Phương pháp PCR đã được sử dụng để phát hiện các loại nấm và vi khuNn gây bệnh và sinh độc tố trên nông sản, thực phNm và các loại thức ăn gia súc, do tiện... Trong nghiên cứu này chúng
Trang 1NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NẤM Aspergillus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
TRÊN LẠC BẰNG PHẢN ỨNG PCR ĐẶC HIỆU
Trần Tuấn Tú, Đàm Quang Hiếu, Hoàng Thị Ngát, Lê Huy Hàm
và Phạm Xuân Hội
Summary
Identification of Aspergillus flavus induced Aflatoxin in peanut in the orth of
Vietnam using PCR method
Aflatoxins are carcinogenic metabolites produced by several members of Aspergillus group, such
as Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius.Number of methodologies have
been developed for detection of aflatoxin in grain and food, including thin-layer chromatography (TLC), high-performance liquid chromatography (HPLC), overpressured chromatography, polymerase chain reaction (PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) At least, more than 20 genes have been determined to be involved in Aflatoxin biosynthesis pathway In which,
genes ver-1, omt-1 and apa-2 play an important role in the pathway In this study, we use ver as a
target gene to detect peanut contaminated aflatoxin in the North of Vietnam by employing PCR approach Peanut samples on the field, household and market from different area have been
collected for isolating Aspergillus flavus induced Aflatoxin strains using from a separate hypha A primer pair complementing the coding portion of ver gene was generated DNA extracted from
Aspergillus flavus, Aspergillus niger strains from Nghean, Haiduong and Hanoi provinces was used
as PCR template Positive results as designed PCR products were observed only with all DNA
templates of Aspergillus flavus from different sources, while no PCR products were observed with DNA templates of Aspergillus niger The results is suggesting a posibility to use PCR as selective
method for early, accurate detection of aflatoxin contaminated in peanut as well as in grains and foods
Keywords: Aflatoxin, Aspergillus flavus, peanut, PCR, identification
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm sinh độc tố là một trong những tác
nhân gây bệnh phổ biến làm giảm chất lượng
và giá trị sản phNm nông nghiệp do sinh ra
các loại độc tố gây hại cho sức khoẻ con
người và vật nuôi Phổ biến nhất trong nhóm
nấm sinh độc tố là nấm bệnh Aspergillus spp
(A flavus; A parasiticus; A fumigatus ) có
khả năng sinh độc tố gây ung thư Aflatoxin
Các chủng nấm này có phổ hoạt động rất
rộng vì vậy có khả năng lây nhiễm trên nhiều
loại nông sản như ngô, lạc, bông, đậu
tương Các loại hạt có dầu (đặc biệt như lạc) rất thích hợp cho sự phát triển của nấm
Aspergillus spp cũng như sự hình thành độc
tố Aflatoxin
Xuất phát từ thực tế trên, đã có nhiều phương pháp được nghiên cứu và áp dụng trên thế giới nhằm phát hiện sớm nguồn nấm bệnh, điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc hạn chế tác hại nấm bệnh trên nông sản Phương pháp PCR đã được sử dụng để phát hiện các loại nấm và vi khuNn gây bệnh và sinh độc tố trên nông sản, thực phNm và các loại thức ăn gia súc, do tiện
Trang 2lợi, dễ áp dụng, có khả năng phát hiện sớm
mầm bệnh kể cả khi chúng chưa sinh độc
tố Có ít nhất 20 gen tham gia vào con
đường tổng hợp aflatoxin, một số gen quan
