn nhiều lần nồng độ fluo được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ răng miệng thông thường)

Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy khi phối hợp các dịch chiết với NaF hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của tế bào cao hơn khi sử dụng dịch chiết hay NaF ở dạng riêng lẻ thể hiện ở giá trị pH trong các mẫu kết hợp dịch chiết với NaF đều cao hơn mẫu chỉ chứa dịch chiết hay NaF Kết quả ở bảng 3.4 còn cho thấy tác dụng của dịch chiết khi kết hợp với NaF là tương tự như tác dụng khi phối hợp fluo indomethacin trong nghiên cứu của Belli và tập thể (1995) hay với một số axit yếu khác trong nghiên cứu của Phan và tập thể (2000)

3.1.5 Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với H2O2 lên sự sinh axit của S mutans GS-5

Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy khi phối hợp dịch chiết với H2O2 (0,3

mM) tác dụng ức chế sự sinh axit của S mutans GS-5 cao hơn so với khi sử

dụng dịch chiết hay H2O2 ởdạng riêng lẻ Tác dụng này là tương tự như khi phối

hợp dịch chiết với NaF

Bảng 3.4 và 3.5 Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với NaF hay

H2O2 lên sự sinh axit của S mutans GS-5

Giá trị pH cuối cùng Giá trị pH cuối cùng Mẫu

nghiên cứu Không bổ

sung NaF

Bổ sung NaF 0,25mM

Không bổ sung H2O2

Bổ sung H2O2

0,3mM Nước 4,08 ± 0,21 4,21 ± 0,02 4,08 ± 0,09 4,45 ± 0,16 Ethanol 4,11 ± 0,08 4,23 ± 0,09 4,30 ± 0,16 4,48 ± 0,12 CTI 5,41 ± 0,06 6,27 ± 0,09 5,29 ± 0,12 5,64 ± 0,12

HNT 5,28 ± 0,09 6,21 ± 0,08 5,32 ± 0,13 6,23 ± 0,17

KNG 5,05 ± 0,13 6,14 ± 0,10 5,45 ± 0,05 6,84 ± 0,14

QCT 5,15 ± 0,12 6,04 ± 0,15 5,15 ± 0,05 6,21 ± 0,13

SDA 5,10 ± 0,08 5,97 ± 0,21 5,45 ± 0,04 6,01 ± 0,21

SDE 6,78 ± 0,06 7,11 ± 0,09 6,82 ± 0,12 7,14 ± 0,12

STH 6,10 ± 0,08 6,97 ± 0,21 6,45 ± 0,04 6,90 ± 0,21

Các giá trị sau ± là giá trị SD với n =5

3.1.6 Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên một số vi khuẩn đường

miệng khác

Trên cở sở phát hiện thấy dịch chiết SDE và STH có khả năng ức chế mạnh

sự sinh axit của S mutans GS-5 cũng như có tác dụng giết chết vi khuẩn này một

cách rõ rệt, chúng tôi đã tìm hiểu khả năng giết một số loài vi khuẩn đường

miệng khác, bao gồm: S gordonii, S rattus và S sanguis của hai loại dịch chiết

này Kết quả thu được ở hình 3.11 cho thấy dịch chiết SDE và STH ở nồng độ

10% có khả năng diệt 90% quần thể S gordonii ATCC 10558 dưới 16 phút hay

quần thể vi khuẩn S sanguis NTCC 10904 và S rattus FA-1 trong 8 phút

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

thêi gian (phót)

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0

0 15 30 45 60 thêi gian ( phót)

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0

0 15 30 45 60 thêi gian ( phót)

Hình 3.11 Tác dụng diệt vi khuẩn của dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen

với S gordonii ATCC-10558 (A), S sanguis NCTC-10904 (B), S rattus FA-1

(C) Đối chứng (
), SDE (
), STH (♦)

Ngoài ra, chúng tôi cũng còn phát hiện thấy dịch chiết SDE và STH có tác

dụng ức chế mạnh với sự tiêu thụ oxy của S mutans GS-5 (dẫn liệu không trình

bày ở đây)

14

Với các kết quả điều tra bước đầu về hoạt tính chống sâu răng của 7 loại dịch chiết thực vật, chúng tôi đã lựa chọn dịch chiết của Sao đen và Sắn thuyền cho các nghiên cứu tiếp theo

3.2 Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ cây Sao đen

3.2.2 Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ vỏ cây Sao đen

Để tách, tinh sạch một chất thực vật thứ cấp từ vỏ Sao đen chúng tôi đã chiết các chất ra khỏi mẫu bằng cách ngâm mẫu trong ethanol (tỷ lệ 1 g mẫu: 10 ml ethanol) trong thời gian 5 ngày Dịch chiết sau đó được cô lại và được chiết tiếp bằng n-hexan, chloroform, ethyl acetate và n-butanol (với độ phân cực tăng dần) Chloroform thể hiện có hiệu suất chiết cao nhất Khi thử nghiệm ảnh hưởng của

các phân đoạn này lên khả năng sinh axit của S mutans GS-5, chúng tôi thấy

rằng phân đoạn chiết bằng chloroform cũng thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit

của S mutans GS-5 tốt hơn các phân đoạn còn lại, chính vì vậy phân đoạn này

được lựa chọn cho các bước tinh sạch tiếp theo

Phân đoạn dịch chiết bằng chloroform của vỏ Sao đen được cho qua cột silicagel, rửa chiết bằng hệ dung môi methanol: nước với tỷ lệ methanol tăng dần, chúng tôi đã thu được 6 phân đoạn hợp chất khác nhau ký hiệu lần lượt là S1, S2, S3, S4, S5 và S6 Phân đoạn S6 được tiếp tục sắc ký qua cột sắc ký pha đảo RP-18, rửa chiết bằng hệ dung môi methanol: acetone: nước theo tỷ lệ 2:1:2

về thể tích Kết quả chúng tôi đã thu được 2 hợp chất ký hiệu là SDE1 và SDE2

H

O HO

H H HO OH

OH

O

HO

OH H

H

OH HO

H

1a 2a 3a 4a

5a 6a

7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14a

1b 2b 3b 4b 5b 6b 7b 9b 10b

11b 12b 13b 14b

1b'

