Luận án : Khảo sát các biến dị dòng tế bào soma trên chuối tiêu laba (cavendish sp ) in vitro và biện pháp khắc phục

Nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro chuối tạo giống chuối khỏe mạnh, sạch bệnh, giảm tỉ lệ cây biến dị và ổn định về mặt di truyền, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Khảo sát các biến dị dòng tế bào soma trên chuối tiêu Laba (Cavendish sp.) in vitro và biện pháp khắc phục”.

MỞ ĐẦU

Di truyền học thực vật đã phát triển từ khá lâu và có nhiều ứng dụng quan trọng trong cuộc sống hiện đại như mang lại số lượng lớn những loài hoa đẹp, những giống cây cảnh trang trí đặc sắc, những giống cây ăn quả, cây công nghiệp có chất lượng, phẩm chất tốt, mang lại hiệu quả kinh tế cao

Không thể phủ nhận những thành tựu mà kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật đã mang lại trong vài thập kỉ vừa qua, chỉ tính riêng trong lĩnh vực nông nghiệp với sự ra đời của các giống cây trồng mới mang nhiều đặc tính ưu việt đã thay đổi một cách lớn lao bộ mặt nông nghiệp toàn cầu

Vấn đề đặt ra là: ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng như một kỹ thuật mới để tạo sinh khối và là phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây đồng nhất và giống bố mẹ ban đầu Tuy nhiên, theo các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene,… Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh Tập hợp các biến dị di truyền hình

thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng tế bào soma (somaclonal

variation) (Larkin và Scowcroft, 1983) Các biến dị này có thể mang lại những đột biến có lợi hay bất lợi đến chất lượng cũng như mức ổn định di truyền của sản phẩm nuôi cấy mô, trong đó có chuối

Chuối là cây ăn trái rất được ưa chuộng ở hầu hết các nước trên thế giới Ở một

số vùng nhiệt đới ẩm, chuối còn là nguồn cung cấp năng lượng chính Ngoài lượng carbohydrate phong phú, trái chuối còn giàu kali, một chất dinh dưỡng khoáng cần cho hoạt động nhịp nhàng của tim, và chứa nhiều vitamin C, B6, đặc biệt là vitamin

A, loại vitamin thường thiếu hụt trong bữa ăn của người dân vùng nhiệt đới (Smith

và cs, 1992) Vì vậy, việc nghiên cứu nhằm tạo các giống chuối mới có tính đồng nhất về tuổi, sạch bệnh, cho năng suất cao và ổn định về chất lượng rất được quan tâm

Như vậy, trong quá trình nuôi cấy mô chuối trên quy mô công nghiệp với số lượng lớn và trong thời gian kéo dài thì sự xuất hiện của các biến dị dòng tế bào soma có thể có những ảnh hưởng nhất định lên độ đồng nhất và mức độ ổn định về

chất lượng của các cây chuối con Nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro

chuối tạo giống chuối khỏe mạnh, sạch bệnh, giảm tỉ lệ cây biến dị và ổn định về

mặt di truyền, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Khảo sát các biến dị dòng tế bào soma trên chuối tiêu Laba (Cavendish sp.) in vitro và biện pháp khắc phục”.

1 Tổng quan tài liệu

1.1 Sơ lược về cây chuối

1.1.1 Giới thiệu chung về cây chuối

Chuối là loại cây ăn quả nhiệt đới, dễ trồng và thời gian thu hoạch ngắn ngày Theo những giả thuyết của những nhà nghiên cứu thảo mộc và khảo cổ: chuối được thuần hóa ở Đông Nam Á Nhiều loài chuối dại vẫn còn mọc lên ở New Guinea, Malaysia, Indonesia, và Philippines.[34]

Bẹ lá

Rễ: Số lượng rễ thay đổi tùy theo tình trạng sinh trưởng của cây, củ chuối mạnh

có khoảng 200 – 300 rễ Từ khi trồng đến khi cây có trái chín, cây chuối có khoảng

600 – 800 rễ cái

Thân: thân chuối hay còn gọi là củ chuối, nằm dưới mặt đất Đầu phía trên xung quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng vòng cung Ở đây mỗi bẹ lá đều có một chồi mầm, nhưng chỉ các chồi ở từ phần giữa củ đến ngọn củ phát triển được vì vậy thân chuối có hiện tượng mọc trồi dần lên Mô phân sinh ngọn củ cho ra các lá chuối ngay từ khi cây còn nhỏ Phần bên trong củ chuối có 2 phần chính là trục trung tâm và vỏ củ Rễ chuối phát sinh từ hệ thống mạch tiếp giáp giữa vỏ củ và trục trung tâm

Hình 1.2: Cấu tạo củ chuối [35]

Chồi: khi mới mọc, cây chuối con mọc thẳng góc với thân cây mẹ (củ chuối), sau đó hướng dần lên Khi cây con cao được 0,6 – 0,8m thì phần dính với thân mẹ teo lại Cây mẹ có ảnh hưởng ngăn cản sức lớn của các phiến lá trên cây chuối con

Bẹ lá (thân giả): mọc từ thân thật, vươn dài lên cao, cắt ngang bẹ lá thấy có dạng hình lưỡi liềm, giữa phình to 2 – 3cm, mỏng dần về hai bên Ở chuối mọc mạnh thì các bẹ này có xu thế tách nghiêng ra khỏi thân giả, bẹ chính sát vào thân khi cây mọc yếu

Phiến lá: bản lá rộng, mọc đối xứng qua gân chính, phiến lá dày 0,35 – 1mm, có các gân phụ song song nhau và thẳng góc với gân chính Chiều dài phiến lá thường

Trụ trung tâm Đỉnh sinh trưởng

Chồi bên

Rễ

Vỏ củ

thay đổi nhiều hơn chiều rộng, kích thước phiến lá còn tùy thuộc các thời kỳ tăng trưởng của cây chuối, chất dinh dưỡng, các yếu tố khí hậu Một cây chuối đang phát triển tốt thường có từ 10 – 15 lá bàng, trong đó có 4 – 5 lá trên ngọn là quang hợp mạnh nhất

Cuống lá: đỉnh bẹ lá hẹp dần, dày lên tạo thành cuống lá, các bó sợi trong bẹ xếp chặt hơn, nhưng vẫn còn các lỗ thông khí Cuống lá thường dai, chắc để mang nổi phiến lá Cuống lá mọc sau dài hơn cuống các lá mọc trước Phiến lá cuối lớn dần mãi cho đến khi chuối sắp trổ buồng

Hoa và trái:

Hình 1.3: Hoa chuối

- Hoa: chu kỳ sinh trưởng chia làm 3 thời kỳ:

+ Thời kỳ tăng trưởng

+ Thời kỳ tượng buồng: khi cây chuối xuất hiện lá thật thì vòm tăng trưởng chuyển sang sinh sản, đỉnh của vòm củ tăng trưởng có hình chóp, thân củ vươn lên rất nhanh Sự phát triển của buồng hoa khoảng 100 ngày, trong suốt thời gian đó, những hoa nguyên thủy phân hóa không ngừng, đồng thời thân mang buồng hoa tận cùng dài ra để thoát ra khỏi thân giả (bẹ lá)

