Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn mẫu dịch não tuỷ cho phân lập virut do muỗi truyền từ bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam potx

Từ 7 mẫu DNT xác định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của nhóm virut do muỗi truyền, phân lập đ-ợc 7 chủng virut, trong số này có 5 chủng là virut VNNB, 1 chủng là virut thuộ

ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn mẫu dịch não tuỷ cho phân lập virut do muỗi truyền từ bệnh nhân

có hội chứng não cấp ở miền bắc việt nam

Phan Thị Ngà, Mary B Crabtree*

Viện Vệ sinh dịch tễ trung -ơng (VSDTTƯ), Hà Nội

*Trung tâm kiểm soát bệnh tật, Fort Collins, Colorado

virut, kỹ thuật này nhạy nh-ng chỉ có thể ứng

I Đặt vấn đề

dụng để định loại sự hiện diện vật liệu di Trong những năm gần đây, có rất nhiều

truyền của những virut đã biết [8, 9, 10] căn nguyên virut gây HCNC mới đ-ợc phát

Trong thực tế vật liệu di truyền của nhiều virut hiện, hoặc mới thấy xuất hiện ở những vùng

nh- là một túi cóp nhặt (grap-bags), nó có tr-ớc đây ch-a có sự l-u hành của những

đ-ợc một số gen từ vật chủ của nó cũng nh- virut này ví dụ nh- virut Hendra, virut viêm

có đ-ợc một số gen từ những virut khác Do não Nhật bản (VNNB) ở Australia, virut Nipah

vậy vật liệu di truyền của nhiều virut trong các

ở Malaysia, virut West Nile ở Mỹ [6, 8] ở Việt

họ khác nhau trong phần lớn các tr-ờng hợp Nam theo số liệu thống kê, hàng năm có

rất khác nhau, nh-ng trong một số tr-ờng khoảng 2000 - 3000 tr-ờng hợp bị HCNC,

hợp lại t-ơng tự nh- nhau về trình tự của vật nh-ng cho đến nay mới xác định đ-ợc virut

liệu di truyền [3, 5] Nên có giả thiết rằng: kết VNNB, virut đ-ờng ruột là căn nguyên, số

quả xác định d-ơng tính từ mẫu bệnh phẩm còn lại có thể do nhiễm virut khác [2, 4]

chỉ đồng nghĩa với nhận định có vật liệu di

Để phát hiện một tác nhân virut mới gây truyền của virut trong mẫu; nh-ng nếu phân bệnh, phân lập virut có ý nghĩa quan trọng lập virut từ những mẫu bệnh phẩm này, hiệu cho việc xác định tác nhân, tuy nhiên phân quả phân lập đ-ợc virut rất cao.

lập virut th-ờng ít đạt kết quả do bị ảnh h-ởng

Do vậy trong nghiên cứu này cặp mồi của của nhiều yếu tố nh- thời gian lấy mẫu, bảo

3 nhóm virut là những nhóm virut đã đ-ợc xác quản và vận chuyển mẫu làm giảm hiệu giá

định hoặc giả định có thể là tác nhân gây virut trong mẫu, mặt khác thời gian có kết quả

HCNC [4, 9, 10] đ-ợc sử dụng sàng lọc mẫu chậm Ng-ợc lại kỹ thuật PCR cho phép

DNT để phân lập virut gây HCNC do muỗi khuếch đại nhiều lần theo cấp số nhân những

truyền ở miền bắc Việt Nam trong năm 2003

đoạn ADN phiên mã từ vật liệu di truyền của

Bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng mồi đột biến của 3 nhóm virut để chọn mẫu dịch não tuỷ (DNT) phân lập virut gây hội chứng não cấp (HCNC) do muỗi truyền Xét nghiệm 53 mẫu DNT của bệnh nhân HCNC bằng kỹ thuật RT-PCR, xác định có 16 tr-ờng hợp d-ơng tính với tỉ lệ nh- sau: 8/53 (15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut do muỗi truyền, 7/53 (12,96 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut tiềm tàng, 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá Kết quả d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR không thể thay thế kết quả phân lập, nh-ng nó định h-ớng cho việc chọn mẫu

thích hợp để phân lập virut Sử dụng tế bào muỗi Aedes Albopictus dòng C6/36 để phân lập virut do muỗi

truyền Từ 7 mẫu DNT xác định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của nhóm virut do muỗi truyền, phân lập đ-ợc 7 chủng virut, trong số này có 5 chủng là virut VNNB, 1 chủng là virut thuộc nhóm virut Arbo mới đ-ợc phát hiện ở Việt nam 2002, còn 1 chủng ch-a định loại đ-ợc

