PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN TRONG LÊN MEN RƯỢU VANG KHÓM doc

Hoạt tính lên men của các dòng nấm men phân lập cao hơn so với nấm men Saccharomyes cerevisiae Pháp và dòng nấm men VK1 phân lập từ dịch khóm Vị Thanh lên men tự nhiên có thời gian lên m

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN

TRONG LÊN MEN RƯỢU VANG KHÓM

Nguyễn Văn Thành1, Nguyễn Minh Thủy2, Trần Thị Quế3 và Nguyễn Thị Mỹ Tuyền2

1 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

2 Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

3 Học viên Cao học Công nghệ Thực phẩm và Đồ uống K16

Thông tin chung:

Ngày nhận: 07/08/2012

Ngày chấp nhận: 22/03/2013

Title:

Isolation, selection and

identification of yeast strains for

pineapple wine fermentation

Từ khóa:

Định danh, phân lập, nấm men,

rượu vang khóm, Saccharomyces

cerevisiae

Keywords:

Identification, isolation, yeast,

pineapple wine, Saccharomyces

cerevisiae

ABSTRACT

A study was undertaken with the aim to find out the pure yeasts from pineapple to produce high quality pineapple wine Results of study were followed, 23 yeast strains were obtained from pinapple juices at different treatment conditions (without and with added glucose) in two different ecological zones, Kien giang (Go Quao) and Hau giang (Vi Thanh and Long My) Based on the classification keys of yeasts (morphology, physiology, and biochemistry), the yeast strains were generally characterized as three genera: Saccharomyces, Hanseniaspora and Pichia Fermenting activity of isolated yeasts was higher than commercial yeast (saccharomyes cerevisiae) The isolated yeast strain namely VK1 (from natural fermented pineapple juice – pineapple fruit was collected at Vi Thanh city) has showed the best fermenting activity such as fast fermentation by Durham test (6 hrs) and highest ethanol content (13,26% v/v) Identification of yeast by DNA sequencing showed the superior yeast strain VK1 belong to Saccharomyces cerevisiae

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu tìm ra nấm men thuần để sản xuất rượu vang khóm chất lượng cao Kết quả nghiên cứu như sau, 23 dòng nấm men phân được từ dịch khóm lên men (có và không có bổ sung đường) thu hoạch từ hai vùng sinh thái khác nhau, Kiên Giang (Gò Quao)

và Hậu Giang (Long Mỹ và Vị Thanh) Dựa vào các khóa phân loại của nấm men (hình dáng, sinh lý, sinh hóa) đã xác định các dòng nấm men phân lập được bao gồm ba giống Sacccharomyces, Pichia và Hanseniaspora Hoạt tính lên men của các dòng nấm men phân lập cao hơn so với nấm men Saccharomyes cerevisiae (Pháp) và dòng nấm men VK1 (phân lập từ dịch khóm Vị Thanh lên men tự nhiên) có thời gian lên men nhanh và cho độ cồn cao nhất (13,26% v/v) Bằng phương pháp giải trình tự xác định được dòng nấm men VK1 là Saccharomyces cerevisiae

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Chế biến rượu vang quả đối với các nước

trên thế giới đã là một nghề cổ xưa nhưng ở

Việt Nam chỉ mới xuất hiện vài chục năm gần

đây (Vũ Công Hậu, 1987) Việc tiêu thụ rượu vang tuy không mạnh nhưng từng bước được người tiêu dùng ưa chuộng do có độ cồn nhẹ, hương vị thơm tự nhiên, có tác dụng kích thích tiêu hoá… và rượu vang dần dần được chọn