+ Thời kỳ trổ buồng: khi thân thật đẩy phát hoa ra khỏi thân giả gọi là trổ buồng Từ khi trổ buồng đến khi trái chín trung bình là 3 tháng Buồng hoa: buồng hoa là một phát hoa, trên buồng hoa mọc thành từng chùm (nải hoa) trên chóp của thân thật theo đường xoắn ốc Những chùm mọc sau có số hoa ít dần,

kích thước cũng nhỏ đi Sau khi điểm sinh trưởng đã cho ra một số chùm hoa, thì hoa cái có sự thay đổi đột ngột, lúc này nồng độ hormone đã cạn, khi đó xuất hiện những chùm hoa đực với số lượng rất nhiều Trên mỗi chùm hoa có 2 hàng hoa, chùm hoa phát triển từ phải sang trái luân phiên nhau Hoa cái có nuốm vòi nhụy lớn Hoa đực noãn sào bị thoái hóa, vòi nhụy nhỏ và nhị đực có bao phấn, một ngày sau khi nở, hoa đực rụng Đầu nuốm nhụy cái có mật để thu hút ong bướm

- Trái: Sự phát triển của trái: trọng lượng trái, tỷ lệ thịt trái/vỏ tăng đều trong suốt quá trình tăng trưởng của trái Kích thước trái giảm dần từ nải thứ nhất đến nải cuối cùng, thường nải cuối cùng chỉ đạt 50 – 60% so với nải thứ nhất Trong cùng một nải, trái ở hàng trên lớn hơn trái ở hàng dưới

1.1.3 Các giống chuối ở Việt Nam :[29]

1 Nhóm chuối tiêu AAA (Cavendish) có 3 loại : lùn, nhỏ, cao có trái nhỏ và thơm ngon

2 Nhóm chuối tây ABB (chối sứ, chuối xiêm): gồm các giống chuối tây hồng, tây phấn, tây sứ, được trồng phổ biến ở nhiều nơi, cây cao sinh trưởng khoẻ, không kén đất, có khả năng chịu nóng và chịu hạn song dễ bị héo rụi, quả to, mập, ngọt đậm nhưng kém thơm hơn so với giống khác

3 Chuối bom AAB (bôm): được trồng phổ biến ở Đông Nam Bộ, trái thường được dùng làm ăn tươi, chuối sấy

4 Chuối ngự AA (tiến và mắn): cao 2,5 – 3 m, trái nhỏ, màu vỏ sáng đẹp, thịt quả chắc, vị thơm đặc biệt

5 Chuối ngốp ABB có 2 loại: cao và thấp, cao từ 3 – 5 m trái tương đối lớn, vỏ dầy, nâu đen khi chín, thịt quả nhão, hơi chua

6 Chuối Laba được trồng ở La Ba xã Phú Sơn, Lâm Hà vào đầu thập niên 50 và chỉ sau một thời gian ngắn đã trở nên nổi tiếng, bởi quả màu vàng ánh, dẻo, ngọt và

có mùi hương rất thơm Ngoài ra còn các giống chuối mắn, chuối lá, chuối hột nhưng các giống chuối này có giá trị kinh tế thấp

1.1.4 Giá trị kinh tế, dinh dưỡng và làm thuốc của chuối

 Giá trị kinh tế

Trên thế giới, chuối là loại cây nhiệt đới được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia

và vùng miền trên thế giới, đồng thời cũng chiếm một tỷ trọng đáng kể trong thương mại rau quả toàn cầu Xuất khẩu chuối đứng đầu về khối lượng và đứng thứ hai về kim ngạch, sau cam trong cơ cấu xuất khẩu trái cây của thế giới Theo đánh giá của FAO, tổng kim ngạch xuất khẩu chuối đạt 15,9 triệu tấn vào năm 2004 Cùng với gạo, lúa mỳ, ngũ cốc, chuối cũng là một trong số những mặt hàng chủ lực của nhiều nước đang phát triển.[38]

Việt Nam là nước nhiệt đới và là một trong những xứ sở của chuối với nhiều giống chuối rất quý như: chuối tiêu, chuối bom, chuối ngự, chuối Laba,… với những đặc điểm trên chuối được xem là mặt hàng có triển vọng xuất khẩu ở Việt Nam, nhất là đối với giống chuối già và chuối cau

 Giá trị dinh dưỡng và làm thuốc [28]

Theo Đông y, chuối có vị ngọt, tính bình, có tác dụng nhuận phế, chỉ khát, lợi tràng vị Củ chuối vị ngọt, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc

Theo phân tích khoa học, chuối chín bao gồm nhiều chất bột, chất đạm, chất xơ, sinh tố và khoáng chất Đặc biệt chuối có hàm lượng kali rất cao và chứa đủ cả 10 loại amino acid thiết yếu của cơ thể

Y học dân gian dùng chuối hột để trị sạn thận và sạn mật Sau đây, xin giới thiệu thêm một số công dụng khác của chuối

- Chuối chín có tác dụng làm hạ huyết áp cao

+ Sự tương quan giữa muối natri và kali có liên quan đến việc duy trì độ

pH và sự cân bằng chất lỏng trong cơ thể Trong khi natri (thành phần quan trọng của muối ăn và những thức ăn mặn hàng ngày) có tác dụng giữ lại một lượng nước nhất định tạo gánh nặng cho hệ tim mạch, thì kali lại có tính năng như một chất điện phân giúp thải trừ bớt natri ra khỏi cơ thể

+ Ngoài ra cả hai loại muối này còn liên quan đến việc làm thư giãn cơ bắp Sự thiếu hụt muối kali có thể làm gia tăng trương lực cơ và tương tác xấu đến hoạt động của hệ thần kinh giao cảm Những yếu tố này đều có khả năng làm gia tăng huyết áp

- Chuối là nguồn bổ sung năng lượng hoàn hảo cho hoạt động thể lực

+ Trong những hoạt động thể lực kéo dài khi năng lượng bị hao hụt nhiều, cơ thể phải huy động đến lượng đường trong máu để cung cấp cho cơ bắp Những trường hợp này, đường glucose trong chuối được hấp thu nhanh vào máu và có thể bổ sung tức thì lượng đường bị hao hụt, giúp vận động viên phục hồi sau khi vận động mệt mỏi

+ Ngoài ra chuối còn chứa những carbohydrate khác được chuyển hóa chậm và phóng thích đường vào máu từ từ, có thể đáp ứng cho những hoạt động thể lực kéo dài hàng giờ sau đó

- Chuối xanh chữa bệnh loét dạ dày, tá tràng

+ Chuối xanh được phơi khô ở nhiệt độ thấp có khả năng kích thích sự tăng trưởng của lớp màng nhầy, làm nó dày lên, bảo vệ thành dạ dày khỏi bị loét

và giúp hàn gắn nhanh chóng chỗ loét đã hình thành trước đó

- Chuối chín chữa táo bón và ngăn ngừa ung thư ruột già

+ Thịt chuối chín mềm, mịn nhưng lại chứa nhiều chất xơ không hòa tan Chất xơ không được tiêu hóa tạo thành chất bã hấp thu nước và kích thích nhu động ruột nên có tác dụng chống táo bón rất tốt

Tóm tại, chuối là một nguồn dinh dưỡng quí giá và dễ tìm, dễ ăn, nên được bổ sung vào khẩu phần ăn hàng ngày

