Nghiên cứu giá trị Creatine kinase trong chẩn đoán sớm, phát hiện dị hợp tử, bước đầu thăm dò ở mức độ gen của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở trẻ em Việt Nam pdf

Nghiên cứu giá trị Creatine kinase trong chẩn đoán sớm, phát hiện dị hợp tử, bước đầu thăm dò ở mức độ gen của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở trẻ em Việt Nam Nguyễn Thị Trang 1 , Nguyễn

Nghiên cứu giá trị Creatine kinase trong chẩn đoán sớm, phát hiện dị hợp tử, bước đầu thăm dò ở mức độ gen của bệnh loạn dưỡng cơ

Duchenne ở trẻ em Việt Nam

Nguyễn Thị Trang 1 , Nguyễn Thị Phượng 2 ,

Nguyễn Thu Nhạn 2

1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2 Viện Nhi quốc gia

Nghiên cứu 112 bệnh nhân được chẩn đoán là DMD tại Viện Nhi quốc gia dựa trên lâm sàng, xét nghiệm creatine kinase (CK) và tiền sử gia đình, 24 em trai của bệnh nhân chưa rõ triệu chứng lâm sàng cũng được xét nghiệm CK

Để nghiên cứu khả năng phát hiện những bà mẹ dị hợp tử mang gen bệnh bằng định lượng CK:

68 bà mẹ bệnh nhân DMD và 34 bà mẹ bình thường được xét nghiệm CK Mẹ bệnh nhân DMD

được chia làm 2 nhóm tiền sử di truyền (TSDT) rõ, và không rõ

Chiết tách ADN và chạy PCR với một cặp mồi của exon 48 cho 2 bệnh nhân

DMD có TSDT rõ

Nhận xét và kết quả:

- CK có giá trị chẩn đoán xác định bệnh DMD: 100% bệnh nhân DMD có mức CK tăng cao, trung bình là 4111±3154 IU/l gấp 121±93 lần CK trung bình của trẻ em bình thường

- CK có giá trị chẩn đoán sớm bệnh DMD: 17 bệnh nhân DMD chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ có kết quả CK trung bình là 6279±4114 IU/l cao hơn hẳn CK trung bình của trẻ em bình thường có ý nghĩa thống kê (p<0,001)

- CK có giá trị phát hiện sớm bệnh DMD cho các em trai bệnh nhân khi chưa có biểu hiện lâm sàng (11/24 bệnh nhân đã được phất hiện bệnh DMD)

- CK có giá trị phát hiện người nữ dị hợp tử: Khả năng phất hiện dị hợp tử là 82,3% cho nhóm bà

mẹ có TSDT rõ, 35,3% cho nhóm bà mẹ TSDT không rõ

- Dùng phương pháp PCR thăm dò ở mức độ gen của 2 bệnh nhân DMD có TSDT rõ: Kết quả

đột biến ở cả 2 bệnh nhân này không thuộc exon 48

I Đặt vấn đề

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne

muscular dystrophy (DMD)) còn gọi là bệnh

teo cơ giả phì đại, là bệnh di truyền lặn liên kết

nhiễm sắc thể X Người bị đột biến gen

dystrophin dẫn tới không tổng hợp được

dystrophin một protêin của tế bào cơ, làm huỷ

hoại tế bào cơ, giải phóng enzym đặc hiệu

creatine kinase vào máu và biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng giống như Duchenne đã mô tả [1]

DMD là bệnh di truyền có tần số cao và là một trong những bệnh di truyền khó điều trị, biểu hiện lâm sàng muộn khoảng 6-7 tuổi, tiến triển nặng dẫn đến tàn phế, mất khả năng đi lại

và thường chết ở lứa tuổi 18-20 [1]