thay cho các loại rượu mạnh (Vũ Công Hậu,

1987) trong các dịp lễ tết Tuy nhiên, ngành

công nghiệp sản xuất rượu vang ở nước ta vẫn

còn nhiều hạn chế, chưa thực sự đáp ứng được

yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng

Nghiên cứu nâng cao chất lượng rượu vang là

vấn đề rất được quan tâm hiện nay Một trong

những phương pháp cải tiến chất lượng là sử

dụng nguồn nấm men tự nhiên được phân lập từ

nguyên liệu cho quá trình sản xuất rượu vang sẽ

cho rượu có độ cồn cao, chất lượng rượu ổn

định và mùi vị đặc trưng (Lương Đức Phẩm,

2006) Do vậy, mục tiêu nghiên cứu là phân lập

và tuyển chọn các dòng nấm men có hoạt lực

cao từ nước khóm để sử dụng hiệu quả cho tiến

trình sản xuất rượu vang khóm Hoạt động này

giúp cải thiện và tăng cường chất lượng rượu

vang, góp phần đa dạng hóa sản phẩm, nâng

cao giá trị kinh tế của trái khóm Kiên Giang,

Hậu Giang và phần nào đáp ứng nhu cầu sử

dụng các dạng nước uống có cồn đa dạng

hiện nay

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương tiện nghiên cứu

Trái khóm được thu hoạch ngẫu nhiên tại

các huyện Gò Quao (Kiên Giang), Vị Thanh

và Long Mỹ (Hậu Giang) và vận chuyển về

phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực

phẩm, Trường Đại học Cần Thơ Nấm men

Saccharomyces cerevisiae (Pháp) (Sllesaffre

59703 Macrq, France)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập nấm men

Quy trình phân lập: Khóm chín (sử dụng cả

vỏ)  Ép lấy nước  Chỉnh đến 20 oBrix bằng

đường saccharose  lên men 24 giờ ở nhiêt độ

28-30 °C  Nuôi cấy khuẩn lạc trên môi

trường PGA (Potato extract 4 g/l, dextrose 20

g/l, agar 15 g/l) có bổ sung khoáng (NH4)2SO4

và KH2PO4  Phân lập  Tách ròng và làm

thuần  Kiểm tra độ thuần  Cấy và trữ trong

môi trường Sabouraud ở 4 oC

Định danh sơ bộ

Các dòng nấm men được định danh sơ bộ

đến mức độ giống dựa vào các đặc điểm như:

đặc tính nuôi cấy, hình thái tế bào nấm men và

kích thước, quá trình nẩy chồi của tế bào nấm

men, sự hình thành bào tử của tế bào nấm men,

hoạt tính phân giải urea, khả năng đồng hóa đường của nấm men

2.2.2 Khảo sát hoạt tính lên men của các dòng nấm men phân lập thuần chủng và so sánh với nấm men Saccharomyces cerevisiae hiện có trên thị trường

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố (số dòng nấm men phân lập

được tuyển chọn chỉ từ giống Saccharomyces)

và 3 lần lặp lại

Khảo sát hoạt tính nấm men: Nước khóm

tươi được điều chỉnh đến pH 4,5, tổng chất khô hòa tan 20 oBrix, thanh trùng NaHSO3 (120mg/lít), trong thời gian 2 giờ, bổ sung men giống đã được chuẩn bị sẵn Thực hiện lên men

ở nhiệt độ 28-30 °C đến khi kết thúc quá trình lên men (khoảng 10 ngày)

Các chỉ tiêu theo dõi: Sự thay đổi pH, hàm lượng đường sót (%) (phương pháp Lane – Eynone), chiều cao cột khí CO2 (cm) (phương pháp ống Durham), độ cồn tạo thành (% v/v) (phương pháp chưng cất)

Từ kết quả của các thí nghiệm, tuyển chọn được dòng nấm men có hoạt tính lên men tốt cho độ cồn cao

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của địa điểm và điều kiện xử

lý đến khả năng phân lập nấm men từ khóm giống Queen

Kết quả phân lập được 23 dòng nấm men từ nước khóm lên men có hoặc không bổ sung đường), khóm được thu hoạch ở Gò Quao, Vị Thanh, Long Mỹ (Bảng 1) Trong đó, số lượng dòng nấm men được phân lập từ nước khóm (khóm thu hoạch ở Gò Quao) là 9 dòng, nhiều hơn số dòng nấm men phân lập từ nước khóm lấy mẫu ở Vị Thanh (8 dòng) và Long Mỹ (6 dòng) Nấm men phân lập từ khóm ở Gò Quao

và Vị Thanh có 5 hình dạng: hình cầu, hình oval lớn, oval nhỏ, elip dài và elip nhọn Nấm men phân lập từ khóm Long Mỹ không có dòng nấm men oval nhỏ và elip nhọn Gò Quao và Vị Thanh là 2 vùng sản xuất lớn, canh tác khóm gần như quanh năm có lẽ vì lý do này mà đã tạo nên quần thể nấm men đa dạng hơn