trọng trong số đó đã xác định được trật tự
nucleotid và chức năng như apa, omt, ver,
nor Trong nghiên cứu này chúng tôi sử
dụng gen ver - mã hoá cho enzyme chuyển
versicolorin thành sterigmatocystin (tiền
chất đầu tiên trong nhánh sinh tổng hợp
Aflatoxin B1- chất độc nhất và phổ biến
trong nhóm Aflatoxin) làm gen đích để
bước đầu xác định sự có mặt của nấm bệnh
Aspergillus sinh độc tố trên các mẫu lạc thu
thập ở một số tỉnh miền Bắc Việt N am
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
Các giống lạc thu thập trong nhà dân,
trên đồng ruộng và trên thị trường ở các
tỉnh N ghệ An, Hải Dương và Hà N ội được
sử dụng để phân lập nguồn nấm bệnh Cặp
mồi đặc hiệu cho gen ver, các hóa chất sử
dụng trong sinh học phân tử phục vụ việc
tách chiết ADN tổng số sợi nấm và các
nguyên liệu cho phản ứng PCR được mua
của hãng Sigma, Fermentas
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Thu thập mẫu lạc và thu nhận
nấm bệnh từ mẫu lạc Các mẫu lạc thu về
được bảo quản trong phòng lạnh ở điều
kiện 4 - 80C tại Bộ môn Bệnh học phân tử
thực vật Để thu được nấm bệnh, chúng tôi
tiến hành theo 2 cách: (i) Đặt hạt lạc trực
tiếp trên đĩa petri có lót giấy khử trùng
sạch, giữ trong điều kiện 280C và độ Nm
khoảng 80%; (ii) Cắt vỏ hạt lạc đặt trên
môi trường PDA đặc, giữ ở nhiệt độ 280C
Sau 3 - 5 ngày đặt mẫu, tiến hành quan sát
sợi nấm mọc trên lạc và vỏ hạt lạc, xác định các điểm mọc nấm thích hợp để tiến hành cấy chuyển và phân lập
2.2 Phương pháp phân lập nấm: Sử dụng phương pháp tách sợi nấm đơn để làm thuần các isolate Trên đĩa môi trường đặc, tiến hành cấy chuyển bằng cách lấy sợi nấm tại các điểm ngoài rìa của khuNn lạc để cấy chuyển sang đĩa môi trường mới Mỗi khuNn lạc trên đĩa môi trường chọn từ 3 đến 5 điểm để cấy chuyển theo nguyên tắc ngẫu nhiên Tiến hành phân lập
những mẫu nấm Aspergillus có đặc điểm
hình thái điển hình trên cả 2 loại môi trường PDA đặc (120 ml dịch chiết khoai tây, 12 g dextrose, 10 g agar cho 1L môi trường - là môi trường giàu dinh dưỡng) và môi trường Czapek đặc (là môi trường dinh dưỡng trung bình) cho đến khi đạt tới
độ đồng đều về màu sắc và tốc độ phát triển của khuNn lạc Dựa vào các đặc điểm nhận dạng mầu sắc khuNn lạc, hình dạng sợi nấm, vết loang để lại trên môi trường quan sát trên đĩa petri và kết hợp với hình dạng bào tử, cuống sinh bào tử, thể bình quan sát trên kính hiển vi chúng tôi tiếp tục làm thuần các isolate bằng việc chọn lọc và cấy chuyển các mẫu nấm trên môi trường đặc Trên cơ sở các đặc điểm nhận dạng trong quá trình phân lập, các mẫu
nấm được phân thành các isolate A flavus,
A paraciticus hay A niger Sau đó, các
mẫu nấm này được sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho các thí nghiệm tiếp sau 2.3 Tách chiết ADN tổng số Các mẫu nấm thu được trên môi trường đặc được tiếp tục nuôi cấy lắc 200v/p trong môi trường PDA và Czapek lỏng từ 5 - 7 ngày, ở 280C
để thu sinh khối Sau khi được rửa bằng nước cất từ 3 - 4 lần các mẫu nấm được giữ trong tủ lạnh sâu - 800C làm nguyên liệu
Trang 3tách chiết ADN tổng số Trong nghiên cứu
này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp
tách chiết ADN tổng số từ nấm Aspergillus
theo quy trình của Eric W Boehm Cho 200
- 300 mg sinh khối nấm đã được nghiền nhỏ
bằng nitơ lỏng vào ống eppendorf 1,5 ml,
bổ sung 500 µl dung dịch tách chiết
(100 mM Tris-pH 8.0, 10 mM EDTA, 2%