Tế bào muỗi Aedes Albopictus dòng

II Vật liệu và ph-ơng pháp

C6/36, môi tr-ờng nuôi tế bào Eagle Minimun

2.1 Vật liệu:

Essential Medium (EMEM) có 10 % huyết Mẫu bệnh phẩm: 53 mẫu DNT của bệnh thanh bê bào thai.

nhân HCNC đ-ợc lấy ở Viện Nhi trung -ơng

Máy PCR, các trang thiết bị, sinh phẩm trong tháng 4 và tháng 5 năm 2003, các mẫu

hoá chất và vật liệu cần thiết khác

DNT đ-ợc xác định không có kháng thể IgM

2.2 Ph-ơng pháp:

kháng VNNB

Tách chiết ARN của virut từ DNT bằng bộ

Sử dụng mồi đột biến một số nucleotit

sinh phẩm QIAamp theo h-ớng dẫn của bộ (denegenate primer) để tăng độ nhậy của kỹ

sinh phẩm

thuật RT-PCR: Với nhóm virut do muỗi truyền

sử dụng cặp mồi của virut nhóm Alpha, Flavi, Kỹ thuật RT-PCR thực hiện theo h-ớng Bunya Với nhóm virut tiềm tàng sử dụng cặp dẫn của sinh phẩm.

mồi của nhóm virut Herpes Với nhóm virut

Phát hiện vật liệu di truyền của virut trong lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá, tiếp xúc, sử

mẫu DNT với mồi đột biến (denegenate dụng cặp mồi của nhóm virut Entero, Adeno

primer)

và Nipah Các mẫu chứng d-ơng cho kỹ

Phân lập virut bằng tế bào muỗi C6/36 thuật RT-PCR do Trung tâm kiểm soát bệnh

theo th-ờng quy phòng thí nghiệm Virut viêm tật CDC, Mỹ và Viện Y học Nhiệt đới

não Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung -ơng

Nagasaki cung cấp

Định loại sơ bộ virut phân lập bằng kỹ Cặp mồi đặc hiệu để định loại virut VNNB

thuật ELISA-Sandwich với kháng thể kháng (841N, 2670 R), cặp mồi đặc hiệu để định

virut VNNB Những mẫu d-ơng tính đ-ợc loại virut Arbo mới phát hiện ở Việt Nam (85F,

khẳng định bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi

475 R)

đặc hiệu với virut VNNB, những mẫu âm tính

Bộ sinh phẩm QIAamp để tách chiết ARN

đ-ợc kiểm tra với mồi đặc hiệu của virut của QIAGEN, Nhật Bản

nhóm Alpha, nhóm Bunya, virut Arbo mới [1] Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR trực tiếp

Sản phẩm PCR tổng hợp đ-ợc kiểm tra của Roche (Titan one tube RT-PCR System),

trên thạch 1% trong Tris-Borat-EDTA có Nhật Bản

ethidium bromide chạy điện di 100 mA, 40 Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR của phút, đọc kết quả bằng máy đọc Polaroid Takara Bio Inc, Nhật Bản t h e o n g u y ê n l ý h o á p h á t q u a n g

(Chemilluminescence)

Bảng 1 Kết quả xác định căn nguyên virut gây HCNC, 2003 bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi của 3 nhóm virut

xét nghiệm

Số mẫu

Lây qua đ-ờng tiêu hoá, tiếp xúc 53 1 1,88

VN105 VN89 VN82 VN81 VN79 Neg Pos 1 Kb

Trong số 53 mẫu DNT của bệnh nhân năm Có 8/53 (15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi

2003 đ-ợc xác định không có kháng thể IgM của nhóm virut do muỗi truyền (nhóm virut kháng virut VNNB, ứng dụng kỹ thuật RT- Bunya), có 7/53 (12,96 %) mẫu d-ơng tính với PCR để phát hiện nhanh vật liệu di truyền của mồi của nhóm virut tiềm tàng (nhóm virut virut Kết quả d-ơng tính đ-ợc xác định với Herpes), có 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính với mồi của 3 nhóm virut với tỉ lệ xác định d-ơng mồi của nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu tính với cặp mồi của từng nhóm virut nh- sau: hoá, tiếp xúc (nhóm virut Entero)

Bảng 2 Kết quả phân lập virut từ các mẫu DNT xác định d-ơng tính bằng

kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của nhóm virut do muỗi truyền