ở Việt Nam DMD là bệnh hay gặp trên lâm

sàng, chẩn đoán và phát hiện dị hợp tử bằng xét

nghiệm đặc hiệu ADN còn gặp khó khăn, vì

phải áp dụng nhiều phương pháp di truyền phân

tử với đòi hỏi trang thiết bị và hoá chất đồng bộ

mới phát hiện được các loại đột biến gen như:

mất đoạn, nhân đoạn, chuyển đoạn hay đột

biến điểm [2] Vậy làm thế nào có thể chẩn

đoán, đặc biệt chẩn đoán rất sớm trẻ bị bệnh

DMD để kịp thời phát hiện dị hợp tử cho những

người nữ trong gia đình để cho họ lời khuyên

khi họ xây dựng gia đình hoặc muốn sinh con

tiếp theo nhằm hạn chế tỷ lệ sinh con bị bệnh

DMD

Xuất phát từ thực tế trên nghiên cứu này

nhằm 2 mục tiêu:

- Xác định giá trị creatine kinase trong

chẩn đoán, đặc biệt chẩn đoán sớm bệnh DMD

cho bệnh nhi và phát hiện nữ dị hợp tử

- Bước đầu thăm dò ở mức độ gen một số

bệnh nhân DMD

II Đối tượng và phương pháp

nghiên cứu

1 Đối tượng

- 112 bệnh nhân được chẩn đoán là DMD

tại viện Nhi Quốc gia bằng phân tích kết quả

CK có đối chiếu với giai đoạn lâm sàng, tiền

sử gia đình , 24 em trai của bệnh nhân DMD

cũng được xét nghiệm CK cho mục đích chẩn

đoán sớm

- 68 bà mẹ bệnh nhân được chia làm 2

nhóm: tiền sử di truyền (TSDT) rõ và không rõ

- 18 chị em gái của bệnh nhân DMD cũng

được chia làm 2 nhóm TSDT rõ và không rõ

- Nhóm chứng gồm 34 bà mẹ đã sinh các con khoẻ mạnh, không bị các bệnh nhiễm trùng cấp tính được xét nghiệm CK

2 Phương pháp

- Thu thập thông tin: Các bệnh nhân DMD

được thu thập thông tin theo một mẫu bệnh án thống nhất

- Định lượng CK toàn phần huyết thanh Các đối tượng nghiên cứu được xét nghiệm

CK theo phương pháp phân tích động học enzym, sử dụng các kit thuốc thử của hãng Boeringer Mannheim (CHLB Đức), đọc trên máy quang phổ kế Hitachi của Nhật có hiện số

và chương trình hoá trong vùng tử ngoại, bước sóng 340 nm, điều kiện 250 C, rồi tính toán kết quả

Trị số CK thu được từ các bệnh nhân DMD

và các em trai, chị em gái của bệnh nhân dưới

15 tuổi được so sánh với hằng số sinh học CK huyết thanh của trẻ em bình thường, được công

bố bởi H.V.Sơn và CS khoa Hoá sinh Viện Nhi Quốc gia

Trị số CK thu được từ các mẹ bệnh nhân DMD được so sánhvới kết quả CK trung bình của nhóm chứng là các bà mẹ bình thường So sánh kết quả CK của hai nhóm bà mẹ để rút ra nhận xét

- Thăm dò phản ứng PCR với 1 cặp mồi của exon 48 cho 2 gia đình có tiền sử di truyền bệnh DMD (chiết tách ADN xử lý proteinase

K, hoá chất chạy PCR của hãng Sigma)