Bảng 1: Hình dạng, kích thước của các tế bào nấm men (NM) và khuẩn lạc của các dòng nấm men từ

nước khóm (Gò Quao, Vị Thanh, Long Mỹ) lên men tự nhiên và có bổ sung đường được nuôi cấy trên môi trường PGA

Địa điểm và

điều kiện xử lý Dòng NM Hình dạng NM Kích thước NM (µm) Hình dạng khuẩn lạc

Kích thước khuẩn lạc (mm)

thạch

2

thạch

2

Chú thích: (K) lên men tự nhiên; (C) dịch lên men có bổ sung đường saccharose

Hình dạng nấm men phân lập từ dịch lên

men bổ sung đường đa dạng hơn mẫu phân lập

lên men tự nhiên Việc bổ sung đường giúp các

dòng nấm men ít sự cạnh tranh, tăng sinh khối

tốt hơn và giảm khả năng bỏ sót các dòng nấm

men có mật số thấp trong quần thể ban đầu

(Lương Đức Phẩm, 2006)

Các dòng nấm men tương ứng với mỗi hình

dạng trong hai điều kiện lên men đều có điểm

giống nhau về hình dạng và kích thước tế bào,

đặc điểm khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc hoặc khác biệt không đáng kể (Bảng 1)

3.2 Định danh sơ bộ nấm men (đến mức

độ giống)

3.2.1 Đặc điểm hình thái của 23 dòng nấm men phân lập

Kết quả mô tả đặc điểm hình thái tế bào nấm men cho thấy 23 dòng nấm men có thể xếp thành 5 nhóm hình dạng đặc trưng (Hình 1)

Nhóm 1 Tế bào

hình cầu

Nhóm 2 Tế bào hình oval lớn

Nhóm 3 Tế bào hình elip nhọn

Nhóm 4 Tế bào hình elip dài

Nhóm 5 Tế bào hình oval nhỏ

Hình 1: Hình dạng 5 nhóm nấm men

Nhóm 1 – tế bào nấm men hình cầu có 6 dòng: GK1, GC1, LK1, LC1, VK1, VC1

Nhóm 2 – tế bào hình oval lớn có 6 dòng: GK2, GC2, LK2, LC2, VK2, VC2

Nhóm 3 – tế bào hình elip nhọn có 3 dòng: GK3, GC3, VK3

Nhóm 4 – tế bào hình elip dài có 5 dòng: GK4, GC4, LK3, LC3, VC4

Nhóm 5 – tế bào hình oval nhỏ có 3 dòng: GC5, VK4, VC3

3.2.2 Hình thức nẩy chồi của các nhóm nấm men

Quan sát cho thấy 23 dòng nấm men đều có khả năng nẩy chồi với hai hình thức nẩy chồi là: nẩy chồi nhiều hướng và nẩy chồi lưỡng cực (Hình 2)

Nhóm1 hình cầu

(nẩy chồi nhiều

hướng)

Nhóm 2 hình oval (nẩy chồi nhiều hướng)

Nhóm 3 hình elip nhọn (nẩy chồi lưỡng cực)

Nhóm 4 hình elip dài (nẩy chồi nhiều hướng)

Nhóm 5 hình oval nhỏ (nẩy chồi nhiều hướng)

Hình 2: Hình thức nẩy chồi của các nhóm nấm men

Tế bào nẩy chồi nhiều hướng bao gồm 4

nhóm hình dạng: nhóm 1 nấm men hình cầu

(GK1, GC1, LK1, LC1, VK1, VC1), nhóm 2

nấm men hình oval lớn (GK2, GC2, LK2, LC2,

VK2, VC2), nhóm 4 nấm men hình elip dài

(GK4, GC4, LK3, LC3, VC4), nhóm 5 nấm

men hình oval nhỏ (GC5, VK4, VC3)

