Trên thị trường ngày nay xuất hiện nhiều chế phẩmy học cổ truyền, thực phẩm chức năng có thành phầntừ dược liệu và xu hướng sử dụng những loại thuốc cónguồn gốc từ dược liệu của người dân ngày càng tăng.Do đó, thị trường dược liệu ngày một sôi động, nhưngchất lượng dược liệu đang là một vấn đề nhức nhối củacả cộng đồng. Nhu cầu sử dụng dược liệu ngày càngtăng kéo theo hiện tượng giả mạo, kém chất lượng vànhầm lẫn dược liệu cũng ngày càng phổ biến.Để kiểm tra chất lượng dược liệu cũng như các chếphẩm y học cổ truyền, vấn đề thiết lập dược liệu chuẩncó ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, chúng tôi xây dựngbộ hình ảnh soi bột và sắc ký lớp mỏng của một số dượcliệu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V 1, nhằm cungcấp bộ hình ảnh dữ liệu chuẩn, có ý nghĩa thiết thựcphục vụ cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng dượcliệu và chế phẩm thuốc y học cổ truyền
Trang 1BỘ DỮ LIỆU HÌNH ẢNH SOI BỘT VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA 5 DƯỢC LIỆU CHUẨN ĐỂ THAM KHẢO ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU
TRẦN THỊ KIM NINH, VÕ THỊ HƯỜNG, BÙI THÁI THẢO LY
Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm – Mỹ phẩm Bình Định
Từ khóa: Soi bột, sắc ký lớp mỏng, dược liệu chuẩn, Huyền sâm, Hà thủ ô đỏ, Độc hoạt,
Hy thiêm, Thăng ma
1 Đặt vấn đề
Trên thị trường ngày nay xuất hiện nhiều chế phẩm
y học cổ truyền, thực phẩm chức năng có thành phần
từ dược liệu và xu hướng sử dụng những loại thuốc có
nguồn gốc từ dược liệu của người dân ngày càng tăng
Do đó, thị trường dược liệu ngày một sôi động, nhưng
chất lượng dược liệu đang là một vấn đề nhức nhối của
cả cộng đồng Nhu cầu sử dụng dược liệu ngày càng
tăng kéo theo hiện tượng giả mạo, kém chất lượng và
nhầm lẫn dược liệu cũng ngày càng phổ biến
Để kiểm tra chất lượng dược liệu cũng như các chế
phẩm y học cổ truyền, vấn đề thiết lập dược liệu chuẩn
có ý nghĩa rất quan trọng Vì vậy, chúng tôi xây dựng
bộ hình ảnh soi bột và sắc ký lớp mỏng của một số dược
liệu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V [1], nhằm cung
cấp bộ hình ảnh dữ liệu chuẩn, có ý nghĩa thiết thực
phục vụ cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược
liệu và chế phẩm thuốc y học cổ truyền
2 Thực nghiệm
2.1 Hóa chất, thiết bị
- Kính hiển vi MBL 2000 – T – PL – 30W;
- Máy ảnh kỹ thuật số Sony 16.1;
- Các dung môi, hóa chất, thuốc thử đạt tinh khiết
phân tích và theo qui định của DĐVN V;
- Các thiết bị, dụng cụ thủy tinh cần thiết
2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Các dược liệu chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung ương và Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố
Hồ Chí Minh
- Huyền sâm (Radix Scrophulariae), số lô: 13DL 020;
- Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopiae multiflorae), số lô:
CV 0215018.01;
- Độc hoạt (Radix Angelicae pubescentis), số lô:
CV 0116026.01;
- Hy thiêm (Herba Siegesbeckiae), số lô:
CV 0117080.01;
- Thăng ma (Rhizoma Cimicifugae), số lô: 10062016 Các mẫu thử dược liệu Huyền sâm, Hà thủ ô đỏ, Độc hoạt, Hy thiêm và Thăng ma là mẫu lấy trên thị trường
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp soi bột: Tiến hành theo Dược điển