- Các kết quả thu được, được xử lý theo các thuật toán thống kê

III Kết quả

1 Xét nghiệm CK trong chẩn đoán:

B¶ng 1 KÕt qu¶ xÐt nghiÖm CK trung b×nh cña bÖnh nh©n DMD

KÕt qu¶ CK n Gi¸ trÞ CKTB (IU/l) Sè lÇn t¨ng trung b×nh P

CKTB trÎ em bt (H.V S¬n) 18 ± 16

P < 0,001

KÕt qu¶ CK trung b×nh cña 112 bÖnh nh©n t¨ng cao râ rÖt so víi CK trung b×nh cña trÎ em b×nh

th−êng cã ý nghÜa thèng kª víi P< 0,001

KÕt qu¶ cña CK trong chÈn ®o¸n sím bÖnh DMD

B¶ng 2 KÕt qu¶ xÐt nghiÖm CK cña c¸c bÖnh nh©n ë giai ®o¹n I

17 bÖnh nh©n giai ®o¹n I ch−a cã biÓu hiÖn triÖu chøng l©m sµng râ cã kÕt qu¶ xÐt nghiÖm CK

t¨ng vät, trÞ sè CK trung b×nh lµ 6279,7 ± 4114,2 cao h¬n h¼n CK trung b×nh cña trÎ em b×nh

th−êng cã ý nghÜa thèng kª (P< 0,001)

B¶ng 3 KÕt qu¶ CK cña c¸c em trai bÖnh nh©n DMD

Sè lÇn t¨ng trung b×nh 226,7±155,6

11/24 trÎ trai cã møc CK t¨ng vät chiÕm tû lÖ 45,8%, CK t¨ng trung b×nh lµ 7711,7 ± 5291 IU/l

cao h¬n h¼n CK trung b×nh cña trÎ em b×nh th−êng cã ý nghÜa thèng kª (P<0,001)

2 KÕt qu¶ CK trong ph¸t hiÖn dÞ hîp tö

B¶ng 4 KÕt qu¶ CK cña mÑ bÖnh nh©n DMD

CK t¨ng CK b×nh th−êng

82,3% các bà mẹ DHT bắt buộc (Nhóm M1) có CK tăng cao, còn lại 17,7% các bà mẹ DHT bắt buộc có mức CK bình thường

Nhóm M2: Trong số 51 bà mẹ có 18 bà mẹ có CK tăng (35,3%), số này được xem là DHT đã

được phát hiện Còn lại 33 bà mẹ có kết quả CK bình thường (64,7%)

Bảng 5 Trị số CK tăng trung bình và số lần tăng trung bình của nhóm bà mẹ TSDT rõ và TSDT

không rõ

Bà mẹ nhóm chứng 34 26,9±9,8

CK tăng TB nhóm TSDT rõ 14 272,7±164,6 7,4±4,5 P<0,001

CK tăng TB nhóm TSDT không rõ 18 191±120,5 5,2±3,3 P<0,001

CK tăng trung bình nhóm bà mẹ TSDT rõ

cao hơn hẳn CK trung bình của các bà mẹ

nhóm chứng có ý nghĩa thống kê P<0,001

3 Kết quả PCR

Để thăm dò ở mức độ gen cho 2 bệnh nhân

Phạm Q Kh 8 tuổi và Nguyễn.V Th 8 tuổi

trong gia hệ có 2 thế hệ bị bệnh Chúng tôi tiến

hành phản ứng PCR với 1 cặp mồi của exon 48

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gen

agarose 2% xuất hiện băng 506 bp đặc hiệu cho

exon 48 Chứng tỏ đột biến gen dystrophin của

hai bệnh nhân này không thuộc exon 48

IV Bàn luận

Về giá trị của CK trong chẩn đoán: 112

bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi có

100% kết quả CK tăng cao vọt, trị số thấp nhất

cao gấp 22,8 lần CK của trẻ em bình thường, trị

số cao nhất gấp 558 lần so với trị số tối đa của

trẻ em bình thường Kết quả của chúng tôi phù

hợp với nhận xét của Mendell RJ (1991) [5] và

phù hợp với các tác giả trong và ngoài nước

như: Goedde và CS (1977); Chemnitz (1981);

H.V.Sơn và CS (1987); V.C Dũng(1996) [3, 4]