1.2 Giới thiệu giống chuối Laba

1.2.1 Đặc điểm phân loại

Dưới chi Eumusa

Tên Việt Nam: chuối Laba thuộc giống chuối tiêu hay chuối già hương.[6, 33] Những năm 20 của thế kỷ trước, khi đi khai hoang ở vùng đất Nam Tây Nguyên, người dân đã mang theo nhiều giống chuối khác nhau đến trồng ở vùng Laba (thuộc

xã Phú Sơn, Lâm Hà, Lâm Đồng) Qua thời gian, người ta thấy chỉ với điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu này có một giống chuối cho ra trái thơm, ngọt, dẻo rất đậm đà, được nhiều người ưa thích Đây cũng là giống chuối nguyên dùng để cung tiến cho vua (chuối tiến vua)

Chuối Laba có 3 nhóm chính: Giống tiêu cao (thường gọi là giống chuối già hương vì khi chín có hương thơm hấp dẫn): cây cao từ 3,5 – 5m, buồng hình trụ, quả thẳng và to, đuôi hơi lõm, ăn ngọt và thơm Năng suất rất cao nhưng khó thu hoạch; cây dễ bị bệnh héo rũ, dễ bị đổ ngã khi gặp gió bão Hiện nay giống chuối này đang có nguy cơ bị tuyệt chủng, số lượng còn lại không đáng kể (rất hiếm gặp) Giống tiêu vừa (thường gọi là chuối già Laba): cây cao 2,8 – 3m, buồng hình trụ, trung bình có từ 10 – 12 nải/buồng (đôi khi nhiều hơn), trái hơi cong, ăn ngọt, thơm

ít Giống tiêu thấp (thường gọi là chuối lùn Laba): cây cao 2 – 2,5m, buồng hình nón cụt, 12 – 14 nải/buồng, trọng lượng bình quân 35 kg/buồng, nhiều buồng đạt tới

50 kg nếu được chăm sóc tốt Giống này hiện chiếm số lượng lớn vì thấp cây, dễ canh tác

Nhưng hiện nay toàn tỉnh Lâm Đồng chỉ có khoảng 100 ha chuối được trồng, trong số đó chỉ còn ít ỏi diện tích là giống chuối Laba năng suất cao, chất lượng tốt Trước nguy cơ lụi tàn của chuối Laba, Sở Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo tồn và phát triển giống chuối này Tại Viện sinh học Nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh đã nhân giống bằng phuơng pháp nuôi cấy mô thành công trên giống chuối này và sản xuất trên quy mô công nghiệp với công suất 1 triệu cây/năm.[30]

1.2.2 Đặc điểm cây chuối Laba

Hình 1.4: Cây chuối Laba

Chuối Laba buồng dài, quả chuối thon có hình dáng đẹp, dài và hơi cong, khi chín có vỏ mỏng, màu vàng tươi Thịt quả có màu vàng sánh, dẻo, ngọt và có mùi

thơm đặc trưng Đã có rất nhiều mô hình trồng chuối Laba chuyên canh có quy mô

từ 0,5 – 1 hoặc 2ha đất và hiệu quả kinh tế cũng khá cao so với nhiều loại cây trồng khác Trồng chuối chỉ một năm là đã được thu hoạch và có thể thu hoạch quanh năm Thu nhập khoảng 100 triệu/năm trên 1ha chuối Laba Chuối Laba rất dễ trồng,

ít tốn công chăm sóc và không phải lo đầu ra cho sản phẩm

1.3 Phương pháp nuôi cấy mô thực vật

1.3.1 Khái niệm nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ

phận tách rời khác nhau của thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý,… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học

Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật,

sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là mẫu vật tương đương với các phương thức nhân giống khác là cành giâm, cành chiết, cành ghép hoặc hạt.[4]

Năm thuật ngữ khác được dùng để chỉ các loại tái sinh sinh dưỡng cơ bản trong

nhân giống in vitro và nuôi cấy mô:

1.3.1.1 Nuôi cấy đỉnh phân sinh [3]

Phương thức nhân giống bằng cách dùng các phần rất nhỏ của đỉnh chồi bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ và mầm lá để kéo dài chồi ngay sau đó Kiểu nuôi cấy này được dùng lần đầu tiên để làm sạch virus ở thực vật Nếu dùng đỉnh phân sinh không thể sống sót và tạo rễ một cách độc lập, thì có thể thay thế bằng phương thức vi ghép

Thành công điển hình trong phương thức này là nhân giống các cây một lá mầm như hoa lan, dứa, huệ và chuối (protocorm hoặc cụm chồi), hoặc cây hai lá mầm như khoai tây, cà chua và cúc (kéo dài chồi),

1.3.1.2 Sinh sản chồi nách [3]

Kiểu nuôi cấy này sử dụng chồi của các điểm sinh trưởng bên và ngọn nơi mà sự kéo dài của chồi tận cùng bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh Sự

điều khiển này cho phép nhân nhanh được các chồi in vitro là các chồi có thể tách

ra và tạo rễ in vitro để hình thành cây trong ống nghiệm hoặc nó có thể được cắt ra riêng biệt tạo thành các cành giâm in vitro để tạo rễ bên ngoài in vitro

Phương thức này thường được áp dụng cho các đối tượng hai lá mầm như cúc,

cà chua, thuốc lá,

1.3.1.3 Tạo chồi bất định [3]

Loại nuôi cấy cho phép hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô sẹo, mà mô sẹo này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới Một số loại mẫu vật được dùng như là đoạn thân (thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải), mảnh lá (thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao), cuống lá (thủy tiên), các bộ phận của hoa (súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá), nhánh củ (họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên), đoạn mầm (măng tây)

1.3.1.4 Phát sinh cơ quan [3]

Thuật ngữ này dùng để mô tả quá trình tái sinh các chồi hoặc/và rễ bất định từ các khối tế bào mô sẹo Quá trình này xảy ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và bắt đầu cảm ứng tạo sẹo Đối với mục đích nhân giống

in vitro, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì

không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹo khi cấy chuyền nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất

1.3.1.5 Phát sinh phôi vô tính [3]

Thuật ngữ này dùng cho sự phát triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh

dưỡng được sản xuất từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro Thuật ngữ tương đương đối với sự phát triển phôi ở thực vật sinh trưởng trong

điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính và phát sinh phôi vô tính Phôi vô tính

có cấu trúc tương tự phôi hữu tính của thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ Phương thức tạo phôi vô tính được ứng dụng rất hiệu quả trong sản xuất hạt nhân tạo

1.4 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro[4]

Quy trình nhân giống vô tính in vitro được thực hiện theo ba (hoặc bốn) giai

đoạn tùy theo cách phân chia của từng tác giả:

- Khử trùng mẫu

- Nhân nhanh

- Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

1.4.1 Giai đoạn I – Khử trùng mẫu

Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau:

- Tỷ lệ nhiễm thấp

- Tỷ lệ sống cao

- Tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả bước khử trùng mẫu này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ,…

Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh

1.4.2 Giai đoạn II – Nhân nhanh

Ở giai đoạn này người ta mới kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác

mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh Những khả năng tạo cây đó là:

- Phát triển chồi nách

- Tạo phôi vô tính

- Tạo đỉnh sinh trưởng mới

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như:

- Bổ sung tổ hợp CĐHTTTV mới (tăng cytokinin giảm auxin) Tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi

- Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1000 lux

- Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20 – 30oC

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích

1.4.3 Giai đoạn III – Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn Giai đoạn này thường bị bỏ qua một cách thiếu căn cứ

Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 – 3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo bệ trước những yếu tố bất lợi sau:

- Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô

- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn

- Cháy lá do nắng

1.5 Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật [3]

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một

số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino acid

- Nguồn cacbon: một số loại đường

- Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô,…

- Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại thạch (agar)

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự

sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro

Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường

- Mục đích nào nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy mô khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống,…)

- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng,…)

1.5.1 Các chất khoáng

Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ: Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các nucleic acid Tương tự, Fe, Zn, và Mo cũng là thành phần của một số enzyme

Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác nhau Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Muối khoáng là các vật liệu (nguồn N, S, P,…) cho sự tổng hợp các chất hữu cơ

N, S, P là các thành phần không thể thiếu của các phân tử protein, các nucleic acid

và nhiều chất hữu cơ khác Ca và H3BO3 được tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là Ca có nhiệm vụ giúp ổn định màng sinh học

Đóng vai trò như một thành phần không thể thiếu của nhiều enzyme (là các cofactor): Mg, Zn, Fe,…và nhiều nguyên tố vi lượng là những thành phần quan trọng của các enzyme

Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật Ví dụ, K và C rất quan trọng trong điều hoà tính thấm chọn lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hoá nhiều enzyme

Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và

đa lượng Việc chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng chủ yếu dựa trên nhu cầu của thực vật đối với các chất này Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố

đa lượng là lớn hơn, với nồng độ > 0,5mM Các nguyên tố vi lượng được sử dụng trong môi trường ở nồng độ < 0,5mM

1.5.2 Các vitamin [20]

Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin

cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác

nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố

giới hạn sự phát triển của chúng Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol

1.5.3 Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy [3,4,21]

Than hoạt tính: bổ sung THT vào môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc Khi bổ sung THT vào môi trường nuôi cấy thì sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hoá phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng làm tác dụng cản đối với thuốc là, đậu nành, trà mi THT nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt:

hút các hợp chất cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng hoặc làm đen môi trường Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của THT trong môi trường là do nó hút chất điều hoà sinh trưởng có trong môi trường NAA, kinetine, IAA, BAP, 2iP liên kết với THT Khả năng kích thích sự tăng trưởng của THT là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy THT thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5 – 3% (w/v) Nói chung bổ sung THT giúp giảm nồng độ bằng cách đào thải các hợp chất độc được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì

Nước dừa: công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và cộng sự (1941,1942) Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây Nước dừa thường được lấy từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ protein, sau đó được lọc qua màng lọc khử trùng trước khi bảo quản lạnh Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn đến kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gặn bỏ phần cặn Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 – 20% (v/v)

Agar: đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và

sẽ chết vì thiếu oxi Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại bằng agar, một loại tinh bột được chế biến từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt của môi trường Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 – 1%

1.5.4 Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật [1,12,13,14,20]

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho nuôi cấy mô, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hoà sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự tăng trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho

mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hoà sinh trưởng nội sinh của chúng

 Nhóm các auxin

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA) IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA

1H-indole-3-là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme hoá auxin (auxin-oxydase) không

có tác dụng

Auxin có tác dụng hoạt hoá các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giãn nỡ của không bào trong tế bào trong phản ứng với áp suất trương Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biếu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ

Auxin là nhóm CĐHTTTV được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác nhau của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hoà sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

- Đặc tính của auxin: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hoá mạch dẫn Auxin hoà tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng (Razdan 1994)

Các auxin liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ,… Đối với nuôi cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hoá rễ Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric acid), IAA (3-indole acetic acid), NAA (Napthelenaxetic acid), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxyacetic acid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic acid) Trong

số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo vào phát triển mô sẹo

 Nhóm các cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormon liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hoá chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin thường được sử dụng nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurin (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purin (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA

và kinetin là các cytokinin nhân tạo Cytokinin hoà tan trong NaOH hoặc HCl loãng

Cytokinin liên quan đến sự phân chia tế bào, phân hoá chồi,… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hoá chồi từ

mô sẹo hoặc các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ Chức năng chủ yếu của cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích sự phân chia tế bào

- Tạo và nhân mô sẹo

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở khí khổng của một số loài

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

Tỉ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi, để tạo mô sẹo và rễ cần có tỉ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi

và chồi nách Vấn đề quan trọng không kém đó là nồng độ của hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng này Chẳng hạn, 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0ppm kích thích

sự tạo thành mô sẹo ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặt dù trong cả hai trường hợp tỉ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 Cơ chế hoạt động của cytokinin chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định

1.6 Hạn chế của vi nhân giống [4]

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến

nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

- Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị dòng tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được những đặc tính của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy mô kéo dài và tăng hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần

được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

1.6.1 Những thay đổi di truyền trong quá trình nuôi cấy mô [18,26]

Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoá của mô và tế bào một số thay đổi di truyền đã xảy ra và được tích luỹ trong các tế bào soma (D‟amato, 1985) Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây được tái sinh từ tế bào soma sẽ là các đột biến Các nhà khoa học đưa ra khái niệm automutagenesis – tự đột biến (đột biến xảy ra không do tác nhân từ bên ngoài gây nên hay là đột biến tự nó) De Vries (1901) – người khởi xướng Học thuyết về đột biến cho rằng cây bị đột biến do tái sinh từ hạt già (có nhiều đột biến đã tiềm ẩn từ trước trong hạt già) Ba mươi năm sau, Nawacin chứng minh đột biến ở hạt già là do các chất tham gia quá trình trao đổi chất và các sản phẩm cặn bã có trong hạt gây nên Các chất này có thể là: hợp chất chứa lưu huỳnh, amin, amino acid, aldehyde, alkloide, phenol, quinone, acid nucleic và các sản phẩm khác Nguyên nhân gây đột biến có thể do cấu trúc bình thường của hạt và tế bào bị phá vỡ - các enzym tiếp xúc với các chất và tạo sản phẩm đột biến

 Khái niệm biến dị dòng tế bào soma:

- Biến dị dòng tế bào soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất

cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy

mô (Larkin và Scowcropt, 1981)

- Biến dị dòng tế bào soma còn gọi là biến dị dòng vô tính

- Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây,

cà chua, mía, chuối, họ cải,… bao gồm đầy đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hoá sinh khác

 Phân loại biến dị dòng tế bào soma:

- Biến dị kiểu gen

+ Đột biến hệ gen: là đột biến về số lượng NST Loại phổ biến là sự sai khác về số lượng NST như đa bội, dị bội hay thể khảm Các loài có độ bội thể cao và nhiều về số lượng NST cao dễ bị biến đổi hơn loài có mức độ bội thể

thấp và ít NST Biến đổi nào xảy ra thường xuyên trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt trong nuôi cấy tế bào trần Những biến đổi này có thể xảy ra từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, do sự phân tách NST không bình thường ở những chu kỳ

tế bào đầu tiên

+ Đột biến NST: là các biến đổi về cấu trúc NST, các thay đổi có thể bao gồm các hiện tượng như: mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (tạo

ra các NST lớn hơn), chuyển đoạn và các biến đổi trong quá trình giảm phân + Đột biến gen (đột biến điểm): là các biến đổi ở mức độ phân tử như sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lượng bản sao của một trình tự đặc thù,

sự thay đổi trong thể hiện của các nhóm đa gen hay sự thể hiện của các gen nhảy Sự xuất hiện của các đột biến này về cơ bản mang tính ngẫu nhiên

