Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên mặt ngoài bằng kỹ thuật GINs Nguyễn Kim Giao Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương GINS là kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử, kết hợp kỹ
Trang 1Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên
mặt ngoài bằng kỹ thuật GINs
Nguyễn Kim Giao
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
GINS là kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử, kết hợp kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gián tiếp với kỹ thuật nhuộm âm để nghiên cứu kháng nguyên mặt ngoài của các mẫu hạt vi sinh vật như vi rút, vi khuẩn, các mảnh vỡ tế bào.v.v Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trên vắc xin viêm não Nhật Bản, vắc xin viêm gan B và vi khuẩn salmonella Những kết quả chứng tỏ rằng các mẫu trên không những có cấu trúc hoàn chỉnh mà kháng nguyên mặt ngoài có tính đặc hiệu cao
I Đặt vấn đề
Miễn dịch hiển vi điện tử (IEM) là sự kết
hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹ thuật hiển vi
điện tử để định vị các thành phần miễn
dịch đặc hiệu, các đại phân tử sinh vật Khi
mà hoá mô miễn dịch sử dụng hiển vi
quang học để nghiên cứu phản ứng miễn
dịch xẩy ra ở mức mô và tế bào thì hoá
miễn dịch tế bào sử dụng EM để nghiên
cứu phản ứng miễn dịch xẩy ra ở mức các
đại phân tử và siêu cấu trúc tế bào
Nhờ kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử
có thể xác định vị trí của các chất như định
vị các protein đặc hiệu trong hoặc trên mặt
vi khuẩn, tế bào, bào quan; dò tìm các
kháng nguyên mặt ngoài của vi rút; định vị
các chuỗi DNA hoặc RNA đặc hiệu trong
các tế bào.v.v
Hiện nay phương pháp miễn dịch hiển
vi điện tử bao gồm nhiều kỹ thuật, sử dụng
những thiết bị và hoá chất chuyên dụng
khác nhau đã được ứng dụng rộng rãi
Kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử được
ứng dụng tại phòng thí nghiệm hiển vi điện
tử của Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương
(VSDTTU) là kết hợp kỹ thuật miễn dịch
với kỹ thuật nhuộm âm và kỹ thuật lát cắt
siêu mỏng sau đúc
Trong bài này chúng tôi trình bầy việc ứng dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng gián tiếp với kỹ thuật nhuộm âm bản
và gọi tắt là kỹ thuật GINS
II Vật liệu, thiết bị và phưong pháp
1 Vật liệu và mẫu
- Vật liệu: gồm lưới niken với màng đỡ
phủ các bon và các hoá chất là glutaraldehyde, đệm PBS, BSA, ammonium acetate, uranyl acetate, uranyl formate
- Mẫu: Mẫu nghiên cứu thường là mẫu
bệnh phẩm dạng lỏng có chứa virut, vi khuẩn, các văc xin vi rút v.v Sau khi xử lý theo những phương pháp riêng (loại bỏ bất
kỳ những dung dịch, hóa chất hoặc những phụ gia nào bao quanh mà có thể làm thay
đổi hoặc ngăn cản thuốc nhuộm âm thâm nhập vào mẫu) mẫu cần phải có ít nhất về nồng độ là 5.0x107
hạt/ ml và thể tích là 50àl
Ba loại mẫu sau dùng trong nghiên cứu:
- Mẫu vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản loạt số L24/1999 và kháng thể dặc hiệu,
- Mẫu kháng nguyên bề mặt vi rút vắc
Trang 2xin viên gan B loạt số L44/2000 và kháng
thể đặc hiệu Cả hai loại mẫu trên và các
kháng thể đặc hiệu tương ứng nhận từ
Công ty văc xin và sinh vật phẩm số 1
- Mẫu vi khuẩn salmonella và kháng thể
đặc hiệu H (nhận từ Khoa vi khuẩn, Viện
Vệ sinh dịch tễ trung ương)
2 Thiết bị
- Kính hiển vi điện tử truyền qua:
JEM 1010 (JEOL, Japan) với điện áp
gia tốc chùm điện tử 30-100KV, độ phóng
đại 50-600.000x, độ phân giải 3A0.