Tế bào nẩy chồi lưỡng cực: nhóm 3 nấm

men hình elip nhọn (GK3, GC3, VK3)

3.2.3 Khả năng tạo bào tử trên môi trường nghèo dinh dưỡng

Khả năng tạo bào tử là yếu tố đầu tiên

để phân loại nấm men thuộc lớp nấm túi (Ascospore) hay lớp nấm bất toàn (Fungi imperfect) Hình thành bào tử là một hình thức sinh tồn của nấm men khi gặp điều kiện bất lợi cho hoạt động sống Bào tử thường có vách rất bền và khả năng chịu nhiệt cao (khoảng 70 oC)

Số bào tử xác định được ở các nhóm như

sau: nhóm 1 nấm men hình cầu (GK1, GC1,

LK1, LC1, VK1, VC1): tế bào xuất hiện 1 - 2

bào tử hình tròn; nhóm 2 nấm men hình oval

lớn (GK2, GC2, LK2, LC2, VK2, VC2): tế bào

xuất hiện 1 - 2 bào tử hình tròn; nhóm 3 nấm

men hình elip nhọn (GK3, GC3, VK3): tế bào

xuất hiện 1 - 4 bào tử hình tròn; nhóm 4 nấm

men hình elip dài (GK4, GC4, LK3, LC3,

VC4): tế bào xuất hiện 1 - 2 bào tử hình tròn và

nhóm 5: nấm men hình oval nhỏ (GC5, VK4, VC3): tế bào xuất hiện 1 - 2 bào tử hình tròn

3.2.4 Khả năng lên men đường glucose và saccharose

Kết quả thể hiện ở Bảng 2 cho thấy tất cả 23 dòng nấm men phân lập đều sử dụng được đường glucose, tuy nhiên chỉ có nhóm hình cầu, hình oval lớn và 1 dòng elip dài (LC3) lên men được đường saccharose

Bảng 2: Khả năng lên men đường glucose và saccharose của 23 dòng nấm men phân lập

1 Hình cầu GK1, GC1,

LK1, LC1, VK1, VC1

4,5 cm sau 10 – 12 giờ lên men

Tạo nhiều bọt khí, chiều cao cột khí

2 Hình oval lớn GK2, GC2,

LK2, LC2, VK2, VC2

Tạo bọt nhiều bọt khí nhỏ, chiều cao cột khí

Tạo bọt nhiều bọt khí, chiều cao cột

lên men

3 Hình elip nhọn GK3,

4 Hình elip dài GK4,

Không lên men (ngoại trừ dòng LC3 tạo chiều cao cột khí 4,5 cm sau 32 giờ lên men)

5 Oval nhỏ

Với cùng hình dạng nấm men, thời gian để

cột khí CO2 đạt đến mức 4,5cm đối với lên men

đường saccharose thường chậm hơn lên men

glucose Điều nầy chính là do saccharose là

disaccharide, nên trước khi hấp thụ, nấm men

phải sử dụng enzyme invertase để thủy phân

đường này thành glucose và fructose, sau đó

mới được vận chuyển vào tế bào

3.2.5 Khả năng đồng hóa urea

Trong môi trường Christensen có chứa chất chỉ thị màu phenol red nên môi trường có màu vàng (ở pH môi trường 6,8) Khi nấm men có enzyme urease để phân giải urea tạo thành CO2

và NH3, chính NH3 làm pH môi trường tăng lên trên 8,2 thì môi trường sẽ có màu hồng (bright pink) Trong 23 dòng nấm men, có 4 dòng (GK4, GC4, LK3, VC4) có khả năng tạo ra urease để phân giải urea tạo thành CO2 và NH3 (Hình 3)

Nhóm 1: GK1, GC1,

Hình 3: Màu môi trường Christensen nuôi cấy nấm men sau 6 ngày

Dựa vào khóa phân loại của Kreger-van Rij

(1984), mô tả phân loại sơ bộ đến giống của

Kurtzman và Fell (1998), có thể phân loại sơ bộ

như sau:

Các dòng nấm men thuộc nhóm 1 (hình cầu), nhóm 2 (hình oval lớn) và một dòng hình elip dài (LC3) thuộc giống nấm men