Để tìm hiểu giá trị của CK trong chẩn đoán

sớm: 17 bệnh nhân thuộc giai đoạn I chưa có

biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ có kết quả

CK trung bình là 6279,7±4114,2 cao hơn hẳn

CK trung bình của trẻ em bình thường có ý nghĩa thống kê( p<0,001), như vậy CK có khả năng phát hiện bệnh DMD rất sớm Bệnh nhân

Ng B Ch được xét nghiệm lúc 14 tháng tuổi kết quả là 2426,5 IU/l cao gấp 71,3 lần so với trị số tối đa của trẻ em bình thường Một bệnh nhân khác Ng.Đ Th được xét nghiệm CK lúc 3 tháng tuổi là 4325IU/l, lúc 6 tuổi bệnh nhân này được xét nghiệm lại kết quả CK là 9079 IU/l mức CK tăng 267 lần so với giới hạn tối đa của trẻ em bình thường Những kết quả nêu trên đã chứng tỏ CK có giá trị trong chẩn đoán sớm bệnh DMD Trong 24 em trai của bệnh nhân DMD chưa rõ triệu chứng lâm sàng, 11/24 (45,8%) có mức CK tăng vọt, mức CK trung bình là 7711,7 ± 5291,0 IU/l cao hơn hẳn

CK của trẻ em bình thường có ý nghĩa thống kê (p<0,001), số lần tăng trung bình là 226,7±155,6IU/l so với trị số tối đa của trẻ em bình thường

Việc chẩn đoán sớm bệnh DMD là rất cần thiết để chỉ định phát hiện dị hợp tử và tư vấn

di truyền

Về giá trị của CK trong phát hiện dị hợp tử của bệnh DMD: Để tìm hiểu về khả năng phát hiện dị hợp tử của CK, chúng tôi chia các bà

mẹ bệnh nhân DMD làm 2 nhóm: Nhóm bà mẹ

có tiền sử di truyền (TSDT) rõ là những bà mẹ

đã sinh từ 2 con trở lên bị bệnh hoặc có 2 thế

hệ trở lên có người bị bệnh, những bà mẹ này là

dị hợp tử chắc chắn được xét nghiệm CK, kết

quả 14/17 (82,3%) có kết quả CK tăng, với

mức CK tăng trung bình là 272,7±164,6 IU/l

cao gấp 7,4±4,5 lần so với kết quả CK của các

bà mẹ bình thường có ý nghĩa thống kê

(p<0,001) Như vậy định lượng CK có giá trị

phát hiện dị hợp tử cho mẹ bệnh nhân DMD

với tỷ lệ 82,3% Nhóm bà mẹ TSDT không rõ,

(những bà mẹ chỉ sinh 1 con bị bệnh DMD,

trong gia hệ không có ai bị bệnh), kết quả CK

của các bà mẹ nhóm này có 18/51 tăng chiếm tỉ

lệ 35,3%, còn lại 64,7% CK bình thường, có 2

khả năng hoặc các bà mẹ này không phải là dị

hợp tử mà do đột biến mới xẩy ra trong quá

trình tạo giao tử hoặc là dị hợp tử nhưng do hạn

chế của phương pháp CK không phát hiện

được Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù

hợp với số liệu của các tác giả khác như:

Margaret (1967) ở Canada, Falcao và CS

(1983) [7], Alvarez (1990) ở Mexico [6]