3b' 4b' 5b' 6b' 7b' 8b' 9b'10b'

11b' 12b' 13b' 14b'

1a' 2a' 3a' 4a'

5a' 6a' 7a' 8a' 9a' 10a' 11a' 12a' 13a' 14a'

H OH

O HO

HO

HO

HO

OH

1 2 4 6 7 8

10

11 12 13

1'

3' 5' 7' 8' 9' 10' 11' 13' 14'

Hình 3.13 Cấu trúc hoá học của SDE1 (trái) và SDE2 (phải)

Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy hợp chất SDE1 có cấu trúc đặc trưng phù hợp với cấu trúc của hợp chất hopea phenol với

cụng thức phõn tử C56H42O12, đõy là một hợp chất đó được tỏch ra từ Hopea

paviflora (Tanaka và tập thể, 2000) Hợp chất SDE2 cũng cú dạng phổ NMR

tương ứng với phổ của hợp chất malibatol A với cụng thức phõn tử C28H20O7 đó

được biết đến từ loài Hopea malibato Hợp chất này cú tỏc dụng ức chế sự phỏt

triển của dũng tế bào ung thư CEM-SS (Dai và tập thể, 1998) Đõy là lần đầu

tiờn hai hợpchất hopea phenol và malibatol A từ vỏ Sao đen được tinh sạch, tỏch

chiết tại Việt Nam

3.2.3 Nghiờn cứu hoạt tớnh khỏng khuẩn sõu răng của hopea phenol và

malibatiol A từ vỏ Sao đen

3.2.3.1 Tỏc dụng của hopea phenol và malibatiol A lờn sự sinh axit của S

mutans GS-5

Khi bổ sung hopea phenol hoặc malibatiol A ở nồng độ 4 mM vào huyền

dịch S mutans GS-5 trong điều kiện dư thừa glucose thỡ pH cuối cựng mẫu

tương ứng là 4,9 và 5,21, trong khi mẫu kiểm tra cú pH là 4,1 (hỡnh 3.15) Kết

quả này chứng tỏ cả hai chất đều ức chế sự sinh axit của S mutans GS-5, tương

tự như của dịch chiết vỏ Sao đen ban đầu

3.5

4.5

5.5

6.5

7.5

Thời gian (phút)

3.2.3.2 Tỏc dụng diệt tế bào S mutans GS-5 của hopea phenol và malibatol A

Kết quả nghiờn cứu khả năng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 của hai hợp

chất hopea phenol và malibatol A cho thấy tại giỏ trị pH 4 cả hai hợp chất này

đều cú khả năng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 Với nồng độ 4 mM malibatol A

cú giỏ trị D là 16 phỳt; Hopea phenol với nồng độ 3 mM cú giỏ trị D là 45 phỳt

(hỡnh 3.16)

Hỡnh 3.15 Tỏc dụng của hopea phenol,

malibatol A lờn sự sinh axit của S mutans GS-5 Đối chứng (
), Hopea phenol (
), Malibatol A ().Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ giỏ trị SD với n = 3

-3 -2 -1 0

Thời gian (phút)

3.2.3.3.Tỏc dụng của hopea phenol và malibatol A lờn hoạt độ ATPase của S mutans GS-5

Hoạt độ ATPase của S mutans chủ yếu thuộc về F-ATPase Enzyme này

định vị trờn màng tế bào, cú vai trũ quan trọng trong quỏ trỡnh vận chuyển proton qua màng, quyết định khả năng chịu axit của vi khuẩn này Kết quả nghiờn cứu (hỡnh 3.17) cho thấy hopea phenol và malibatol A đều ức chế hoạt độ ATPase

của S mutans GS-5 Nồng độ hopea phenol và malibatol A gõy ra ức chế 50%

hoạt độ ATPase tương ứng là 1,3 mM và 0,75 mM, chứng tỏ cả hai đều là những chất ức chế mạnh của ATPase Tỏc dụng ức chế ATPase của hopea phenol và

malibatol A giải thớch được một phần tỏc dụng diệt vi khuẩn S mutans GS-5 tại

pH axit của dịch chiết Sao đen

0 20 40 60 80 100

nồng độ (mM)

3.2.3.4 Tỏc dụng của hopea phenol và malibatol A lờn hoạt độ enzyme phosphoryl hoỏ đường (PTS) của Streptococcus mutans GS-5

Hỡnh 3.16 Khả năng diệt S mutans GS-5 tại

pH 4 của Hopea phenol và Malibatol A

Đối chứng (), Hopea phenol 0,75 mM (
), 3 mM (
) và Malibatol A 1 mM (), 4

mM () Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ giỏ trị

SD với n = 3

Hỡnh 3.17 Ảnh hưởng của hopea phenol

và malibatol A lờn hoạt độ ATPase của

S mutans Malibatol A (); Hopea phenol (
) Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ giỏ trị SD với n = 3