Saccharomyces: GK1, GC1, LK1, LC1, VK1,

VC1, GK2, GC2, LK2, LC2, VK2, VC2, LC3

Nấm men nhóm 5 (hình oval nhỏ) là giống nấm

men Hanseniaspora: GK3, GC3, VK3, GC5,

VK4, VC3 Các dòng nấm men hình elip

dài nhóm 4: GK4, GC4, LK3, VC4 thuộc

giống Pichia

3.3 Khả năng lên men rượu vang khóm của

các chủng nấm men phân lập và nấm

men Saccharomyces cerevisiae

Từ kết quả thí nghiệm trên, 12 dòng nấm

men (9 dòng Saccharomyces: GK1, GK2, LK1,

LK2, LC1, LC3, VK1, VK2, VC2; 2 dòng

Pichia: GK4, VC4 và 1 dòng Hanseniaspore

VK4) có hình dạng khác nhau được chọn để

khảo sát khả năng lên men rượu và so sánh với

nấm men Saccharomyces cerevisiae (Pháp)

3.3.1 Chiều cao cột khí CO 2 ở ống Durham

Trong quá trình lên men rượu có 2 sản phẩm chính là rượu ethanol và CO2, để xác định hoạt lực lên men của nấm men có thể dựa trên khả năng thoát khí CO2 trong quá trình lên men

(Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2003) Trên cơ sở

tạo cột khí CO2 (Bảng 3) trong ống Durham, nhận thấy các dòng nấm men có ký hiệu VC2, VK1, VK2, TM lên men nhanh chóng Các dòng còn lại sau 14 giờ cột khí tạo thành đạt

45 mm Ngoại trừ VK4 và GK4 vẫn không lên

men sau 16 giờ

Bảng 3: Chiều cao cột khí CO2 (cm) của 13 dòng nấm men

Ghi chú: (-) chưa tạo CO2 trong ống Durham

3.3.2 Khả năng lên men rượu của 13 dòng

nấm men

Sau quá trình lên men, pH rượu vang lên

men bởi 13 dòng nấm men đều giảm so với

pH = 4,5 của dịch lên men ban đầu (Bảng 4)

Hoạt động của nấm men trong quá trình lên

men kỵ khí sinh ra CO2 và một số acid hữu cơ

làm giảm pH của dịch lên men (Lương Đức

Phẩm, 2006) Trong đó pH ở mẫu dòng TM và

VK1 chỉ giảm nhẹ, các dòng phân lập còn

lại thấp hơn 4,0 Hai dòng GK4 và VC4

thuộc giống Pichia và VK4 thuộc giống

Hanseniaspore lên men rượu rất thấp từ 1–2%

v/v Riêng GK4 và VC4 tạo lớp màng trắng trên

bề mặt dịch lên men Theo Nguyễn Đức Lượng

và ctv (2003), chúng sinh ra các acid bay hơi

và các chất khác cho mùi vị ester trong bia Khi

có mặt thoáng trong chai, thùng chứa thì chúng phát triển làm cho bia bị đục và giảm chất

lượng Giống Hanseniaspore phát triển ở dịch

quả, dịch đường, malt tạo cặn và có vòng bên thành dụng cụ chứa đựng Đây là loại khá phổ biến trong tự nhiên, thường gặp ở các loại quả chứa đường glucose và fructose, không lên men

hoặc lên men yếu Như vậy 2 giống men Pichia

và Hanseniaspore không thích hợp để chế biến vang khóm 9 dòng Saccharomyces phân lập có

khả năng tạo ethanol là rất khác nhau; trong đó dòng VK1 tạo độ rượu cao nhất (13,26% v/v),

cao hơn dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae chuẩn (11,1% v/v) Các dòng GK1,

GK2 và VC2 tạo được độ rượu trung bình (7,26%; 6,13%, và 8,13%, tương ứng) Các dòng VK2, LK1, LC1, LK2, LC3 tạo rượu rất

thấp (từ 3–4% v/v) Nấm men VK1 và TM có

khả năng lên men kiệt đường trong dịch quả,

đồng thời hàm lượng ethanol cao làm tăng khả

năng bảo quản rượu vang khóm

Như vậy, dòng VK1 được phân lập từ dịch

khóm lên men tự nhiên là dòng nấm men được tuyển chọn từ 23 dòng nấm men phân lập và thể hiện hoạt lực cao nhất với các ưu điểm có thời gian kết thúc cột khí CO2 sớm và rượu có độ cồn cao