Việt Nam V [2] Bột dược liệu chuẩn được nghiền và rây qua rây có kích thước lỗ rây 25 µm Quan sát bằng kính hiển vi MBL 2000-T-PL-30W
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Tiến hành theo
Dược điển Việt Nam V [3]
3 Kết quả và bàn luận
3.1 Dược liệu Huyền sâm 3.1.1 Phương pháp soi bột
- Bột màu nâu đen, vị hơi mặn
- Soi kính hiển vi thấy: Nhiều tế bào mô cứng riêng
lẻ hay tụ thành đám, hình chữ nhật, hơi vuông, hơi tròn hoặc hình thoi, thành dày, ống trao đổi nhỏ Mạch gỗ hầu hết là mạch vạch Mảnh bần gồm những tế bào nhiều cạnh đều đặn có thành dày Mảnh mô mềm Hạt tinh bột nhỏ, hình tròn nằm rải rác Mạch điểm Sợi gỗ ( Hình 1)
Trang 2Hạt tinh bột Mảnh bần Mạch điểm
Hình 1 Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Huyền sâm
3.1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng: Silica gel 60 F254.
- Dung môi khai triển: Cloroform – methanol –
nước (12:4:1)
- Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu Huyền sâm
mẫu lấy trên thị trường, thêm 25 ml methanol, lắc đều
và để ngâm 1 h, lắc siêu âm 30 phút, lọc, để bay hơi
dịch lọc đến cạn Thêm vào cắn 25 ml nước, lắc với
n-butanol đã bão hòa nước 2 lần, mỗi lần 20 ml Gộp
dịch chiết n-butanol, cô trên cách thủy đến cạn Hòa cắn
với 5 ml methanol dùng làm dung dịch thử
- Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy 2 g bột Huyền sâm (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở
phần dung dịch thử
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl
mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí Phun dung dịch thuốc thử vanilin 5% trong acid sulfuric Sấy bản mỏng ở 105°C đến khi hiện
rõ vết Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu sắc và cùng giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược
liệu đối chiếu (Hình 2).
Dung môi khai triển Soi UV 254 nm Soi UV 366 nm Phun dung dịch Vanilin5%/H 2 SO 4
Cloroform – methanol –
nước (12:4:1)
Hình 2 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Huyền sâm
Rf = 0,7
Rf = 0,3
Trang 3Mảnh bần Sợi Tinh thể calci oxalat
Mảnh mô mềm Hạt tinh bột Mạch điểm
Hình 3 Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Hà thủ ô đỏ
3.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng: Silica gel 60 F254.
- Dung môi khai triển: Ethyl acetat - methanol - nước
(100:17:13)
- Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu Hà thủ ô mẫu
lấy trên thị trường, thêm 20 ml ethanol 96%, đun hồi lưu
trên cách thủy 30 phút, để nguội, lọc, để bay hơi dịch
lọc đến cạn Thêm vào cắn 10 ml nước và 1 ml dung
dịch acid hydrocloric 10%, đun hồi lưu trong cách thủy
30 phút, để nguội sau đó lắc với ether ethylic 2 lần, mỗi
lần 20 ml Gộp dịch chiết ether, để bay hơi tự nhiên còn
khoảng 1 ml dùng làm dung dịch thử
- Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy 1 g bột Hà thủ
ô đỏ (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả
ở phần dung dịch thử
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng
5 µl mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở trong không khí Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm Sau đó cho bản mỏng tiếp xúc với hơi amoniac Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu và cùng giá trị Rf với các vết trên sắc ký
đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 4).