SDS, 1% β-mercaptoethanol), ủ mẫu ở
650C trong 1h, đảo đều mẫu 5 phút một lần
Bổ sung 300 µl dung dịch CTAB
(5M N aCl, 10% CTAB), ủ mẫu trong
30 phút Tiếp đó, bổ sung thêm 450 µl dung
dịch chloroform-isoamyl alcohol tỉ lệ 24:1
(v/v), đảo đều và ly tâm 12000 vòng/phút
trong 15 phút Chuyển pha dịch trong phía
trên sang ống mới, bổ sung 600 µl dung
dịch isopropanol lạnh và ủ mẫu ở - 200C ít
nhất 3 h Sau đó, ly tâm mẫu ở 12000
vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ dịch phía
trên và rửa kết tủa thu được bằng 300 µl
EtOH lạnh 70%, đảo nhẹ và ly tâm ở 12000
vòng/phút trong 5 phút Thu lại và làm khô
kết tủa; hòa tan kết tủa với 50 µl nước cất
khử ion sau đó xử lý loại bỏ ARN
Các mẫu ADN tổng số sau đó sẽ được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện
di trên gel agarose 1% và đo quang phổ hấp thụ (OD260/280nm) để kiểm tra hàm lượng và chất lượng ADN tổng số thu được
2.4 Thiết kế Primer đặc hiệu Trên cơ sở
trình tự gen ver (Acession number: M91369)
đã được đăng ký trong ngân hàng gen thế giới, chúng tôi sử dụng chuơng trình CLC Bio 3.1 để thiết kế cặp mồi VER-496F
(5’-ATGTCGGATAAT CACCGTTTAGATGGC-3’)
và VER-1391R (5’-ATGTCGGATAAT CACCGTTTAGATGGC-3’) để nhân phân đoạn có kích thước 896 bp của gen ver-1
(Hình 1) N hững chủng nấm có băng ADN kích thước 900bp được khuyếch đại bằng cặp mồi trên được xem là có khả năng sinh độc tố Aflatoxin Hướng nghiên cứu trên sẽ là cơ sở cho chúng tôi xây dựng phương pháp có thể chuNn đoán sự nhiễm và định lượng được
mức độ nhiễm nấm Aspergillus spp sinh độc
tố Aflatoxin từ các mẫu lạc hay các cây lương thực khác
Hình 1 Cấu trúc gen ver và vị trí cặp mồi được thiết kế trên gen Gen ver có kích thước khoảng 1.76 kb, tận cùng đầu 5’ và đầu 3’ là vùng không phiên mã (5’UTS và 3’UTS) dài khoảng 400bp và 372bp; khung đọc mở (ORF) nằm từ vị trí 400 đến vị trí 1393, mã hoá cho 262 a.amin; trong khung đọc mở có tồn tại 3 đoạn exon và 2 đoạn intron Cặp mồi được thiết kế nằm trọn trong khung đọc mở, có kích thước lý thuyết 896bp (~ 900bp)
2.5 Phản ứng PCR đặc hiệu Các mẫu
DN A đã tách chiết được pha loãng về nồng
độ 20ng/µl để làm khuôn cho phản ứng
PCR đặc hiệu xác định sự tồn tại của gen
ver trong genome Phản ứng PCR được
tiến hành ở thể tích 20 µl chứa 0,2 µl Taq
5’UTS
3’UTS
Ver –496F
Ver –1391R
1765 bp
896 bp Intron
Trang 4polymerase (5 u/µl) của Promega, 2 µl
buffer 10X, 0,2 mM dNTPs và 20 pmol
mỗi mồi Phản ứng PCR được thực hiện
bằng máy nhân gen Genius trong 35 chu
kỳ với chương trình nhiệt được thiết lập
như sau: Biến tính 940C trong 45 giây, gắn
mồi ở 550C trong 45 giây và kéo dài ở
720C trong 1 phút Các phân đoạn sản
phNm được điện di kiểm tra trên gel
agarose 1% và ghi nhận hình ảnh bằng hệ
thống máy ảnh N ikon
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Phân lập nấm bệnh Aspergillus
spp từ một số mẫu lạc của Việt N am Sử
dụng cả 2 phương pháp thu thập nấm:
(i) Đặt hạt lạc lên đĩa petri có lớp giấy
thấm khử trùng được làm ướt (5 - 6
hạt/đĩa) và (ii) Đặt vỏ lụa hạt lạc lên môi
trường PDA đặc (5 - 6 miếng vỏ/đĩa) chúng
tôi đã thu được các chủng nấm Aspergillus
spp nhờ vào các đặc điểm hình thái bên
ngoài như màu sắc và vết loang của
khuNn lạc trên môi trường (Hình 2) Kết
quả nhận thấy bằng phương pháp đặt vỏ
lạc trên đĩa môi trường PDA đặc, độ
nhiễm khuNn và lẫn nhiều loại nấm khác
(nhiễm 40%) là thấp hơn nhiều so với