Bảng 4: Độ cồn, tỷ lệ đường sót, độ Brix, và pH tạo thành và sau lên men

* Số liệu là trung bình của ba lần lặp lại, các số mang chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sai khác có ý nghĩa

thống kê (p<0,05) theo phép thử LSD

3.3.3 Khả năng chịu cồn của dòng nấm men VK1

Khả năng chịu cồn là đặc tính quan trọng

cho việc sử dụng nấm men trong sản xuất

ethanol công nghiệp (Jimenez và Benitez,

1986) Dịch lên men có chứa 2% glucose và

nồng độ ethanol được bổ sung lần lượt là 0, 6,

9, 12, 15% v/v và mật số nấm men ban đầu là

106 tế bào/ml

Chiều cao ống Durham

Xác định khả năng chịu cồn của nấm men

bởi sự tạo khí CO2 trong ống Durham ở nhiệt

độ 30 oC và mật số tế bào sống trong dịch lên

men ở các khoảng thời gian (0, 24, 48, 72, 96,

120 giờ) Kết quả ở bảng 5 cho thấy thời gian

để chiều cao cột khí CO2 tăng lên đến 4,5 cm

trong điều kiện tăng nồng độ ethanol bổ sung

ban đầu Điều này chứng tỏ nấm men sinh

trưởng và phát triển tốt nhất ở mẫu không có bổ

sung ethanol và tốc độ sinh trưởng giảm dần khi

tăng nồng độ ethanol trong dung dịch Sự tăng

sinh khối của nấm men chậm hơn khi bổ sung

6% ethanol, tuy nhiên cột khí CO2 trong ống

Durham cũng đạt mức tối đa 4,5 cm sau 48 giờ

Trong dịch lên men có bổ sung 9% và 12%

ethanol, khí sinh ra trong ống Durham rất ít vì

nấm men bị sốc ở giai đoạn này, nấm men có thể bị ức chế trao đổi chất Riêng ở mẫu có bổ sung 15% cồn đã vô hoạt hoàn toàn khả năng trao đổi chất của nấm men VK1, không có bọt khí được tạo thành sau 120 giờ lên men

Bảng 5: Chiều cao cột khí (cm) hình thành trong

ống Durham Nồng độ

ethanol (% v/v)

Thời gian (giờ)

0 24 48 72 96 120

Mật số nấm men

Ở mẫu đối chứng 0% cồn và bổ sung 6% cồn thì nấm men phát triển bình thường, sau 48 giờ mật số nấm men đạt 7,9 - 8,9 log cfu/ml (tăng 1,9 - 2,9 log cfu/ml so với mật số ban đầu

là 6 log cfu/ml) (Hình 4) Sau 120 giờ (5 ngày) lên men, mật số nấm men sống ở mẫu 0% và 6% cồn đều giảm còn lại 4,6 - 4,9 log cfu/ml

Có thể do nguồn dinh dưỡng trong dịch lên men

đã cạn kiệt, nấm men chết rất nhiều so với ban

đầu Trong dịch lên men có 9% và 12% cồn, từ

48–96 giờ mật số nấm men giảm không đáng

kể, có thể lúc này nấm men đã thích nghi với

nồng độ ethanol trong môi trường Như vậy

nấm men VK1 có thể chịu được độ cồn 12% vì

ở nồng độ này nấm men vẫn tồn tại nhưng

không thể trao đổi chất với môi trường Khi tăng nồng độ ethanol bổ sung lên 15%, nấm men không thể chịu đựng được cho đến 24 giờ,

có lẻ chúng đã chết hoàn toàn nên không có colony nào xuất hiện trên đĩa môi trường nuôi cấy