Để thăm dò ở mức độ gen của 2 bệnh nhân

DMD đã được chẩn đoán xác định Chúng tôi

đã sử dụng cặp mồi cho exon 48 vùng hay xẩy

ra khuyết đoạn, tuy nhiên cả 2 bệnh nhân đều

xuất hiện băng 506 bp Điều này có nghĩa đột

biến không thuộc exon 48 mà thuộc những

exon khác của gen Để phát hiện đột biến gen

cần phải sử dụng nhiều cặp mồi hơn

V Kết luận

1 CK có giá trị trong chẩn đoán và đặc biệt

chẩn đoán rất sớm bệnh DMD khi chưa rõ triệu

chứng lâm sàng

2 CK có giá trị phát hiện người nữ dị hợp tử

lành mang gen bệnh

3 Sử dụng một cặp mồi thuộc exon 48 đã

hiện băng 506 bp đặc hiệu cho exon 48 của 2

bệnh nhân được chẩn đoán xác định là DMD,

tuy nhiên chưa phát hiện được đột biến gen ở

những bệnh nhân này

VI Đề xuất 1.Phương pháp định lượng CK là phương pháp xét nghiệm cho kết quả nhanh và giá thành không cao Vì vậy nên được triển khai áp dụng cho những đối tượng trong chỉ định xét nghiệm để chẩn đoán sớm các trường hợp DMD và phát hiện dị hợp tử cho những người nữ trong gia đình bệnh nhân để tư vấn di truyền nhằm mục đích phòng bệnh

2.Cần thiết phát triển kỹ thuật di truyền phân tử để phát hiện đột biến gen làm cơ sở cho chẩn đoán trước sinh và phát hiện dị hợp tử bệnh DMD cho những phụ nữ mà phương pháp

CK không phát hiện được

Tài liệu tham khảo

1 Jean- Claude Kaplan (1993), Biologie moleculair et pathologie,pp 386-403

2.Van Essen AJ, Kneppers AL, Vander Hout AH (1997), The clinical and molecular genetic approach to Duchenne and Becker muscular dystrophy an updated protocol, J Med Genet, 34 (10), pp.805- 812

3.Hoàng Văn Sơn, Hoàng Hạnh Phúc, Đỗ Ngọc Yến (1987), Xét nghiệm Creatine Kinase

và Lactate dehydrogenase chẩn đoán bệnh teo cơ giả phì đại Duchenne, Tạp chí nhi khoa Tổng hội Y dược học Việt Nam xuất bản; tr 17-24

4 Vũ Chí Dũng (1996) Triệu chứng và chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne trong

điều kiện Việt Nam Luận văn thạc sỹ y học

5 Mendell.R jerry(1991), Muscular dystrophy In: Harrison's principles of Internal medicine, 12th edition, 365, pp 2112-2118 6.Alvarez leal-M; Ortiz-Mariscal-JD (!990) Evaluation of

The activity of creatine phosphokinase for the detection of carriers of Duchenne type Muscular dystrophy in families in the city of

Monteray Mexico,Rev-Invest clin, jan-Mar,

42(1), pp 39-45

7 Falcao-conceicao DN (1983), Detection

of carriers of X-linke® gene for Duchenne

muscular dystrophy by levels of creatine kinase and pyruvate kinase, J-neurol- Sci,62(1-3),pp 171-80

Summary

Value of creatine kinase in early diagnosis, detection

of the heterozygotes, primary research gene level of Duchenne muscular dystrophy in vietnamese patients

112 patients were diagnose® DMD at the National institute of pediatrics based on clinic, family history, creatine kinase (CK) analysis 24 patient's brothers who had not yet expressed clinical figures, examined CK for early detection of DMD 68 DMD patient's mothers, 34 normal mothers were examined CK

Result:

-Value of definitive diagnosis of CK test were 100%: CK levels of 112 patients were 4111±3154 IU/l higher than CK levels of normal children (p,0,001): 121±93 times higher

- The CK method can detect very early DMD even patients who were not yet clinical expression:

CK results of 17 DMD patients of first stage were 6279±4114 IU/l higher than CK results of normal children (p<0,001) 11/24 patient's brothers were not yet clinical expression detected DM D by CK higher than normal child (p<0,001)

- Value of CK for heterozygote detection was 82,3% for DMD patient's mothers who had clearly family history and 35,3% for DMD patient's mothers who had only one child with DMD in the family

- Gene mutation of two DMD patients with clearly family history had not belonged to 48 exon based on PCR result analysis