phương pháp đặt cả hạt lạc trên giấy
thấm khử trùng (nhiễm 70%)
Hình 2 Phương pháp thu nhận và phân lập mẫu nấm bệnh từ hạt lạc trên giấy thấm khử trùng được làm ướt (A) và từ vỏ hạt lạc trên môi trường PDA đặc (B)
Qua theo dõi và thống kê chúng tôi nhận thấy tỷ lệ các hạt lạc bị nhiễm nấm là rất cao (dao động từ 80 - 100%) và không
có sự khác biệt lớn về tỷ lệ nhiễm nấm của lạc thu thập trong dân (sau khi thu hoạch)
so với nguồn lạc trên thị trường Điều đó cho thấy nguồn nấm bệnh đã được lây nhiễm từ đồng ruộng đến kho bảo quản và ngược lại Hầu hết các mẫu lạc bị nhiễm
nấm A flavus (có khuNn lạc màu xanh
vàng, mặt sau màu vàng - Hình 3A1) và
A niger (khuNn lạc màu đen, mặt sau màu
trắng hoặc vàng - Hình 3A2) và không thu nhận được bất kỳ mẫu nấm nào có đặc điểm
hình thái của nấm A paraciticus Điều này cho thấy nấm bệnh Aspergillus spp sinh
độc tố Aflatoxin phổ biến trên lạc ở Việt
N am là chủng A flavus
Trên hai môi trường PDA và Czapek đặc được sử dụng, có sự khác biệt về hình thái khuNn lạc và tốc độ phát triển của nấm khi nuôi cấy (Hình 3) Tốc độ phát triển của
nấm Aspergillus spp trên môi trường
Czapek chậm hơn so với trên môi trường PDA Trên môi trường PDA, đường kính khuNn lạc nấm đạt trung bình là 6 - 7 cm qua
7 ngày nuôi cấy và đạt mức tối đa 9 cm sau khoảng 20 ngày Trên môi trường Czapek, qua 7 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuNn lạc chỉ đạt được là 3,5 - 4 cm, tối
đa đạt được là 7 cm sau 20 ngày Xét riêng
với 2 loài nấm A flavus và A niger, chúng tôi
nhận thấy mức độ nhiễm nấm trên lạc cũng
như tốc độ phát triển của nấm loài A flavus là cao hơn so với loài A niger, từ đó có thể thấy
Trang 5nguy cơ lớn của việc nhiễm nấm cũng như
nhiễm độc tố Aflatoxin cao trên các mẫu lạc
được khảo sát ở Việt N am (Hình 3)
Hình 3 Hình thái nấm Aspergillus spp phân lập được từ mẫu lạc A Mẫu nấm A flavus: trên môi trường PDA (A1) khuYn lạc phát triển nhanh và vùng nấm mới phát triển có màu vàng nhạt, vùng nấm bên trong có màu xanh Trên môi trường Czapek (A2) nấm sinh trưởng chậm hơn, màu sắc đậm hơn và có xuất hiện các hạch nấm màu đen A3: Hình ảnh
thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A.flavus quan sát dưới kính hiển vi (X 1600)
A4: bấm A flavus trong nuôi cấy lỏng B Mẫu nấm A niger: Trên môi trường Czapek (B1)
khuYn lạc phát triển chậm hơn và màu của khuYn lạc cũng đậm hơn và có xuất hiện một số
“hạch nấm” trên khuYn lạc - có thể do môi trường Czapek nghèo dinh dưỡng hơn;
B2: Hình ảnh sợi nấm A niger quan sát dưới kính hiển vi (X 1600)
Các mẫu nấm Aspergillus thu được sau
khi làm thuần sẽ được cấy chuyển sang môi
trường PDA và Czapek lỏng để nuôi cấy
thu sinh khối Kết quả cho thấy, không có
sự khác biệt nào đáng kể khi nuôi cấy nấm
Aspergillus trên 2 môi trường lỏng này, sau
khoảng 5 ngày, sẽ thu được lượng sinh khối
nấm đủ để tách chiết ADN tổng số Điều
kiện tối ưu của quá trình nuôi cấy này là
200 v/p, ở 28 - 300C (Hình 3A4) Chúng tôi
cũng tiến hành làm các tiêu bản nấm
Aspergillus phân lập được bằng hai cách,
làm tiêu bản với mẫu nấm nuôi cấy trên
môi trường đặc và làm tiêu bản với mẫu nấm nuôi cấy lỏng để quan sát hình dạng bào tử, cuống sinh bào tử, thể bình , so sánh để khẳng định chính xác hơn các loài nấm đã phân lập (Hình 3)
2 Kết quả tách chiết ADN Trong thí nghiệm này chúng tôi đã khảo sát một số phương pháp tách chiết ADN tổng số ở nấm