Ethyl acetat – methanol –
nước (100:17:13)
Hình 4 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Hà thủ ô đỏ
Rf = 0,5
3.2 Dược liệu Hà thủ ô đỏ
3.2.1 Phương pháp soi bột
- Bột mùi nhẹ, màu nâu hồng, vị hơi chát
- Soi dưới kính hiển vi thấy: Nhiều hạt tinh bột đơn
hoặc kép đôi, kép ba, nằm riêng lẻ hoặc kết thành khối,
hình gần tròn, rốn hình sao hay phân nhánh Mạch điểm Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Mảnh bần gồm các tế bào hình đa giác thành dày có màu đỏ nâu Mảnh
mô mềm có tế bào thành mỏng chứa tinh bột Sợi nhỏ dài có vách dày với nhiều ống trao đổi (Hình 3)
Trang 43.3 Dược liệu Độc hoạt
3.3.1 Phương pháp soi bột
- Bột màu nâu nhạt
- Soi kính hiển vi thấy: Nhiều hạt tinh bột hình tròn,
có rốn hạt là một chấm nhỏ ở giữa hoặc dạng kẽ nứt, đứng riêng lẻ hay tụ thành từng đám Mảnh bần màu nâu hình đa giác thành dày Mảnh mô mềm thành mỏng chứa hạt tinh bột Mạch vạch Mạch mạng Sợi dài Ống dẫn dầu, ống dẫn dầu có dịch tiết màu nâu vàng [5](Hình 5)
Dược liệu Độc hoạt Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột Mạch vạch
Hạt tinh bột Mảnh bần Mạch mạng
Sợi Ống dẫn dầu Ống dẫn dầu có dịch tiết màu nâu vàng
Hình 5 Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Độc hoạt
3.3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng: Silica gel 60 F254.
- Dung môi khai triển: Cyclohexan – ethyl acetat – aceton (8:2:0,5).
- Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu Độc hoạt mẫu lấy trên thị trường, thêm 10 ml ether, ngâm qua đêm, lọc
Để bay hơi dịch lọc tới khô, hòa tan cắn trong 2 ml cloroform
- Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy 2 g bột Độc hoạt (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phần
dung dịch thử
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 2 µl mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng
ra, để khô ở trong không khí Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết phát huỳnh quang cùng màu và cùng giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 6)
Trang 5Dung môi khai triển Ánh sáng thường Soi UV 254 Soi UV 366
Cyclohexan - ethyl
acetat - aceton
(8:2:0,5)
Hình 6 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Độc hoạt 3.4 Dược liệu Hy thiêm
3.4.1 Phương pháp soi bột
- Bột màu lục xám
- Soi kính hiển vi thấy: Lông che chở đa bào, dài thường có 6 tế bào đến 8 tế bào xếp thành hàng, vách ngăn giữa
các tế bào phình to đặc biệt, các tế bào càng gần đầu lông càng dài và nhỏ dần Hai loại lông tiết: Loại đầu hình cầu
đa bào, chân đơn bào và loại đầu hình cầu đơn bào, chân đa bào Mảnh biểu bì mang lỗ khí Mảnh mô mềm cấu tạo bởi các tế bào hình tròn, thành mỏng Sợi đứng riêng lẻ hoặc tập trung thành bó, tế bào sợi ngắn và nhỏ, khoang rộng Hạt phấn hoa hình cầu gai tương đối to, gai thưa và nhọn, bề mặt có 3 lỗ rãnh, màu vàng nhạt Mảnh cánh hoa gồm tế bào màu vàng nhạt, thành mỏng Mảnh mạch vạch Mạch mạng (Hình 7)
Hình 7 Hình ảnh soi bột Dược liệu chuẩn Hy thiêm
Rf = 0,4
Trang 63.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng: Silica gel 60 F254.
- Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat - aceton
- acid formic (15:2:2:1)
- Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu Hy thiêm
mẫu lấy trên thị trường, thêm 30 ml ethyl acetat, lắc siêu
âm 30 phút, lọc, để bay hơi dịch lọc tới khô, hòa tan cắn
trong 2 ml ethanol 96% làm dung dịch thử
- Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy 2 g bột Hy
thiêm (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả
ở phần dung dịch thử
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng
10 µl mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng Phun dung dịch thuốc thử vanilin 5% trong acid sulfuric, sấy bản mỏng
ở 1200C đến khi hiện rõ các vết Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng màu và cùng giá trị Rf với các vết trên sắc ký
đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 8).