Ký hiệu

mẫu

DNT

Ký hiệu chủng virut

Kết quả (+) với mồi của nhóm virut

do muỗi truyền

Kết quả

phân lập virut

Kết quả

định loại virut

03CSF14 03VN76 + ( Strong band) D-ơng tính Arbo mới

Hình 1: Kết quả định loại virut phân lập đ-ợc với cặp mồi đặc hiệu với virut VNNB

Thử nghiệm phân lập virut bằng tế bào muỗi với mồi đặc hiệu với virut VNNB, những mẫu C6/36 từ các mẫu DNT đ-ợc xác định d-ơng âm tính đ-ợc kiểm tra với mồi đặc hiệu của tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của virut nhóm Alpha, virut nhóm Bunya và virut nhóm virut do muỗi truyền, kết quả phân lập Arbo mới phát hiện ở Việt Nam 2002 Kết quả

đ-ợc 7 chủng virut từ 7 mẫu DNT Virut VNNB xác định có 5 chủng là virut VNNB, có 1 trong n-ớc nổi tế bào gây nhiễm đ-ợc phát chủng là thuộc nhóm genotyp của virut Arbo hiện bằng kỹ thuật ELISA-Sandwich với mới phân lập ở Việt Nam năm 2002, còn 1 kháng thể đặc hiệu kháng virut VNNB, xác chủng virut ch-a định loại đ-ợc, không có

định 5 mẫu d-ơng tính, 2 mẫu âm tính bằng mẫu nào d-ơng tính với mồi của virut nhóm

kỹ thuật này Những mẫu d-ơng tính đ-ợc Alpha và virut nhóm Bunya

kiểm tra và xác dịnh bằng kỹ thuật RT-PCR

phòng bệnh [9, 10] Tuy nhiên kết quả âm

IV Bàn luận

tính với mồi của những virut khác chỉ có nghĩa Việc phát hiện nhanh vật liệu di truyền của

rằng trình tự phần khuếch đại của mẫu không virut bằng kỹ thuật RT-PCR, kết quả có thể

đ-ợc phát hiện [10] Ví dụ nh- trong nghiên nhận đ-ợc ngay trong ngày nhận mẫu có ý

cứu này không có mẫu nào đ-ợc phát hiện nghĩa quan trọng để định h-ớng cho việc

Hình 2: Kết quả định loại vi rut phân lập đ-ợc với cặp mồi đặc hiệu của vi rut Arbo mới

d-ơng tính với mồi của virut nhóm Flavi, d-ơng tính với mồi của nhóm virut tiềm tàng, mặc dù virut VNNB là một virut thuộc nhóm có 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính vi mồi của Flavi gây HCNC ở Việt Nam [4] Kết quả này nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá cũng phù hợp với nghiên cứu đã công bố

Sử dụng tế bào muỗi Aedes Albopictus

tr-ớc đây việc phát hiện genôm của virut

dòng C6/36 để phân lập virut từ 7 mẫu DNT VNNB trong dịch não tuỷ th-ờng ít đạt kết

đ-ợc xác định d-ơng tính bằng mồi của nhóm quả, ng-ợc lại đối với virut West Nile, một

virut do muỗi truyền, kết quả phân lập đ-ợc 7/ virut thuộc nhóm Flavi, việc phát hiện genôm

7 chủng virut, trong số này 5 chủng đ-ợc xác của virut này trong dịch não tuỷ có hiệu suất

định là virut VNNB, 1 chủng đ-ợc xác định cao hơn [7]

thuộc nhóm virut Arbo mới đ-ợc phát hiện ở Mặt khác kỹ thuật PCR cũng có những Việt Nam năm 2002, 1 chủng ch-a định loại giới hạn nhất định vì nó không định loại đ-ợc đ-ợc

toàn bộ thành phần virut, nên kết quả xác

Lời cảm ơn:

định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR

không thể thay thế đ-ợc kết quả phân lập Đề tài thực hiện tại CDC Fort Collins,

Ương

Với giả thiết kết quả xác định d-ơng tính

bằng kỹ thuật PCR từ mẫu bệnh phẩm là Tập thể tác giả xin trân trọng cảm ơn:

đồng nghĩa với nhận định có vật liệu di truyền

- Sự hỗ trợ của nhóm Pathogen Discovery của virut trong mẫu; nh-ng nếu phân lập virut