- Biến dị kiểu hình: các biến dị kiểu hình thường liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện của một nhóm gen nhất định Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hoá gen Các biến dị kiểu hình thường xuyên xuất hiện ở cây tái sinh sau nuôi cấy như là kết quả của các phản hồi về mặt sinh lý Các thay đổi về kiểu hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể phục hồi trạng thái ban đầu Tuy nhiên chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của các cây tái sinh Biểu hiện của đột biến kiểu hình:

+ Hiện tượng tăng mạnh mẽ khả năng sinh trưởng của các cây tái sinh khi trồng trên đất Biểu hiện này có thể liên quan đến việc trở lại trạng thái trẻ hoá hoặc quá trình loại bỏ virus khỏi nguồn mẫu cấy ban đầu

+ Các ví dụ khác thuộc nhóm này gồm hiện tượng ra hoa sớm, bạch tạng, các thay đổi về hình thái, màu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao cây,…

 Nguyên nhân gây biến dị dòng tế bào soma:

Bất kì một yếu tố có khả năng dẫn đến các thay đổi di truyền đều được xem là như là một nguyên nhân gây ra các biến dị này Các yếu tố này chia ra làm ba nhóm: sinh lý, di truyền, hoá sinh

Hai nguyên nhân chính gây biến dị dòng tế bào soma: tính không đồng nhất di truyền các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu và tác động của các yếu tố trong quá

trình nuôi cấy in vitro

- Sự đa dạng di truyền của tự nhiên của các tế bào nuôi cấy

+ Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đơn tính, từ hạt hay cây con được xem như là đồng nhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có thể có kiểu hình giống nhau Tuy nhiên các mẫu cấy này thực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau như là phloem, xylem, nhu mô, mô vỏ,… Những tế nào này có mức

độ bội thể khác nhau Nói cách khác, có sự đa dạng tế bào giữa các loại tế bào trong cùng một mẫu cấy Sự đa dạng này gọi là đa bội vô tính (Polysomatic) + Ngoài ra còn nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm Chúng chứa những lớp tế bào hoặc mô có cấu trúc di truyền khác nhau được phát triển từ meristem có chứa lớp hoặc bộ phận mô bị đột biến Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở cây thân gỗ

 Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy

+ Phương thức nhân giống in vitro: các phương thức nhân giống khác

nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau Nhìn chung nếu chồi bất định được tái sinh từ một tế bào thì cơ hội để xuất hiện các biến dị dòng tế bào soma thường lớn hơn nhiều từ các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào Các quá trình nuôi cấy mô sẹo, huyền phù hoặc protoplast do đó thường có nhiều biến dị dòng tế bào soma

+ Loại mẫu cấy: các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem thường có mức độ biến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phải đỉnh sinh trưởng như lá, rễ hay protoplast Khả năng xảy ra biến dị dòng tế bào soma còn phụ thuộc vào kiểu gen cũng như tuổi cây mẹ Các dòng cây già thường tiềm ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn các dòng trẻ Các loài có độ bội thể càng cao và số lượng NST càng nhiều thì tính biến dị càng cao

+ Loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật sử dụng: cho các

mô nuôi cấy dài ngày trong môt trường chứa các auxin mạnh như 2,4-D hoặc 2,4,5-T thường gây ra sai khác trong cây tái sinh

+ Thời gian nuôi và số lần cấy chuyền: việc nuôi cấy dài ngày trong

điều kiện in vitro cũng như tăng số lần cấy chuyền cũng sẽ làm tăng khả năng

xuất hiện các biến dị dòng tế bào soma Nguyên nhân của hiện tượng này là do

sự thay đổi của các kiểu methyl hoá bình thường của DNA bộ gen

 Cơ chế tạo biến dị dòng tế bào soma

- Sự thay đổi các kiểu methyl hoá bình thường của DNA bộ gen: quá trình methyl hoá là một quá trình mà một nucleotide cụ thể, thường là Adenine hay Cytosin, có một nhóm methyl gắn liền với nó Khi quá trình methyl hoá xảy ra như vậy trong một vùng mã hoá DNA cho một gen hoạt động, nó đã cản trở gen này và gen bị bất hoạt Việc bất hoạt gen do quá trình methyl hoá có thể không được nhận biết về mặt hiện tượng mặc dù quá trình này đã được tìm thấy trong nuôi cấy mô ở một số loài như ngô, khoai tây, nho

- Sự sắp xếp lại NST: sự mất, nhân đôi và tái tổ hợp vô tính là nguồn chính của biến dị di truyền thể hiện ở các dòng tế bào soma Ví dụ: khi nghiên cứu về cơ chế dẫn đến sự thay đổi trong NST, một số ý kiến cho rằng sự tái bản muộn của vùng dị NST là nguyên nhân chính dẫn đến các biến dị dòng vô tính ở ngô và đậu lớn

- Sự hoạt hoá các nhân tố chuyển vị: sự tách ra hay xen vào của các nhân tố này ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc các gen cấu trúc ở gần nó Hơn nữa sự tách ra không chính xác của các nhân tố chuyển vị có thể tạo ra sự tái sắp xếp của các trình

tự nucleotic phụ Chúng là nguyên nhân của các biến đổi trong biểu hiện gen cấu trúc NST

- Đột biến điểm: chúng có thể là đột biến lặn hay trội Các đột biến gen đã được tìm thấy ở cây cà chua, lúa mỳ, thuốc lá

1.6.2 Ứng dụng của biến dị dòng tế bào soma [18]

- Trong cải tiến giống cây trồng truyền thống, nhà chọn tạo giống phải trồng một số lượng lớn các cây trong nhà kính hay trên đồng nếu như muốn chọn lọc một đặc tính cụ thể nào đó Ngoài ra yếu tố di truyền cũng cản trở đến quá trình chọn lọc

- Các hệ thống nuôi cấy mô tế bào giúp cho các nhà chọn tạo giống cây trồng

có môi trường được xác định rõ ràng, nơi mà áp lực chọn lọc có thể làm trên hàng ngàn các tế bào đơn và có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Như vậy có thể chọn lọc từ lượng rất nhỏ các vật liệu di truyền đồng nhất về di truyền và xây dựng các thử nghiệm nhanh chóng trong vài đĩa petri hay bình nuôi cấy

- Có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hay ngược lại vì điều kiện môi trường đặc thù là có thể tạo ra ở bất cứ đâu

- Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất cao

- Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý

Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả năng chọn lọc

dòng tế bào in vitro Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế bào trong một không

gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn lọc Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến dị di truyền Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các đặc tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt, nhôm, axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả năng kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra Các kiểu gen phân lập kháng với các

điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong chương trình chọn giống

Tuy nhiên, các biến dị có lợi này được biết đến với tỉ lệ không cao, thậm chí là rất thấp Tần số biến dị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen & Karp 1985)

1.7 Những phương pháp sinh học phân tử trong phân tích quan hệ di truyền

ở thực vật: [25]