Dung môi khai triển Ánh sáng thường Soi UV 254 nm Soi UV 366 nm Phun dung dịch thuốc thử vanilin 5%/H
2 SO 4
Toluen - ethyl acetat
- aceton - acid formic
(15:2:2:1)
Hình 8 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Hy thiêm 3.5 Dược liệu Thăng ma
3.5.1 Phương pháp soi bột
Hình 9 Hình ảnh soi bột dược liệu chuẩn Thăng ma
Trang 7- Bột màu xám đen, mùi thơm nhẹ
- Soi dưới kính hiển vi thấy: Tế bào biểu bì [6] có
màu nâu nhạt, hình chữ nhật hoặc hình đa giác thành
dày Mảnh mạch điểm Mạch vạch Mảnh mô mềm
mang thể cứng chứa hạt tinh bột Tế bào mô cứng thành
dày, đứng thành đám hoặc riêng lẻ Sợi libe thành dày,
sợi libe bó hẹp kéo dài Sợi gỗ Tế bào mô mềm hóa gỗ
có hình chữ nhật Hạt tinh bột hình tròn, rốn không rõ,
đứng riêng lẻ hay tụ thành đám, Hình 9
3.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng: Silica gel 60 F254.
- Dung môi khai triển: Toluen – cloroform – acid
acetic (6:1:0,5)
- Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu Thăng ma
mẫu lấy trên thị trường, thêm 50 ml ethanol 96%, đun
sôi hồi lưu 1 h, lọc Để bay hơi dịch lọc tới khô, hòa tan
cắn trong 1 ml ethanol làm dung dịch thử
- Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy 1 g bột dược
liệu Thăng ma (mẫu dược liệu chuẩn), tiến hành chiết
như mô tả ở phần dung dịch thử
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng
10 µl mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy
bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới
ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm Trên sắc ký đồ
của dung dịch thử phải có các vết phát huỳnh quang
cùng màu và cùng giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ
của dung dịch dược liệu đối chiếu (Hình 10).
Dung môi khai triển Soi UV 254nm Soi UV 366nm
Toluen – cloroform – acid acetic (6:1:0,5)
Hình 10 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dược liệu Thăng ma
4 Kết luận
Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn bằng phương pháp soi bột và sắc ký lớp mỏng theo Dược điển Việt Nam V của 5 dược liệu chuẩn Huyền sâm, Hà thủ ô đỏ, Độc hoạt, Hy thiêm, Thăng ma góp một phần nhỏ trong việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho 5 vị dược liệu trên, giúp cho quá trình kiểm tra chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu, phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu
Tài liệu tham khảo
1 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Tập 2, trang 1199, 1180, 1171, 1206, 1336.
2 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Tập 2, PL12.18 “Định tính dược liệu và các chế phẩm
bằng kính hiển vi”, PL-283
3 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Tập 2, PL5.4 “Phương pháp sắc ký lớp mỏng”.
4 Chinese Pharmacopoeia Commision (2015), Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.
5 Hong Kong Chinese Materia Medica Standards (HKCMMS), Volume 2, Volume 8.
6 Indian herbal drug microscopy.
SUMMARY
Examing quality of five herbs including Radix Scrophulariae, Radix Fallopiae multiflorae, Radix Angelicae pubescentis, Herba Siegesbeckiae, Rhizoma Cimicifugae lappae was carried out the method for thin layer chromatography and microscopical followed by Vietnamese Pharmacopoeia fifth edition (VP V).
(Ngày nhận bài: 24/02/2020 ; Ngày phản biện: 10/08/2020 ; Ngày duyệt đăng: 16/12/2020)