Group, CDC Atlanta về việc trợ giúp kỹ thuật

từ những mẫu bệnh phẩm này, khả năng

và sinh phẩm để phát hiện vật liệu di truyền phân lập đ-ợc virut rất cao Kết quả phân lập

của virut nhóm Herpes, Adeno và Entero

đ-ợc 7 chủng virut từ 7 mẫu DNT đ-ợc xác

- GS Kouichi Morita về việc cung cấp sinh

định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR trong

phẩm cho kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vật nghiên cứu này là một minh chứng cho nhận

liệu di truyền của virut Nipah, virut VNNB,

định trên Mặc dù 7 mẫu DNT đ-ợc xác định

virut Arbo mới

d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi

của virut nhóm Bunya, nh-ng 7 chủng virut

TàI liệu tham khảo

đ-ợc phân lập từ các mẫu dịch não tuỷ này

không có mẫu nào d-ơng tính với mồi của 1 Phan Thị Ngà, Kouichi Morita 2004 virut nhóm Bunya, kết quả này cho thấy việc Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ

sử dụng mồi đột biến để phát hiện vật liệu di của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền truyền từ mẫu DNT làm tăng độ nhạy của kỹ Bắc Việt Nam Tạp chí nghiên cứu Y học, tập thuật RT-PCR, nh-ng có thể có d-ơng tính 29, số 3:

giả [3]

2 Nguyễn Thị Hiền Thanh 2003 B-ớc

đầu tìm hiểu căn nguyên gây viêm màng não

V kết luận

ở trẻ em do một số virut đ-ờng ruột Tạp chí Y ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xét nghiệm học dự phòng, tập XIII, số 4 (61): 5 12.

53 mẫu DNT của bệnh nhân có HCNC với

3 Fields B N., Knipe D M., Howley P M cặp mồi của 3 nhóm virut, xác định: Có 8/53

th

et al 1996 Virology 3 Edition: 15 57

(15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm

virut do muỗi truyền, có 7/53 (12,96 %) mẫu 4 Ha D Q., Calisher C H., Tien P H.,

Isolation of a newly recognized Alphavirus Waqar M A 1994 Detection of West Nile from mosquitoes in Vietnam and evidence for and Japanese Encephalitis viral genome human infection and disease Am J Trop sequences in cerebrospinal fluid from acute Med Hyg 53(1): 100 -104 encphalitis cases in Karachi, Pakistan

Microbiol Immmunol, Vol 38: 827 -830

5 Hazelton P R., Gelderblom H R 2003

Electron Microscopy for rapid diagnosis of 8 Parida M., Posadas G., Inoue S., infection agents in Emergent situation Hasebe F and Morita K 2004 Real-Time Emerging Infectious Diseases Vol 9, No 3: Reverse Transcription Loop-Mediated

294 303 Isothermal Amplification for Rapid Detection

of West Nile virus Journal of clinical

6 Mackenzie J.S., Johansen C.A.,

Microbiology, Vol 42 No 1: 257 263

Ritchie S.A., Van den Hurk A.F & Hall R.A

2002 Japanese encephalitis as an emerging 9 Read S J., Jeffery K J M anh virus: The emergence and spread of Bangham C R M 1997 Aseptic Meningitis

Japanese encephalitis virus in Australia In and Encephalitis: The Role of PCR in the

Current topics in microbiology and diagnostic laboratory Journal of Clinical

Immunology: Japanese encephalitis and Microbiology : 691 696

West Nile virus infections, Vol 267: 49-73

10 Weidmann M., Rudaz V., Nunes M R Edited by J.S mackenzie, A.D Barret & V

T., Vasconcelos P F C and Hufert F T Deubel Berlin: Springer-Verlag

2003 Rapid detection of human pathogenic

7 Igarashi A., Tanaka M., Morita K., Orthobunyaviruses Journal of Clinical Ahmed Akhtar, Ahmed Arsalam, Akram D S., Microbiology: 3299 3305

Summary

Application RT-PCR for the selection of CSF samples for

the isolation of virus transmiss by mosquitoes from acute

encephalitis syndrome patients in the North Vietnam, 2003

RT-PCR technique with denegenate primers of three viral groups were used to selection samples for the isolation of mosquito borne viruses which cause acute encephalitis (AES) syndrome The results showed that 16 out of 53 positive cases were confirmed by RT-PCR with proportion as following: 8/53 (15.09 %) were confirmed positive by primers of mosquito borne viruses, 7/53 (12.96 %) by primers of latent viruses and 1/53 (1.88 %) by viral group of hand-food-mouth diseases The confirmed positive results by RT-PCR can not replace results of the isolation of virus, but it orients for the selection of

relevant CSF samples for the isolation of virus The Aedes Albopictus clone C6/36 cells were used to

isolate virus which is transmitted by mosquitoes From 7 CSF samples which were confirmed positive by RT-PCR, the isolation of virus were carried out yielding 7 virus strains Among them, 5 strains were confirmed Japanese encephalitis virus, 1 strain belongs to group of new type Arbovirus and 1 strain was unknown