Các ảnh được chụp trên phim FUJI-FG,
in trên giấy ảnh Sterlin và lưu trên đĩa cứng
của hệ Digital camera-Computer đi kèm
với JEM1010
3 Phương pháp
3.1 Kỹ thuật đánh dấu kháng nguyên gián tiếp:
Nguyên tắc của kỹ thuật là trước tiên kháng nguyên kết hợp với kháng thể đặc hiệu trong một thời gian nhất định Sau khi rửa để loại các kháng thể đặc hiệu thừa không kết hợp, cho kháng kháng thể phát hiện và liên kết với phức hợp kháng nguyên - kháng thể kể trên Do Protein A
có thể liên kết với phần Fc của một số Immunoglobulin (đặc biệt là IgG) của vài loài lại có thể cộng hợp với các chất đánh dấu siêu cấu trúc-các đích điện tử là các hạt vàng có đường kính từ 5 tới 10nm, nên thay vì sử dụng kháng kháng thể (kháng thể thứ hai) là dùng ProteinA có gắn vàng Dưới kính hiển vi điên tử có thể thấy được các hạt vàng, tức là thấy được vi trí kháng nguyên trong mẫu Hình 1 minh hoạ kỹ thuật đánh dấu gián tiếp kháng nguyên
KN IgG đặc hiệu KN - IgG đặc
hiệu
ProteinA-Au KN - IgG đặc hiệu -
Protein A-Au
Hình 1 Kỹ thuật đánh dấu kháng nguyên gián tiếp
3.2 Kỹ thuật nhuộm âm:
Đây là kỹ thuật làm mẫu hiển vi điện tử
đơn giản nhanh và có độ phân giải cao
Mẫu dạng dịch treo của những hạt như vi
rút, vi khuẩn được đưa lên lưới và sau đó
trải đều một lớp thuốc nhuộm bao quanh
những hạt mẫu Thuốc nhuộm cản chùm
tia điện tử còn hạt mẫu cho chùm tia điện
tử đi qua và hoạ lên cấu trúc của hạt mẫu
nghiên cứu trên màn quan sát
3.3 Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng với nhuộm âm - Kỹ thuật GINS
Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng
và nhuộm âm (kỹ thuật GINS) xuất phát từ
kỹ thuật đơn giọt (Hayat và Miller 1990) và
được tiến hành như sau:
1 Các giọt 20àl mẫu vi rút đặt trên bề mặt một miếng parafilm sạch
2 Lưới có màng collodium phủ các bon ngậm nước còn ướt (làm bằng cách ngâm
Trang 3trong dung dịch bacitracin 0,01%) được đặt
lên giọt mẫu để thu lấy các vi rút trong
5-10 phút
3 Rửa lưới bằng cách đặt liên tiếp trên
2-3 giọt PBS
4 Đặt nổi lưới trên giọt PBS-BSA 2%
để phóng bế các vị trị kháng nguyên
không đặc hiệu, trong 20 phút
5 Đặt nổi lưới trên giọt kháng thể đặc
hiệu thứ nhất pha loãng trong PBS-BSA
0,5%, trong 20 phút
6 Rửa lưới thận trọng bằng PBS - BSA
0,2%
7 ủ lưới trong protein-A gắn vàng (5
hoặc 10nm) trong 20 phút
8 Rửa lưới bằng cách đặt liên tiếp trên 2-3 giọt PBS
9 Cố định nhanh trong glutaraldehyde 0,1% trong 1 phút
10 Rửa kỹ lưới với ammonium acetate 0,1%
11 Nhuộm âm với uranyl acetate hoặc uranyl formate 1%, pH 5,4
12 Các lưới được làm khô dần trước khi quan sát
Trong quá trình tiến hành, các lưới không được để khô và thận trọng giữ cho
l-ưới nổi trên mặt giọt Hình 2 là qui trình làm mẫu kể trên
Hình 2: Đánh dấu miễn dịch gắn vàng và nhuộm âm tiêu bản
III Kết quả
1 Vi rút vắc xin viêm n∙o Nhật Bản
và kháng nguyên bề mặt HBsAg
Hình 3 và hình 4 là các ảnh của vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản và HBsAg Chúng tôi nhận thấy quanh những hạt vi rút của cả hai loại đều được bám bởi
Vi rút
Lưới
BSA
2 % PBS
5-10 phút
Phóng bế
20 phút
Lưới
Kháng thể kháng virút
20 phút
Parafilm
Rửa 3 lần
5 phút
BSA 0.2%
Protein
Parafilm
acetate 0,1%
PBS
1 % UA
trên kính HVĐTTQ Rửa 3 lần
5 phút
Parafilm Parafilm
Trang 4những hạt vàng (hạt đen tròn với đường
kính dAu=5nm dùng cho VXVNNB (►) và
dAu=10nm dùng cho HBsAg (→) Những
kết quả thu được trên ảnh xác nhận rằng
cả hai loại mẫu không những có cấu trúc
hoàn chỉnh mà còn mang đặc tính kháng
nguyên cao
2 Mẫu vi khuẩn samonella
Hình 5 là ảnh của vi khuẩn salmonella Thân vi khuẩn dầy nên nhận được ảnh tối không rõ siêu cấu trúc Trên những lông của vi khuẩn (→) bám đầy những hạt vàng xác nhận rằng trên lông vi khuẩn mang kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể H
