Để phát hiện nguồn gen kháng có nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp truyền thống là sử dụng tập đoàn các dòng đẳng gen đem lây nhiễm với tập đoàn các chủng vi khuẩn bạc lá
Trang 1Nghiên cứu phát hiện nguồn gen kháng bệnh bạc lá phục vụ
công tác chọn tạo giống lúa Detection of bacterial leaf blight resistance genes for rice breeding
Phan Hữu Tôn
Summary
In order to develop varieties with durable resistance to the bacterial leaf blight, the avaiability of variable germplasm plays an important role 120 Vietnamese local varieties were
screened for resistance genes to Xanthomonas oryzae pv oryzae using PCR technique and artificial innoculation Eight varieties were identified containing Xa-7 effective gene Accuracy of PCR
method was confirmed by comparison with the results of artificial innoculation 12 varieties
identified by PCR containing xa-5 and Xa-7 showed strong resistance to all six pathotypes similar to
IRBB5 and IRBB7 isogenic lines, No recombinations or other mutations were observed
Key words: Xanthomonas oryzae pv Oryzae, eaf blight bacteria, reistance genes, PCR
technique
1 Đặt vấn đề
Muốn chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá thành công thì việc có nguồn gen kháng phong phú
đóng vai trò quan trọng Để phát hiện nguồn gen kháng có nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp truyền thống là sử dụng tập đoàn các dòng đẳng gen đem lây nhiễm với tập đoàn các chủng vi khuẩn bạc lá chuẩn được phân lập Phương pháp áp dụng chỉ thị phân tử AND (RFLP) hiện cũng đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, nó có thể xác định được vị trí từng gen trên nhiễm sắc thể (NST) thông qua đoạn ADN dò đặc hiệu liên kết với gen đó với khoảng cách liên kết nhất
định, từ đó xây dựng bản đồ di truyền cho các gen kháng Một số gen đã được xác định bằng chỉ thị
phân tử như: Gen Xa-3 liên kết với RFLP ở locus XNpb181 trên NST số 11, khoảng cách liên kết là 2,3 cM, gen Xa-4 cũng liên kết với chỉ thị này nhưng với khoảng cách liên kết là 1,7cM Gen lặn
xa-5 liên kết với chỉ thị RG xa-5xa-56, RG 207 và R 2390 trên NST số xa-5 (Khush & Ogawa; 1991) Tuy nhiên,
áp dụng phương pháp chỉ thị phân tử RFLP mất nhiều thời gian, nhiều khi phải dùng đến phóng xạ, lượng ADN cần nhiều và tinh khiết, nên khó áp dụng rộng rãi Để khắc phục, người ta đề xuất chuyển sang phương pháp chọn lọc gián tiếp trên cơ sở nhân ADN bằng phương pháp PCR, sau đó chạy điện di rồi xác định sự đa hình giữa kiểu gen kháng và nhiễm Có rất nhiều mẫu dò liên kết với gen kháng bệnh đã xác định được trình tự ADN, nên việc thiết kế các đoạn mồi là đơn giản Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích dự đoán khả năng chứa gen kháng của tập đoàn giống lúa
địa phương, đồng thời áp dụng phương pháp nhân gen PCR để phát hiện gen kháng và khẳng định tính chính xác và khả năng ứng dụng của phương pháp này trong chọn tạo giống kháng bệnh
2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nhân gen PCR
ADN được chiết xuất theo phương pháp cải tiến của Phan Hữu Tôn (2000) Nhân gen PCR, dung dịch mẫu phản ứng có dung tích 20àl gồm: nước cất 13,3àl, 10X PCR buffer 2àl, dNTPs 2,5mM 1,6àl, primer 10pmol/àl 1àl, Tag polymerase 5units/àl 0,1àl và cuối cùng thêm vào 1àl dung dịch ADN nguyên bản Nhân gen Xa-7 dùng 2 đoạn mồi là: P3 F 5'-CAG CAA TTC ACT
Trang 2GGA GTA GTG GTT-3' và P3 R 5'-CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA-3' Quy trình nhân
gồm các bước: 940C trong 4 phút, nhân 34 chu kỳ: 940C trong 1 phút tiếp theo là 560C trong 1 phút