Hình 4: Đồ thị thể hiện khả năng

chịu cồn của nấm men VK1

3.4 Định danh dòng nấm men phân lập VK1

bằng phương pháp giải trình tự đoạn

gen 28S rRNA

Dòng VK1 được định danh bằng phương

pháp giải và phân tích trình tự gen 28S rRNA

Kết quả giải trình tự trên đoạn gen 28S rRNA

của dòng VK1 như sau:

TGGCAGTATTCCACAGGCTATAATACTT

ACCGAGGCAAGCTACATTCCTATGGATTT ATCCTGCCACCAAAACTGATGCTGGCCCA GTGAAATGCGAGATTCCCCTACCCACAAG GAGCAGAGGGCACAAAACACCATGTCTGA TCAAATGCCCTTCCCTTTCAACA

Trình tự đoạn gen được giải gồm 168 base nitrogen và đoạn gen này được so sánh với các gen 28S rRNA của nấm men trên Genbank với phần mềm BLASTN

gb|JN417615.1| Saccharomyces cerevisiae strain 1.12 26S ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=587 ; Score = 303 bits (164), Expect = 1e-79

Identities = 167/168 (99%), Gaps = 1/168 (1%); Strand=Plus/Minus

Hình 5: So sánh trình tự gen 28S rRNA của VK1 và của chủng Saccharomyces cevevisiae với số đăng ký

JN417615.1

Kết quả nhận được cho thấy đoạn gen 28S

rRNA của dòng VK1 có độ tương đồng lên đến

99% so với trình tự gen 28S rRNA của

Saccharomyces cevevisiae strain 1.22 với số

đăng ký trên ngân hành gen quốc tế là

JN417615.1 (Hình 5)

Kết quả định danh đã xác định dòng VK1 là

loài Saccharomyces cerevisiae, đây là loài nấm

men hữu dụng trong công nghiệp sản xuất rượu,

nó không chỉ lên men nước quả hay môi trường chứa hàm lượng đường cao mà còn tạo ra sản phẩm lên men với hương vị đặc trưng Chúng

có dạng hình cầu, oval hoặc elip, hình thái thay

Nồng độ ethanol

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

đổi tùy theo loài và môi trường nuôi cấy nấm

men, cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng

cách nẩy chồi, có thể đồng hóa phosphor, kali

và các hợp chất hữu cơ Loài này lên men rượu

có nồng độ tới 16% v/v, nếu dịch lên men là

đường hay sirô có thể làm cho nấm men tạo ra

18% v/v rượu hoặc cao hơn (Pretorius, 2000)

4 KẾT LUẬN

Phân lập được 23 dòng nấm men từ khóm

(giống Queen) thu hoạch ở 3 địa điểm: Vị

Thanh (tỉnh Hậu Giang), Long Mỹ (tỉnh Hậu

Giang) và Gò Quao (Kiên Giang) với 2 dạng

lên men tự nhiên và lên men có bổ sung đường

Dựa trên mô tả các đặc điểm hình thái, đặc

điểm sinh lý bước đầu đã xác định được 3 giống

nấm men Saccharomyces, Hanseniaspora và

Pichia Dòng nấm men VK1 phân lập từ dịch

khóm (trái thu hoạch tại Vị Thanh) lên men tự

nhiên (được tuyển chọn từ 23 dòng nấm men

phân lập) là dòng nấm men có hoạt lực lên men

cao nhất (độ cồn đạt được 13,26% v/v) Thực

hiện định danh bằng phương pháp giải trình tự

đã xác định dòng VK1 là loài Saccharomyces

cerevisiae

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Jimenez, J and Benitez, T 1986

Characterization of wine yeasts for ethanol production Appl Microbiol Biotechnol 25: 150-154

2 Kreger-van Rij N.J.W 1984 The yeast, a taxonomic study, 3th ed., Elsevier, Amsterdam

3 Kurtzman, C P and Fell, J W 1998 The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed, Elsevier, Amsterdam, pp.113-121

4 Lương Đức Phẩm 2006 Nấm men công nghiệp NXB Khoa học và Kỹ thuật

5 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết 2003 Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr 260 – 291

6 Pretorius 2000 Tailoring wine yeast for the new millennium: Novel approaches to the ancient art of wine marking yeast, pp 675 – 729

7 Vũ Công Hậu 1987 Làm vang trái cây trong gia đình Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội