Nghiên cứu thành phần hoá học cây giền láng (Xylopia poilanei Ast) cây sẻn gai (Zanthoxylum alatum Roxb.) cây muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC.) và cây ba chạc (Evodia lepta (Spreng) Merr.) ở Việt Nam

Nghiên cứu thành phần hoá học cây giền láng (Xylopia poilanei Ast) cây sẻn gai (Zanthoxylum alatum Roxb.) cây muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC.) và cây ba chạc (Evodia lepta (Spreng) Merr.) ở Việt Nam

Tr−êng §¹i häc vinh

Ng« Xu©n L−¬ng

Nghiªn cøu thμnh phÇn ho¸ häc

c©y giÒn l¸ng (Xylopia poilanei Ast) c©y sÎn gai (Zanthoxylum alatum Roxb.) c©y muång truæng (Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC.)

c©y ba ch¹c (Evodia lepta (Spreng) Merr.)

ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam, khoa Ho¸-Tr−êng §¹i häc Cheng Kung, §µi Loan,

Cã thÓ t×m hiÓu luËn ¸n t¹i:

- Th− viÖn Quèc gia

- Th− viÖn Tr−êng §¹i häc Vinh

I Giới thiệu luận án

1 ý nghĩa của luận án

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đang đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con người Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, hương liệu và mỹ phẩm…Ngày nay, thảo dược vẫn

đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc sản xuất dược phẩm như

là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất dẫn

đường cho việc tìm kiếm các biệt dược mới Khoảng 60% các loài thuốc

đang được lưu hành hiện nay hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng cuối cùng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên

Phần lớn cây được dùng làm thuốc của nước ta phân bố ở vùng rừng núi, nơi mà nguồn tài nguyên đang đứng trước nguy cơ bị suy giảm nghiêm trọng về số lượng và tính đa dạng sinh học do bị khai thác quá mức, bị xói mòn… làm mất cân bằng môi trường sinh thái tự nhiên Nếu chúng ta không có cách giải quyết thoả đáng thì những cây có ích, cùng với những giá trị sử dụng độc đáo của chúng sẽ bị mai một

Trước sự phát triển vượt bậc của ngành sinh học phân tử, ngày nay các nhà khoa học trên thế giới lại tập trung nhiều đến nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên Nhiều hoạt tính sinh học quý báu của các hợp chất trong nhiều cây quen biết từ lâu lại mới được phát hiện

Cây giền láng (Xylopia poilanei Ast) thuộc họ Na (Annonaceae), cây sẻn gai (Zanthoxylum alatum Roxb.), cây muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC.), cây ba chạc (Evodia lepta

(Spreng.) Merr) thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) là các cây thuốc đã được dùng rộng rãi trong Y học cổ truyền ở nước ta cũng như các nước trên thế giới, chúng có nguồn gen đa dạng, phân bố rộng Đây không chỉ là

nguồn nguyên liệu chứa tinh dầu, mà còn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có triển vọng trong y dược

Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá

học cây giền láng (Xylopia poilanei Ast), cây sẻn gai (Zanthoxylum

DC.) và cây ba chạc (Evodia lepta (Spreng) Merr.) ở Việt Nam” góp

phần xác định thành phần hoá học và góp phần tìm kiếm nguồn nguyên liệu cho ngành hoá dược, hương liệu, góp phần điều tra cơ bản và phân

loại bằng hoá học các chi Xylopia, Zanthoxylum và chi Evodia

2 Đối tượng nghiên cứu và nhiệm vụ của luận án

Đối tượng nghiên cứu của luận án là một số loài cây ở Việt Nam

có giá trị, có những ứng dụng và triển vọng cung cấp tinh dầu và các chất

có hoạt tính sinh học phong phú và hấp dẫn

- Cây giền láng (Xylopia poilanei Ast) thuộc họ Na (Annonaceae)

- Cây sẻn gai (Zanthoxylum alatum Roxb.)

- Cây muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC.)

- Cây ba chạc (Evodia lepta (Spreng) Merr.) thuộc họ Cam quýt

(Rutaceae)

Nhiệm vụ của luận án bao gồm:

- Chưng cất lôi cuốn hơi nước hoặc chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ các bộ phận khác nhau của cây giền láng, cây sẻn gai, cây muồng truổng và cây ba chạc

- Xác định thành phần hoá học của tinh dầu từ cây giền láng, sẻn gai, cây muồng truổng và cây ba chạc

- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ giền láng, cây sẻn gai, cây muồng truổng và cây ba chạc

3 Những đóng góp mới của luận án

1 Lần đầu tiên từ dịch chiết lá cây giền láng (Xylopia poilanei Ast)

• Một flavonoit glycosit mới được đặt tên là xylopoillin A

2 Các hợp chất xylopoillin A, dicentrin, dicentrinon, nordicentrin, oxoanolobin và được thử hoạt tính sinh học độc tính tế bào ung thư Daoy (human medulloblastoma), Hep-2 (human laryngeal carcinoma), MCF-7 (human breast adenocarcinoma) và Hela (human cervical epitheloid carcinoma Hợp chất nordicentrin cho thấy có độc tính tế bào trung bình với liều EC50 3,84, 2,57, 2,16, 1,28 μg/mL đối với tế bào ung thư Daoy, Hep-2, MCF-7 và Hela, tương ứng

3 Lần đầu tiên phân tích thành phần hoá học của tinh dầu cây sẻn

gai (Zanthoxylum alatum) ở Việt Nam bằng phương pháp GC và GC/MS

có 44 hợp chất được xác định, thành phần chính của tinh dầu lá là cineol (41,0%), sabinen (8,4%), trong khi đó thành phần chính của tinh dầu quả 1,8-cineol (29,8%), sabinen (18,8%), limonen (12,8%)

8-4 Lần đầu tiên từ dịch chiết lá cây sẻn gai (Zanthoxylum alatum)

đã phân lập được các hợp chất β-sitosterol, stigmasterol, O-β-glucopyranosit, vitexin và isovitexin

β-sitosterol-3-5 Phân tích thành phần hoá học của tinh dầu lá cây muồng truổng (Zanthoxylum aviennae) bằng phương pháp GC và GC/MS, có 53 hợp

chất được xác định, trong đó thành phần chính của tinh dầu lá là α-pinen (10,1%), β-caryophyllen (17,0%) và α-humulen (10,4%)

6 Từ dịch chiết của rễ cây muồng truổng (Zanthoxylum aviennae)

đã phân lập và xác định cấu trúc được 12 hợp chất bao gồm:

• 6 hợp chất cumarin: scoparon, scopoletin, braylin, avicennol, avicennin và luvangetin

• 1 hợp chất flavonoit: hesperidin

• 2 hợp chất alkaloit: nitidin và terihanin

• 1 hợp chất lignan: seasamin

• 2 hợp chất steroit: β-sitosterol và glucopyranosit

β-sitosterol-3-O-β-D-7 Đã phân tích thành phần hoá học của tinh dầu lá ba chạc (Evodia lepta) bằng phương pháp GC và GC/MS có 41 hợp chất được xác

định, thành phần chính của tinh dầu là (E)-β-ocimen (39,0%)

8 Từ dịch chiết của rễ cây ba chạc (Evodia lepta) đã phân lập và

xác định cấu trúc được các hợp chất, β-sitosterol, evodiamin và

malloapelta B

4 Bố cục của luận án

Luận án bao gồm 124 trang với 33 bảng số liệu, 14 hình và 4 sơ đồ với 117 tài liệu tham khảo Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (3 trang), tổng quan (21 trang), phương pháp và thực nghiệm (18 trang), kết quả và thảo luận (65 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (2 trang), tài liệu tham khảo (13 trang) Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm

66 phổ của một số hợp chất chọn lọc

II Nội dung luận án

Mở đầu

Phần đặt vấn đề đã đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án

Chương 1: Tổng quan

Phần này tổng hợp các tài liệu quốc tế và trong nước về các loài cây được nghiên cứu trong luận án: đặc điểm thực vật, thành phần hoá học, hoạt tính sinh học và ứng dụng của chúng

Chương 2: Phương pháp vμ Thực nghiệm

• Phương pháp lấy mẫu

Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước hoặc chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu

được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm

• Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất

Đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột (CC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký khí-Detetor FID (GC-FID), sắc ký khí-khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng-khối phổ (LC-MS)

• Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng

va chạm elecron (EI-MS), phổ khối lượng phu mù electron (ESI-MS) phổ khối lượng phun mù electron phân giải cao (HR-ESI-MS), phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): 1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY

Chương này cũng nêu cụ thể các phương pháp tách tinh dầu, phân tích tinh dầu, tách các hợp chất, các hằng số vật lý và dữ kiện phổ các

hợp chất được phân lập, thử hoạt tính sinh học một số hợp chất được phân lập

Chương 3: kết quả vμ Thảo luận

3.1 Cây giền láng (Xylopia poilanei Ast)

3.1.1 Nguyên liệu thực vật

Lá cây giền láng (Xylopia poilanei Ast) được thu hái vào tháng

5/2007 ở Quỳnh Lưu, Nghệ An

3.1.2 Chiết tách

Lá cây giền láng (Xylopia poilanei) (4,4 kg) được xay nhỏ và chiết

với metanol (5L ì 3) ở nhiệt độ phòng, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao màu nâu (260 g) Phân bố cao này giữa H2O và etyl

axetat, tiếp theo với n-butanol

Cao n-butanol (105g) được sắc ký cột silica gel, hệ dung môi rửa

giải CHCl3 : CH3OH, gradient với CH3OH thu được 7 phân đoạn chính

Sắc ký phân đoạn 3 trên silicagel với hệ dung môi rửa giải CHCl3

-CH3OH (19:1) và sau đó gradient CH3OH thu được hợp chất 109 (35 mg), 110 (42 mg), 111 (23 mg), 112 (21 mg) Phân tách phân đoạn 4

bằng sắc ký cột trên silicagel với hệ dung môi rửa giải CHCl3-CH3OH

(9:1) thu được hợp chất 108 (55 mg), 113 (26 mg), 114 (20 mg), 115 (27 mg) Phân đoạn 6 được tiến hành sắc ký cột silicagel với hệ dung môi rửa

giải CHCl3-CH3OH-H2O (9:1:0.05) thu được hợp chất 116 (43 mg) và

108 xylopoillin A C26H28O15 55

Hợp chất 108 thu được ở dạng bột màu vàng Điểm nóng chảy:

265-268oC Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất 108

cho thấy pic ion ở m/z 603,1328 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân

Trong phổ 1H-NMR, cho thấy các tín hiệu tương tác với nhau theo

hệ ABX δ 7,74 (1H, d, J = 2,0 Hz).7,60 (1H, dd, J = 8,5 và 2,0 Hz) và 6,90 (1H, d, J = 8,5 Hz) khẳng định vòng B bị thế 3 Hai tương tác qua lại doublet ở δ 6,42 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz) được

thừa nhận là H-6 và H-8 khi chúng biểu thị các mối tương quan 2J ,3

J-HMBC với các tín hiệu phổ 13C-NMR ở δ 165,9 (C-7), 158,4 (C-5),

105,7 (C-10), 99,9 (C-8) và δ 165,9 (C-7), 163,0 (C-9), 105,7 (C-10),

94,7 (C-6), tương ứng Các tín hiệu của 2 proton anomeric ở δ 5,19 (d, J

= 6,5 Hz) và 5,13 (d, J = 1,5 Hz) gợi ý cho sự có mặt của 2 gốc đường

Thêm vào, có các proton của nhóm methin chứa oxy và methylen ở δ

3,44 (1H, t, J=9,5 Hz), 3,47 (1H, dd, J=12,5, 1,5 Hz), 3,47 (1H, dd,

J=8,5, 3,0 Hz), 3,82 (1H, dd, J=12,5, 4,0 Hz), 3,86 (2H, m), 3,93 (1H,

m), 4,05 (1H, dd, J=3,5, 1,5 Hz) và 4,08 (1H, dd, J = 8,5, 6,5 Hz) được

xác định là các tín hiệu proton của phần đường Hơn nữa, tín hiệu methyl

doublet ở δ 1,28 (3H, d, J=6,5 Hz) đặc trưng cho đường rhamnose

Trong phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 1 nhóm

methyl (δ 18,1), 1 oxymethylen (δ 67,1), 7 oxymethin (δ 68,9, 70,2,

Hợp chất 108 được khẳng định thêm bằng thuỷ phân bằng axit HCl

2N, phần aglycol được xác định là quercetin bằng đo điểm nóng chảy và

các phương pháp phổ UV, IR, MS, 1H-, 13C- NMR, phần đường là

L-arabinose và D-rhamnose được xác định bằng HPLC so sánh với thời

gian lưu và độ quay cực với mẫu chuẩn

Bảng 3.2: Số liệu NMR của hợp chất 108

2 - 158,6

3 - 135,8

4 - 179,4

3' - 146,0 4' - 149,9 5' 6,90 (1H, d, J = 8,5 Hz) 116,2

Ngoài ra, các tín hiệu của proton ở δ 7,74 (H-2') và 7,60 (H-6')

biểu thị mối tương quan 3J-HMBC với tín hiệu cacbon ở δ 158,6 (C-2),

tương ứng, xác định kiểu thế trong vòng B là thế 1,3,4 và các nhóm liên kết với C-3' và -4' là các nhóm hydroxyl với trợ giúp của công thức phân

tử và phân tích phổ 13C-NMR Việc gán các tín hiệu của proton và

cacbon với sự trợ giúp của phổ NOESY và HMBC của hợp chất 108 và vì vậy cấu trúc của hợp chất 108 được thiết lập, đây là 1 flavonoit glycosit

mới, quercetin-3-O-[α-D-rhamnopyranosyl-(1→3)- β arabinopyranosit] được gọi tên là xylopoillin A

-L-5'''

1 2

3 4 5 6 7

8 9 10

OH

O

OH O

Hình 3.11: HMBC của hợp chất 108 (xylopoillin A)

• C¸c hîp chÊt alkaloit

N

O O

OCH HCO

CH3

3 3

1

2

5 6

7

8 9 10

N

O O

OCH HCO

O

3 3

1

5 6 7

8 9 10

(109) Dicentrin (110) Dicentrinon

NH

O O

8 9 10

C D

N

O O

8 9 10

3 4 5

6

7 8 9

OH OH

CH3OH

O

OH O

(113) Rutin

1 2

3 4 5

6

7 8 9

CH3O

OH O

OH O

OH O

O

O H

OH

O O

H

O H

3 4 5

6

7

8 9

OH OH

4 5

2,57, 2,16, 1,28 μg/mL đối với tế bào ung thư Daoy, Hep-2, MCF-7 và Hela, tương ứng

Lá và quả cây sẻn gai được thu hái tháng 12 năm 2004 ở Thanh

Hóa Chưng cất lôi cuốn hơi nước lá và quả cây sẻn gai với hiệu suất

0,16% và 0,19% so với lượng nguyên liệu Tinh dầu này có xanh da trời nhạt, có mùi rất thơm

3.2.2 Xác định thành phần hoá học của tinh dầu lá và quả cây sẻn gai

Phân tích tinh dầu lá cây sẻn gai ở Việt Nam bằng phương pháp GC/MS thấy có 54 hợp chất trong đó đã xác định được 50 hợp chất (chiếm 98,2%) Các monoterpen chiếm ưu thế với 1,8-cineol (41,0%), sabinen (8,4%), linalool (4,5%), β-cymen (1,3%), γ-terpinen (1,6%), β-terpineol (2,1%), 2,6-dimetyl-1,3,5,7-octatetraen (1,5%), α-terpineol (4,1%), 2,6-dimetyl-3,5,7-octatrien-2-ol (1,0%) Các sesquitecpen có hàm lượng rất thấp Kết quả này cho thấy 1,8-cineol (41,0%), 2-undecanon (9,6%) và sabinen (8,4%) là thành phần chính của tinh dầu lá, trong khi đó thành phần chính của tinh dầu quả 1,8-cineol (29,8%),

hexan, etylaxetat, n-butanol CÊt thu håi dung m«i thu ®−îc c¸c cÆn dÞch chiÕt t−¬ng øng CÆn n-hexan (20g) ®−îc ph©n t¸ch trªn b»ng s¾c ký cét nhanh, dung m«i gi¶i hÊp lµ n-hexan:etylaxetat (90:10) thu ®−îc c¸c chÊt

18 (102mg), 118 (37mg) CÆn etylaxetat (20g) ®−îc ph©n t¸ch trªn b»ng

s¾c ký cét nhanh, dung m«i gi¶i hÊp lµ cloroform:metanol (98:2-90:10)

thu ®−îc 10 ph©n ®o¹n chÝnh Ph©n ®o¹n 1 thu ®−îc chÊt 19 (55mg)