và 720C trong 2 phút, cuối cùng bước kéo dài ở 720C trong 8 phút, bảo quản ADN được nhân ở 40C
Chạy điện di xác định đa hình
Dùng gel agarose 2%, chạy điện di ở hiệu điện thế 50V,160mA trong 25 phút Sau khi chạy
xong, đem nhuộm bằng Ethilium bromide trong 10 phút rồi chiếu trên máy UV để xác đinh sự đa
hình Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn lây nhiễm và phương pháp lây nhiễm nhân tạo theo Furuya và
cộng sự (2002)
Lây nhiễm nhân tạo
Sử dụng 5 chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở miền Bắc Việt Nam là: HAU01043,
HAU02020-3, HAU02021-1, HAU01030-1, HAU02040-1 lần lượt thuộc các chủng 1, 7, 5, 4 và 8
và một chủng của Nhật Bản B2C9 (s) lây nhiễm cho 120 giống lúa địa phương thu thập ở miền Bắc
Việt Nam, cắt 2 - 5 cm đầu lá lúa ở giai đoạn làm đòng, mỗi cây lây nhiễm 10 lá cho một chủng
Đánh giá khả năng chống bệnh bạc lá trên cơ sở đo chiều dài vết bệnh sau 20 ngày lây nhiễm: Chiều
dài < 8cm, chống bệnh(R); từ 8 – 12 cm, nhiễm vừa (M); dài >12 cm, nhiễm (S) Dự đoán khả năng
chứa gen kháng của các giống lúa thông qua so sánh với phổ kháng nhiễm của 11 dòng đẳng gen
(chứa đơn gen) trong cùng điều kiện và số chủng lây nhiễm
3 Kết quả nghiên cứu
3.1 Dự đoán khả năng chứa gen kháng của các giống
Sau khi lây nhiễm 6 chủng cho các dòng đẳng chứa đơn gen, thu được phổ chống nhiễm ở bảng 1
Bảng 1 Phản ứng của các dòng đẳng gen đối với 6 chủng vi khuẩn
01043
HAU 02020-3
HAU 02021-2
HAU 01030-1
HAU 02040-1 B2C9(s) Tỷ lệ
R/M/S
Trang 3
B¶ng 2 Ph¶n øng cña 120 gièng 6 chñng vi khuÈn l©y nhiÔm
01043
HAU 02020-3
HAU 02021-2
HAU 01030-1
HAU 02040-1
B2C9(s) Tû lÖ
R/M/S
54 gièng lóa nÕp
Trang 410058 Lúa nếp cẩm S S S M S S 1M/5S
66 giống lúa tẻ
10135 Bao thai địa phương R R R R R R 6R
Trang 510134-1 Lúa tiên ưu S R R R R R 5R/1S
M/57S
29R/21 M/70S
67R/29 M/42S
25R/24M /71S
30R/16 M/74S
51R/19 M/50S
tính vừa
Độc tính mạnh
Độc tính nhẹ ấ
Độc tính mạnh nhất
Độc tính khá
mạnh
Độc tính tương ố
Trong số 120 giống lúa địa phương được so sánh, có 24 giống nhiễm hoàn toàn với 6 chủng là: 10197-1, 10222, 10063-1,10130, 10148, 10128, 10064, 10116-3, 10090, 10139, 10094, 10153, 10202-1, 10124, 10113, 10105, 10067, 10133-1, 10155, 10095-1, 10095-2, 10071, 3,
10106-1, các giống này có phổ kháng nhiễm tương tự như IR24 và các dòng đẳng gen IRBB10106-1, IRBB2, IRBB10, IRBB11 Do đó, các giống này bước đầu được dự đoán có thể không chứa gen kháng như
IR24 hoặc chứa một trong số các gen kháng Xa-1, Xa-2, Xa-10 hoặc Xa-11 Có 3 giống có phổ
kháng-nhiễm tương tự với các dòng đẳng gen IRBB3, IRBB4 (2R/4S) là: 10133-2, 10218, 10096, dự
đoán chúng có thể chứa gen kháng Xa-3 hoặc Xa-4 Có 1 giống có phổ kháng-nhiễm tương tự với dòng đẳng gen IRBB14 (3R/1M/2S) là 10354, dự đoán giống này có khả năng chứa gen kháng
Xa-14 Có 4 giống nếp và 12 giống tẻ có phản ứng kháng hoàn toàn với tất cả 6 chủng vi khuẩn (6R),
phổ kháng này rất giống với các dòng đẳng gen: IRBB5, IRBB7 và IRBB21, chứa lần lượt các gen xa-5, Xa-7 và Xa-21 là: 10103, 10211, 10057,10350,10085, 10154,10219,10111, 10122-1, 10119,
10087, 10196, 10215, 10091, 10134-1 và C70 Do vậy chúng tôi tạm thời dự đoán các giống này có
khả năng chứa một trong số các gen kháng hữu hiệu là: xa-5, Xa-7 hoặc Xa-21 (bảng 2) Tuy nhiên,
để khẳng định chính xác từng giống chứa gen nào thì cần thiết phải dùng đến phương pháp nhân gen PCR, đồng thời cần thiết phải sử dụng số lượng chủng lây nhiễm nhiều hơn nữa