 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh vào năm 1990 Welsh và cộng sự hoàn thiện vào năm 1991 Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dụng mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên Đến nay, kỹ thuật này đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử Người ta đã sử dụng kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá hệ gen của giống và sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống

- Nguyên lý: kỹ thuật RAPD có cơ sở là kỹ thuật PCR, nhưng sử dụng mồi ngẫu nhiên để nhân bản những đoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ gen

- Thành phần phản ứng: cũng tương tự như phản ứng PCR, các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm:

+ DNA khuôn (DNA template) với nồng độ 5 – 50ng trong 20 – 25µl DNA khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng RAPD, được tách từ các mẫu: virus, vi khuẩn, tế bào thực vật, động vật,… DNA có độ tinh sạch, có thể là sợi đơn, sợi đôi, mạch vòng hoặc mạch thẳng, DNA khuôn được khuếch đại dưới dạng thẳng có hiệu quả hơn dạng vòng Kích thước DNA khuôn nhỏ hơn 3 kb cho kết quả tốt nhất

+ Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotide có trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài 8 – 10 nucleotide Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng RAPD thấp (32 – 40oC) Nồng độ mồi phải thích hợp để đảm bảo kết quả phản ứng (phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết Nếu nồng độ mồi quá cao có thể làm cho hiệu quả phản ứng kém chính xác, do mồi bám vào các vị trí không đặc hiệu Nếu nồng

độ mồi quá thấp sẽ không đảm bảo đủ lượng sản phẩm RAPD Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng thường là 0,1 – 0,5µM

+ Taq-polymerase: là một enzyme quan trọng, có vai trò quyết định đến phản ứng PCR Đây là loại enzyme chịu được nhiệt độ cao trong các loại enzyme Đặc điểm của chúng là có khả năng kéo dài mồi tạo một sản phẩm có chiều dài 8 – 13kb Taq-polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn ở suối nước nóng Thermusaquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA (92 – 95oC) Taq-polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, tồn tại ở nhiệt độ ủ

95oC kéo dài Enzyme này có hoạt tính cao ở 72 – 80oC làm cho phản ứng xảy

ra nhanh, hiệu quả và chính xác

+ dNTP: là các nucleotide tự do được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng RAPD, gồm bốn loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng độ dNTP mỗi loại thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50 – 200µM Nếu nồng độ các loại dNTP quá ít sẽ tạo sản phẩm ít không đủ để phát hiện, ngược lại, nồng độ dNTP quá cao thì phản ứng khó thực hiện

+ Dung dịch đệm: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của phản ứng Dung dịch đệm của phản ứng phải đảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt động của enzyme như: MgCl2, KCl, tris HCl,…Thành phần của dung dịch đệm của phản ứng bao gồm: Tris HCl 10mM (pH 8,3 ở nhiệt độ phòng), KCl 50mM, MgCl2 1,5mM khi ủ ở nhiệt độ phòng Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0,5 – 5mM Thành phần này đóng vai trò quan trọng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn

- Chu kỳ phản ứng

Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn sau:

+ Giai đoạn biến tính DNA: ở nhiệt độ 95oC trong 30 – 60 giây làm cho các liên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt Khi đó DNA sợi đôi tách thành 2 sợi đơn tạo điều kiện cho sự bắt cặp mồi

+ Giai đoạn tiếp hợp mồi: nhiệt độ hạ xuống 32 – 40oC, mồi bám vào đầu 3‟OH của mạch khuôn DNA và bắt đầu quá trình tổng hợp sợi mới

+ Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được nâng lên 72oC thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ kéo dài với sự tham gia của Taq-polymerase

+ Một chu kỳ trên xảy ra, một đoạn DNA được nhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân lên tiếp tục được coi là mạch khuôn để tổng hợp cho chu

kỳ sau

+ Như vậy sau n chu kỳ thí sẽ tạo ra 2n các đoạn DNA giống hệt đoạn DNA khuôn ban đầu Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40 – 45 chu kỳ

- Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD

+ Về mặt kỹ thuật: RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lượng DNA mẫu không cần độ tinh sạch cao, lượng DNA cần ít, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao

+ Về kinh tế: chi phí thực hiện thấp, kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao, tạo sự đa hình nhanh

- Hạn chế của kỹ thuật RAPD: Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp) Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao

 Kỹ thuật AFLP

- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR Kỹ thuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen đã được cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với đoạn tiếp hợp

- Về nguyên tắc, kỹ thuật AFLP tương tự như kỹ thuật RAPD, chỉ có điểm khác biệt là mồi trong phản ứng AFLP gồm hai phần: phần cố định dài khoảng 15

bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dài khoảng 2 – 4 bp Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide có độ phân giải cao Sự đa hình được xác định bởi sự có mặt hay vắng mặt của một phân đoạn DNA

- Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình di truyền trong khoảng thời gian ngắn, lượng DNA đòi hỏi ít, cho sự đa hình cao Kỹ thuật này được đánh giá là

nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng di truyền ở cây trồng, như lúa, lạc, đậu xanh,…

 Kĩ thuật SSR

- SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại đơn giản) hay còn gọi là vi

vệ tinh (microsatellites) Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng đặc trưng cho loài SSR gồm 2 – 5 nucleotide lặp lại nhiều lần Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng

dị nhiễm sắc của NST, như vùng tâm động hoặc các đầu mút Chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa hoạt động của các gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của NST trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật Do

sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản sẽ được phát hiện sau quá trình điện di trên gel agarose hay polyacrylamide

- SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng, do khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Song chỉ thị này có nhược điểm là sự phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao Trong thực tế, chỉ thị này đã

được sử dụng để nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen

 Kỹ thuật Isoenzymes

Kỹ thuật Isoenzymes là kỹ thuật nghiên cứu đa hình enzyme Phương pháp này được đề nghị từ năm 1957 bởi Hunter và Market, sau đó được phát triển bởi Harris (1966) và được sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay

Hiện nay mặc dù các phương pháp sinh học phân tử đã dần thay thế nhưng kỹ thuật Isoenzymes vẫn còn được sử dụng rộng rãi vì cách thực hiện tương đối nhanh

và chi phí thấp thích hợp cho những đề án nghiên cứu xác định mức độ thay đổi di truyền ở mức độ thấp Việc kết hợp kỹ thuật Isoenzymes với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép chúng ta phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện môi trường khác nhau của các giống loài vi sinh vật, động vật, cây trồng (Bernie May, 1992)

- Nguyên lý chung: Isoenzymes là các dạng khác nhau của nhóm enzyme có đặc tính xúc tác cùng kiểu phản ứng hoá học Các isoenzymes này khác nhau do chúng có thành phần và trình tự các amino acid khác nhau trong cấu trúc phân tử

Do đó điểm đẳng điện của chúng cũng khác nhau

1.8 Những nghiên cứu về Musa.sp

Hệ vi nhân giống thương mại cho việc sản xuất giống chuối Cavendish được

thiết lập vào năm 1983 (Hwang và cs, 1984) bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Ma & Shii, 1972) Từ năm 1983 đến 2004, trên 43 triệu cây chuối giống khỏe mạnh được cung cấp cho nông dân để thúc đẩy sự phát triển của ngành xuất khẩu chuối ở Đài Loan Mục tiêu nhân giống bằng nuôi cấy mô là để có được giống cây khỏe mạnh, sạch bệnh, đồng đều và có số lượng lớn (S.W.Lee 2003).[22,15,19]