Ph©n ®o¹n 10 tiÕp tôc ph©n t¸ch b»ng s¾c ký cét trªn silicagel, dung m«i

röa gi¶i lµ cloroform:metanol (80:20-20:80) thu ®−îc c¸c chÊt 119 (23mg), 120 (47mg)

10

11 12 13

1

15 16 17 18

15 16 17 18

26 27

6 14

O H O H

OH H

O H

O

(19) β-sitosterol-3-O-β -D-glucopyranosit

O O

H

OH

4 5

OH

O

OH O

H

1 2

3 4 5

Lá cây muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC.) được

thu hái vào tháng 10/2005 ở Thạch Hà, Hà Tĩnh Chưng cất lôi cuốn hơi nước lá cây muồng truổng thu được tinh dầu, có hàm lượng là 0,1% so với mẫu tươi Tinh dầu có màu vàng nhạt, mùi thơm đặc trưng

3.3.2 Xác định thành phần hoá học tinh dầu

Xác định thành phần hoá học tinh dầu lá cây muồng truổng bằng phương pháp GC, GC/MS và so sánh thời gian lưu RT (retention times) Hơn 80 hợp chất được tách trong tinh dầu lá cây muồng truổng, trong đó

53 hợp chất được xác định

Các hợp chất monoterpen chiếm 44,3% hàm lượng tinh dầu Trong

đó, α-pinen (10,07%), sabinen (2,53%) và γ-terpinen (4,53%) là thành phần chính.15 hợp chất sesquiterpen hydrocacbon và alcohol được phát hiện chiếm 40,75% hàm lượng tinh dầu

Các hợp chất có hàm lượng tương đối lớn là β-caryophyllen (17,01%), α-humulen (10,38%), α-pinen (10,07%), β-phellandren (9,42), γ-terpinen (4,53%), α- (E)-β-ocimen (3,87), germacren D (3,28%), terpinen

(3,09%), β-selinen (3,09%), myrcen (2,68%), sabinen (2,53%), α-selinen (2,29%), Δ-cadinen (1,90%), linalool (1,14%), (E, E)-α-farnesen (1,14%)

Một nét đặc trưng thú vị của tinh dầu này chỉ có 3 sesquiterpen chứa oxy chiếm 1,32% hàm lượng tinh dầu, nhưng những hợp chất này cùng với benzyl benzoat, 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanon, benzyl hexanoat và phytol tạo nên mùi thơm đặc trưng của tinh dầu

3.3.3 Xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây muồng truổng

\3.3.3.1 Chiết tách

Rễ cây muồng truổng (10,0kg), được phơi khô, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (10 ngày) Dịch chiết được cất thu hồi dung môi thu được cao metanol Phân bố cao metanol trong nước, sau đó lắc lần lượt với n- hexan, etylaxetat, butanol Cất thu hồi dung môi thu được các cặn dịch chiết tương ứng, 40, 50, 105g

Cao n-hexan (40g) được phân tách trên bằng sắc ký cột, dung môi giải hấp là n-hexan: axeton (19:1) gradient với axeton, sắc ký lại nhiều

lần và kết tinh phân đoạn thu được các chất 121(25mg), 122 (23mg), 123 (41mg), 18 (309mg)

Cao etylaxetat (50g) được phân tách trên bằng sắc ký nhồi silicagel, dung môi giải hấp là cloroform:metanol 19:1-4:1 thu được 6 phân đoạn chính Phân đoạn 1 tinh chế lại bằng sắc ký nhanh thu được

chất 124 (78mg) Phân đoạn 2 sắc ký cột lại thu được chất 40 (122mg)

Phân đoạn 5 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột trên silicagel, dung môi

rửa giải là cloroform:metanol 15:1-4:1 thu được các chất 41 (203mg) và

125 (19mg)

Cao n-butanol (105g) được phân tách trên bằng sắc ký cột nhồi silicagel, dung môi rửa giải là CHCl3: CH3OH: H2O (30:1: 0,05) gradient với metanol, sắc ký lại nhiều lần và kết tinh phân đoạn thu được các chất

44 (44mg), 25 (32mg) và 19 (45mg)