Hình 3 ảnh vi rút vắc xin viêm não Nhật Bản đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS
Hình 4 ảnh của HBsAg đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS
Trang 5Hình 5 ảnh của vi khuẩn salmonella đánh dấu MDHVĐT theo kỹ thuật GINS
IV Bàn luận
Kỹ thuật đánh dấu miễn dịch gắn vàng
nhuộm âm được sử dụng để phát hiện ra
sự có mặt hoặc sự vắng mặt của những
protein, những kháng nguyên và những đại
phân tử khác ở trên bề mặt những mẫu
sinh vật trong dịch treo Những hạt virút,
những mảnh tế bào, vi khuẩn, những mẫu
lipoprotein và những mẫu sinh vật nhỏ
khác đều có thể đánh dấu miễn dịch khi sử
dụng kỹ thuật này
Về mặt kỹ thuật các kháng nguyên mặt
ngoài của vi sinh vật hay kháng nguyên
nằm mặt ngoài tế bào là các kháng
nguyên có thể quan sát dễ dàng nhất, vì
các kháng thể và các phần tử đánh dấu có
thể đi đến một cách tự do Trong nghiên
cứu ứng dụng này chúng tôi sử dụng chất
đánh dấu là keo vàng gắn trước với Protein
A nên tính ổn định của nó rất cao đồng
thời lại có thể lựa chọn Protein A gắn hạt
vàng có các đường kính khác nhau
(5-10nm) cho phù hợp với từng mẫu nghiên
cứu
Kỹ thuật miễn dịch gắn vàng thực hiện trên mẫu sinh vật trước khi cố định hóa học nên có nhiều lợi thế hơn những kỹ thuật
đánh dấu miễn dịch chuẩn khác Kỹ thuật cho thấy được siêu cấu trúc của mẫu bao gồm những chi tiết trên mặt, các thành phần bên trong, cung cấp những thông tin trực tiếp và đầy đủ về mặt hình thái và nguyên tắc cấu tạo của các vi rút và xác
định được vị trí các kháng nguyên protein hoặc đại phân tử nhờ những hạt vàng định
vị
Thực tế cho thấy những lượng nhỏ các immunoglobulin không bị phát hiện bằng các phương pháp phân tích sinh hoá hoặc miễn dịch, nhưng một lượng rất nhỏ IgG của người cũng có thể nhận ra được trong các mẫu HBsAg bằng phương pháp GINS
Điều đó chứng tỏ rằng phương pháp này là thích hợp để kiểm tra chất lượng các mẫu văc xin trong quá trình tinh chế
Những điều lập luận trên cũng hoàn toàn có giá trị với vi khuẩn kích thước nhỏ
cỡ hơn àm mà ở đây là tiêm mao của
Trang 6Salmonella Kỹ thuật GINS cho phép
quan sát trực tiếp vi khuẩn không những
hình thái cấu trúc mà còn xác định đ−ợc
chính xác vị trí kháng nguyên trên vi khuẩn
góp phần định loại
III Kết luận
Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật GINS
trên vắc xin viêm não Nhật Bản, vắc xin
viêm gan B và vi khuẩn salmonella Những
kết quả chứng tỏ rằng các mẫu trên không
những có cấu trúc hoàn chỉnh mà kháng
nguyên mặt ngoài có tính đặc hiệu cao
Tài liệu tham khảo
1 Dawes, C J 1971 Biological
Techniques in Electron Microscopy
Barnes and Noble Inc., New York 233 pp
2 Doane, F W., and N Anderson
1987 Electron Microscopy and Diagnostic Virology Cambridge University Press, Cambridge 194 pp
3 Hayat, M A 1989 Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications CRC Press, Boca Raton, FL 469 pp
4 Hayat, M A., and S E Miller
1990 Negative Staining McGraw Hill, New York 345 pp
5 Miller SE Diagnostic virology by electron microscopy ASM News 1988; 54:475
Summary Immunoelectronmicroscopic localization of
surface Antigens by GINS technique
GINS is immunoelectronmicroscopic technique combinated indirect immunolabelling technique and negative stainning technique in order to investigate surface antigens of particle specimens, such as virus, bacteria, debris of cell This applicant investigation carry out on virus of JEV, HBsAg and salmonella The results proved that samples not only have complete structure but also surface antigens with high specifity