men, nấm sợi cũng như nấm Aspergillus spp
đã được công bố Tuy nhiên, sau khi thử nghiệm chúng tôi nhận thấy phương pháp tách chiết dựa trên quy trình của Eric W
A
B
Trang 6Boehm với các mẫu nấm nuôi cấy trong
môi trường lỏng là hiệu quả nhất
Vì thế chúng tôi quyết định sử dụng
phương pháp này để tách chiết cho các mẫu
nấm đã được làm thuần mang các đặc điểm
hình thái đặc trưng của nấm A flavus và
nấm A niger Kết quả chúng tôi thu được
15 mẫu ADN tổng số nấm A flavus với
hình ảnh điện di trên gel agarose 1% rõ nét với hàm lượng ADN trung bình từ 300 -
500 ng/µl (Hình 4) và 5 mẫu ADN tổng số
nấm A niger sử dụng làm đối chứng cho
phản ứng PCR Các mẫu ADN tổng số được sử dụng làm sợi khuôn cho phản ứng PCR đặc hiệu với cặp mồi đã thiết kế
Hình 4 Ảnh điện di ADb tổng số các mẫu nấm trên gel agarose 1%
M: Marker λ HindIII; 1 - 4: bấm A flavus bghệ An, 5 - 7: bấm A flavus Hải Dương;
8 - 10 nấm A flavus Hà bội; 11 - 13: bấm A niger bghệ An; 14: bấm A niger Hải Dương
và 15: bấm A niger chuYn
3 Kết quả phân tích bằng phản ứng
PCR đặc hiệu Từ 15 mẫu ADN tổng số
thu được của isolate A flavus chúng tôi
chọn ra 7 mẫu ADN tổng số để làm khuôn
cho thí nghiệm tối ưu hoá điều kiện phản
ứng PCR đặc hiệu với cặp mồi VER Điều
kiện cho phản ứng PCR như đã trình bày ở
phần vật liệu và phương pháp Nồng độ
khuôn ADN tổng số được thay đổi từ 1 ng,
2 ng, 10 ng, 20 ng, 100 ng và 200 ng cho
thể tích phản ứng là 20 µl để tối ưu hoá
nồng độ khuôn ADN Kết quả phân tích
cho thấy khoảng nồng độ thích hợp cho
mồi VER dao động từ 2 - 20 ng, tuy nhiên
ở nồng độ 20 ng các phân đoạn ADN được
khuyếch đại tốt nhất và nồng độ 20 ng
được chúng tôi duy trì để tối ưu hoá nhiệt
độ gắn mồi Việc tối ưu nhiệt độ gắn mồi
là rất quan trọng và trong thí nghiệm này
chúng tôi nhận thấy ở nhiệt độ gắn mồi
500C các băng cần khuyếch đại đều xuất hiện tuy nhiên có xuất hiện những băng không đặc hiệu Ở nhiệt độ gắn mồi 550C, hiệu suất gắn mồi và khuyếch đại gen vẫn được duy trì và các băng không đặc hiệu
đã biến mất
Sau khi đã thiết lập được điều kiện thích hợp cho phản ứng mồi đặc hiệu, chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với tất cả các mẫu ADN tổng số của các mẫu nấm phân lập được và đối chứng được sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu ADN
tổng số của mẫu A niger Kết quả thu
được các băng ADN khuyếch đại có kích thước xấp xỉ 900bp, tương đồng với kích thước lý thuyết đã tính toán là 896bp ở tất
cả các phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là
ADN tổng số nấm A flavus Các isolate
Trang 7A flavus phân lập được ở các vùng sinh
thái khác nhau đều cho kết quả dương tính
với các mồi đặc hiệu, trong khi các chủng
A niger sử dụng làm đối chứng đều cho
kết quả âm tính với các mồi đặc hiệu (Hình
5) Điều này chứng tỏ cặp mồi đã thiết kế
và điều kiện phản ứng PCR chúng tôi thiết
lập được là có thể sử dụng phân biệt loài
A flavus và A niger Điều đó cũng có
nghĩa là phương pháp của chúng tôi hoàn toàn có thể nhận biết được các nấm có khả năng sinh độc tố Aflatoxin với các nấm
không sinh độc tố, bởi các nấm A flavus
được coi là loài sinh độc tố Aflatoxin rất
mạnh trong khi nấm A niger là loài hoàn
toàn không sinh độc tố
Hình 5 Hình ảnh điện di sản phYm khuyếch đại với mồi Ver trên gel agarose 1% M: Marker; 1 - 3: A flavus bghệ An; 4 - 6: A flavus Hải Dương; 7: A flavus Hà bội; C: Đối chứng A niger chuYn Các mẫu có đặc điểm hình thái điển hình của A flavus đều cho băng đặc hiệu ~ 900bp còn mẫu đối chứng là mẫu A niger chuYn không có băng đặc
hiệu (Hình ảnh thu nhận bằng máy chụp ảnh bikon)
IV KẾT LUẬN
Con đường sinh tổng hợp Aflatoxin ở
nấm bệnh Aspergillus đã được nghiên cứu
khá chi tiết ở mức độ phân tử Ít nhất có 20
gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào
con đường này và một số gen quan trọng đã
được giải trình tự và nghiên cứu chức năng
đầy đủ Trong các gen quan trọng tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin, ver,
omt và apa đang được quan tâm và sử dụng
làm gen đích trong các nghiên cứu xác định
nấm Apergillus sinh độc tố Aflatoxin bằng
kỹ thuật PCR (Hình 6)
Trong nghiên cứu có tính chất bước đầu thử nghiệm khả năng sử dụng phương pháp
PCR để chNn đoán nấm Apergillus sinh độc
tố Aflatoxin Chúng tôi đã thiết lập được
phương pháp tối ưu phân lập nấm A flavus,
phương pháp tối ưu tách chiết ADN tổng số
và đặc biệt là chúng tôi đã tối ưu được điều kiện cho phản ứng PCR để có thể chNn đoán
sự có mặt của nấm A flavus với cặp mồi gen ver Đây là cơ sở cho phép chúng tôi tiếp tục
M 1 2 3 4 5 6 7 M C
900bp
1500bp 1000bp 800bp
Trang 8hoàn thiện phương pháp để có thể xác định
các chủng nấm Apergillus có khả năng sinh
độc tố Aflatoxin nhờ phản ứng PCR đặc
hiệu với các gen khác như ver, omt, apa
trực tiếp trên các mẫu lạc nghiên cứu, tạo
một phương pháp bổ sung có hiệu quả nhằm chNn đoán nhanh và chính xác nấm
bệnh Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin
trên lạc cũng như các loại nông sản khác của Việt Nam
Hình 6 Sơ đồ minh họa con đường sinh tổng hợp Aflatoxin B 1 ở nấm bệnh Aspergillus Gen apa là gen điều khiển liên quan đến việc chuyển averufin thành versiconal hemiacetal acetate, dẫn đến sự tập trung acetate cần thiết trước khi bước vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin Gen ver mã hoá cho enzyme chuyển hoá versicolorin A thành
sterigmatocystin và gen omt mã hoá cho enzyme chuyển hoá sterigmatocystin thành
O- methylsterigmatocystin là tiền chất của Aflatoxin B 1
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Kurtzman C.P., et al., 1987 Antonie Leeuwenhoek 53:147-157
Trang 92 Yu J., et al., 2005 Rev Iberroem.Miccil
22:194-202
3 Kolosova A.Y., et al., 2006 Anal
Bioanal.Chem 384:286-94
4 Jarvis B., D.A.L.Seiler., A.J.L.Ould and A.P.William, 1983 J.Appl.Bacteriol
55:325-336
5 Stroka J., Van O R and Anklam E,
2000 J.Chromatoqr.A 904(2):251-6
6 Jaimez J., Fente CA., Vazquez BI., Franco CM., Cepeda A., Mahuziez G., and Pronqnon P, 2000 J.Chromatoqr
A 882(1-2):1-10
7 Bintvihok, A., Y Adachi, and K Hirano,
1992 Toxicon 30:492-497
8 Cheng, R., J Tsay, Y Huang, and R Y Chiou, 2002 J Food Prot., 65:840-844
9 Farber, P., R Geison, and W H Holzapfel, 1997 Int J Food Microbiol
36:215-220
10 Geisen, R, 1996 Syst Appl Microbiol
19:388-392
11
http://csm.colostate-pueblo.edu/biology/dcaprio/351L/Proje ct1351L.html
12 http://www.aspergillusflavus.org/pdfs/C
TAB%20Method.pdf
13
http://www.protocol-
online.org/prot/Protocols/Fungal-Genomic-DNA-Extraction-1200.html
14 http://www.upstate.edu/biochem/amber
g/protocols/yeast_genomic_DNA.html
15 www.fgsc.net/fgn37/borges.html
gười phản biện: gô Vĩnh Viễn
Trang 10T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
10