Vũ Ngọc Phượng và các cộng sự (2009) đã tiến hành nhân giống chuối Laba trên quy mô công nghiệp qua đó cho thấy: chuối tiêu Cavendish sp rất dễ trồng, ít tốn công chăm sóc Nhu cầu trồng chuối từ cây giống bằng cách nuôi cấy in vitro

càng ngày càng lớn trong giai đoạn hiện nay Chính vì thế việc nhân nhanh và đưa

ra thị trường một số lượng lớn những cây giống khỏe mạnh là một nhu cầu của thực tế.[8]

Trần Thị Thanh Hương và cộng sự (2009) đã nghiên cứu về vai trò của chất điều

hòa tăng trưởng thực vật trong sự hình thành rễ bất định từ các khúc cắt mang chồi

ở một vài giống chuối (Musa sp.) [7]

K Kalimuthu và cộng sự (2006) đã nghiên cứu ra môi trường tối ưu để nhân

chồi trong nuôi cấy mô chuối là: môi trường MS có bổ sung 3,0mg/l BA và 0,2mg/l NAA.[16]

Nguyễn Xuân Thụ và cộng sự (2003) đã thực hiện nghiên cứu về quan hệ họ

hàng của các giống chuối thuộc nhóm Cavendish sp bằng kỹ thuật sinh học phân tử

là RAPD để xác định quan hệ di truyền của cây trồng nhằm tạo cơ sở khoa học cho công tác chọn giống cây trồng.[5]

Kh.A El- Dougdoug và cộng sự (2007) đã sử dụng phương pháp Isozymes và

RAPD để phát hiện biến bị dòng tế bào soma trên chuối nuôi cấy mô và đưa ra nhận xét: tần số xuất hiện biến dị dòng tế bào soma phụ thuộc vào số lần cấy chuyền Quan sát qua bất thường hình thái học và sự thay đổi trong chất diệp lục để đánh giá kết quả.[17]

Adel El-Sawy Mohamed (2007) đã nghiên cứu hình thái học và phân tử trên

một số biến thể dòng soma ở chuối bằng cách sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phương pháp RAPD để so sánh biến thể sau khi nuôi cấy với cây tự nhiên Ngoài ra kết quả cho thấy: các biến dị bắt đầu xuất hiện sau lần cấy chuyền thứ 6, đồng thời

có ảnh hưởng bởi nồng độ BA lên sự biến đổi di truyền và các biến dị có thể quan sát ngoài vườn ươm qua hình dạng, kích thước và màu sắc của lá cây con.[9]

Agoreyo, B.O và cộng sự (2008) đã tiến hành phân tích các biến đổi di truyền

giữa các giống chuối bằng kỹ thuật PCR từ đó xác định khoảng cách di truyền và xác định nguồn gen cũng như đặc tính cho mục đích cải tiến và bổ sung hình thái

mô tả của chuối [11]

Michael W.Bairu và cộng sự (2006) đã nghiên cứu hiệu quả của chất điều hòa

tăng trưởng thực vật trên các biến dị dòng soma trên cây chuối Canvendish cho kết

quả: các mẫu thu nhận sau lần cấy chuyền thứ 4 cho thấy: các loại auxin (IAA, IBA,

NAA) cytokinin (BA và TDZ) được sử dụng để nhân chồi qua 10 thế hệ sau đó sử dụng phương pháp RAPD để kiểm tra mức độ biến dị dòng tế bào soma Kết quả thu nhận được cho thấy hiệu quả nhân chồi càng cao thì mức độ biến dị dòng tế bào soma càng lớn (đôi khi lên đến 72%) [23]

1.9 Nhận xét

Chuối là loại trái cây quen thuộc và rất gắn bó với người Việt Nam, là loại trái cây nhiều giá trị dinh dưỡng và chữa bệnh rất thiết thực Hiện nay chuối Laba đang được nhân rộng và trồng với quy mô lớn, mang lại tiềm năng kinh tế cao cho nông

dân Việc đưa ra quy trình nhân giống chuối in vitro hoàn chỉnh tạo một số lượng

lớn cây con đồng đều về chất lượng cũng như ổn định di truyền được đề cao và có giá trị thiết thực

Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy mô nảy sinh vấn đề phát sinh biến dị dòng tế bào soma Cơ sở phân tử của biến dị dòng tế bào soma chưa được biết rõ Bên cạnh

đó, có bằng chứng cho thấy rằng có sự thay đổi trên các phần không ổn định của bộ gen khi tế bào trải qua các giai đoạn nuôi cấy mô có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Do đó, vấn đề đặt ra là cần dự đoán và đánh dấu các biến đổi trên tế bào soma có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô trong thời gian kéo dài và có số lần cấy chuyền cao nhằm đáp ứng tính ổn định về mặt di truyền đối với đặc tính tốt đối với yêu cầu nhân nhanh sinh khối giống cây trồng

Trên cơ sở đó, xây dựng các quy trình nhân giống hợp lý nhằm hạn chế hoặc gia tăng biến dị dòng tế bào soma theo yêu cầu đặt ra của thị trường

- Các mẫu lá thu nhận từ các bình chuối nuôi cấy mô qua các lần cấy chuyền lần lượt 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 trong các thí nghiệm nuôi cấy mô

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

Hoá chất: sử dụng các hoá chất tinh khiết

Các loại dụng cụ và thiết bị máy móc căn bản dùng trong nghiên cứu:

2.1.3 Địa điểm thực hiện nghiên cứu

Bộ môn công nghệ sinh học thực vật và chuyển hóa sinh học, trường đại học khoa học tự nhiên TPHCM, 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, thành phố Hồ Chí Minh

Phần tiến hành ngoài tủ cấy:

- Ngâm các khúc cắt mang chồi trong nước xà phòng loãng (15 phút), rửa sạch

xà phòng dưới vòi nước sạch

- Ngâm vào ethanol 70% (1 phút), rửa sạch ethanol bằng nước cất vô trùng Phần tiến hành trong tủ cấy:

- Ngâm trong dung dịch hypoclorite calcium với nồng độ và thời gian thể hiện

dưới Bảng 2.1

Hình 2.1: Các bước tiến hành lấy mẫu trong thí nghiệm khử trùng

- Sau đó rửa sạch hypoclorite calcium bằng nước cất vô trùng

- Với các thí nghiệm (A): là thí nghiệm không tiến hành khử trùng lần hai trong tủ cấy

- Thí nghiệm (A‟): có tiến hành khử trùng lần hai với hypoclorite calcium 0,75% trong tủ cấy sau khi tiến hành cắt lột mẫu

- Cắt bỏ bớt phần mô bị thương và tách bớt các lớp vỏ bên ngoài bằng dao nhọn và sắc đến khi chỉ còn 3 lớp vỏ trong cùng thì ngưng tách, lúc này kích thước

mô cấy còn khoảng 1cm bề rộng và 1,5 – 2cm chiều cao Mẫu sau tách được cấy vào bình tam giác chứa môi trường MS đặc có bổ sung 20% nước dừa và 0,2g/l THT

- Mẫu được nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 – 28oC, cường độ chiếu sáng 3000lux, độ ẩm 70 – 80%, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày

- Sau 10 ngày thu nhận kết quả khử trùng mẫu và tiến hành thí nghiệm nhân chồi

2.2.1.2 Thí nghiệm nhân chồi

Sau khi các mẫu khử trùng đã ổn định (không nhiễm nấm mốc, khuẩn, mẫu đã lên lá xanh, ngừng tiết phenol) khoảng 7 – 10 ngày, tiến hành chuyển sang thí nghiệm nhân chồi

Mẫu có kích thước trung bình 0,8 – 1,5cm bề rộng, 1,5 – 2cm bề dài Tiến hành huỷ đỉnh sinh trưởng bằng cách chẻ làm hai hoặc làm tư tuỳ theo kích thước của Thời gian (phút)

Nồng độ (%)

mẫu Mẫu sau đó được cấy vào bình tam giác chứa môi trường thí nghiệm nhân chồi với thành phần CĐHTTTV và nồng độ thí nghiệm: mỗi thí nghiệm lặp lại 5 lần, quan sát mẫu sau các khoảng thời gian lần lượt 10, 20, 30 ngày để thu nhận kết quả

Bảng 2.2: Thí nghiệm nhân chồi

2.2.1.3 Thí nghiệm tạo rễ

Sau 6 lần cấy chuyền, chồi chuối được chuyển sang môi trường tái sinh Các chồi được tách rời nhau, tỉa phần lá bẹ hoặc thân bị đen do tiết phenol, cấy vào môi trường MS, 20% nước dừa có chứa NAA và THT, mỗi bình môi trường cấy khoảng

từ 8 – 12 chồi tuỳ theo kích thước Quan sát mẫu sau 15, 30 ngày, cây con nào có thân lá mạnh sẽ chuyển ra ngoài vườn ươm

Nồng độNAA

(mg/l) THT (g/l)

Nồng độ NAA

(mg/l)

2.2.2 Thí nghiệm khắc phục hiện tượng biến dị dòng tế bào soma

2.2.2.1 Thí nghiệm giảm dần nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật tác động trong quá trình nhân chồi

Sau khi tiến hành nhân chồi ở nồng độ thích hợp được đến lần cấy chuyền thứ 5,

từ lần cấy chuyền thứ 6 bắt đầu giảm dần nồng độ của BA cho đến khi kết thúc nghiên cứu Nồng độ BA sử dụng từ lần cấy chuyền đầu tiên đến lần thứ 5 là nồng

độ tối ưu lựa chọn trong thí nghiệm nhân chồi đã thực hiện ở thí nghiệm trên Quan sát và ghi nhận số liệu sau 20 – 30 ngày cấy chuyền về số lượng chồi hình thành, chất lượng chồi,…

Bảng 2.4: Thí nghiệm giảm dần nồng độ độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật tác động trong quá trình nhân chồi

2.2.2.2 Thí nghiệm bổ sung THT trong suốt quá trình cấy chuyền

Dựa trên đặc tính hút độc và kìm hãm tác động CĐHTTTV của THT, tiến hành thí nghiệm nhân chồi có bổ sung THT nồng độ 0,2g/l thêm vào môi trường MS, 20% nước dừa bổ sung BA với nồng độ tối ưu đã lựa chọn trên thí nghiệm nhân chồi trước đó

2.2.3 Tách chiết và tinh sạch DNA

2.2.3.1 Dung dịch, hoá chất :

- Tris-HCl 1M, pH8; dung dịch TE0.1 (10mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA); dung dịch NaCl 5M; hỗn hợp PCI 25:24:1 ( Phenol: Cloroform: Isoamylalcohol); Ethidium bromide 1mg/ml; isopropanol; cồn tuyệt đối; cồn 70% (v/v); nitơ lỏng; DEPC water – Biobasic, Canada

Nồng độ NAA (mg/l)

Nồng độ BA (mg/l)

- Dung dịch đệm chiết DNA: 100mM Tris-HCl (pH 8), 50mM EDTA (pH 8), 1.5M NaCl, 2.5% CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide), 1% β-mercaptoethanol (v/v), 1%PVP (Polyvinuypyrrolidone) (w/v)

- Dung dịch TAE 1X

- PCR Master mix (2X) – Biobasic, Canada; MgCl2

- dNTP Mix, 10mM each - Fermentas, Đức

- Mồi – IDT, USA

2.2.3.2 Quy trình tách chiết và tinh sạch DNA

Mẫu lá thu nhận từ các lần nuôi cấy mô của lần cấy chuyền thứ 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9

và thứ 10 trong tất cả các lô thí nghiệm và một mẫu lấy từ cây non đầu tiên trồng ngoài vườn ươm

- Cân 0,12g lá non, nghiền với nitơ lỏng

- Thêm 800µl CTAB (trước đó cho vào mỗi eppendort 10µl mercaptorthenol), đảo ống vài lần để tái huyền phù bột đã nghiền

β Ủ 650C trong 60 phút, đảo ống mỗi 20 phút

- Thêm 700µl phenol:cloroform:iso-amylalcohol (PCI) (25:24:1) vào mỗi ống, đảo nhẹ nhàng trong một phút, ly tâm 13000rpm trong 15 phút, chuyển lớp dịch nổi phía trên qua eppendorf 2ml mới

- Lặp lại bước trên

- Thêm 500µl Chloroform, trộn đều bằng cách đảo ống nhẹ nhàng, ly tâm ở 10000rpm/5 phút

- Chuyển nhẹ nhàng phần dịch phía trên qua eppendorf 2ml mới có chứa 800µl isopropanol lạnh (khoảng 5 – 10 phút) DNA sẽ tủa ở dạng tơ trắng

- Ly tâm 13000 rpm/3 phút, cẩn thận loại hết isopropanol, thu tủa

- Rửa lại bằng cồn 80o ly tâm 13000 rpm/3 phút, loại cồn, hong khô tủa

- Hoà tan lại với 30µl TE ấm

- Giữ mẫu ở -20oC

- Xác định sự hiện diện của DNA trong dịch chiết thu được bằng cách điện di trên gel agarose 1% đã nhuộm với ethidium bromide 1mg/ml, trong 40 phút ở 100V, sử dụng đệm TEA 1X Quan sát kết quả điện di dưới đèn UV

- Xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong dịch chiết thu được bằng phương pháp đo quang ở các bước sóng 260nm, 280nm DNA tinh sạch được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng

2.2.4 Phân tích sự xuất hiện biến dị dòng soma giữa các mẫu bằng phương

pháp RAPD (Random Emplified Polymorphic DNA)

Phương pháp RAPD được tiến hành theo William và cộng sự

Thực hiện phản ứng RAPD – PCR với 19 mồi, mỗi mồi được dùng để khuếch đại các mẫu DNA thí nghiệm Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản

ứng RAPD – PCR được liệt kê trong Bảng 2.6 và 2.7 Kết quả PCR được phân tích

bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% có nhuộm trước ethidium bromide 1mg/ml Quá trình điện di được thực hiện trong 120 phút với hiệu điện thế 100V, sử dụng dung dịch TAE 1X và thang chuẩn 100bp của hãng Invitrogen Kết quả điện

di được hiển thị dưới đèn UV và được chụp lại qua hệ thống Dolphin Doc

Bảng 2.5: Các mồi ngẫu nhiên được khảo sát trong phản ứng RAPD – PCR