Nghiên cứu tính gây độc của từng chủng vi khuẩn dựa trên tỷ lệ kháng nhiễm đối với các dòng giống đánh giá cho thấy chủng có độc tính cao nhất là chủng HAU 01030-1 có tỷ lệ số kháng thấp nhất (25R/24M/71S), tiếp đến là chủng HAU02020-3 với tỷ lệ này là 29R/21M/70S Chủng HAU02040-1 và HAU 01043 có độ độc tính tương đương lần lượt có tỷ lệ là 30R/16M/74S và 32R/31M/57S Chủng ít có khả năng gây bệnh nhất là 2 chủng, một chủng nhập từ Nhật bản là B2C9 (s) có tỷ lệ này 67R/29M/42S và HAU02021-2 với tỷ lệ 51R/19M/50S
3.2 Kiểm tra tính xác thực của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện gen
Kỹ thuật PCR đã được áp dụng để xác định được 12 giống có chứa gen xa-5 trong số 145
Trang 6giống lúa địa phương mà tác giả thu thập được (Phan Hữu Tôn, 2000) Tuy nhiên, trong nghiên cứu
này, để khẳng định độ chính xác của phương pháp PCR và xác định liệu có khả năng xảy ra tái tổ
hợp hay không, các giống lúa có chứa gen xa-5 được tiến hành lây nhiễm với 6 chủng vi khuẩn
(bảng 3)
Bảng 3 Phản ứng của các giống chứa gen xa-5 với 6 chủng vi khuẩn lây nhiễm, vụ Xuân 2004 (* cm)
01043
HAU 02020-3
HAU 02021-2
HAU 01030-1
HAU 02040-1 B2C9(s) IRBB5 0,9 * R 1,1 R 1,5 R 1,7 R 2,6 R 1,0 R Bầu hương Hải Dương 1,2 R 3,5 R 3,7 R 4,3 R 5,8 R 0,8 R
Kết quả đã cho thấy tất cả các giống lúa có chứa gen xa-5 (xác định bằng PCR) đều kháng hoàn
toàn với 6 chủng tương tự như dòng đẳng gen IRBB5 Điều này chứng tỏ phương pháp PCR hoàn toàn đáng tin cậy, đồng thời cả 6 giống đều không phát hiện thấy có xảy ra hiện tượng đột biến hoặc trao đổi chéo và tái tổ hợp
Ngoài ra, để phát hiện gen Xa-7 trong 120 giống lúa địa phương nói trên, hai đoạn mồi được sử
dụng là:
P3 F 5'-CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT-3'
P3 R 5'-CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA-3'
12 13 11
7 6 5
2 3 4
1
ảnh 1 Kết quả phát hiện gen Xa-7
Ghi chú
• Lane 1 (Đối chứng không chứa gen Xa-7) giống IR24
• Lane 2 (Đối chứng Xa-7)
• Lane 5, 6, 9, 10, 11, 12 c#c gièng ch#a chứa gen Xa-7
• Lane 3, 4, 7, 8, 13 không chứa gen Xa-7
Kết quả phát hiện thấy có 8 giống trong số 16 giống có phản ứng kháng hoàn toàn với 6 chủng
có biểu hiện vệt băng sau điện di (ảnh 1) tương tự như IRBB7, trong đó có 3 giống nếp: 10103,
10057, 10350 và 5 giống tẻ là: 10085, 10111, 10122-1, 10119, 10134-1 Khả năng của 8 giống còn
Trang 7lại có thể chứa gen xa-5 hoặc Xa-21 Do đó phải tiến hành theo dõi một số các đặc điểm của 8 giống
này về chiều cao cây, thời gian sinh trưởng, năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất (bảng 4)
Bảng 4 Một số đặc điểm nông sinh học các giống chứa gen Xa-7
KH
Giống Tên giống
Thời gian sinh trưởng (ngày)
Chiều cao cây (cm)
Số bông hữu hiệu /khóm
Số hạt chắc/bông
P1000 hạt (g)
Năng suất
lý thuyết (tạ/ha)
Năng suất thực thu (tạ/ha)
Hệ số kinh tế
Có 2 giống được xác định có gen Xa-7 nằm trong số các giống có triển vọng đã được chúng tôi
xác định ở trên là: 10057 và 10350 Hai giống này có thể đưa đi khảo nghiệm khu vực hoá, hoặc sử dụng làm nguồn vật liệu tốt cho các nhà chọn tạo giống chống bệnh bạc lá lúa
4 Kết luận
Dùng phương pháp PCR để phát hiện gen chống bệnh hữu hiệu xa-5 và Xa-7 có độ chính xác cao, kết quả lây nhiễm nhân tạo phù hợp với kết quả phát hiện gen bằng PCR, không có hiện tượng tái tổ hợp xẩy ra
Điều tra 120 giống lúa địa phương bằng PCR, phát hiện có 8 giống chứa gen Xa-7 các giống này đều kháng tất cả 6 chủng, 8 giống khác tuy kháng được tất cả các chủng tương tự như IRBB7 nhưng bằng PCR không phát hiện thấy có chứa gen Xa-7, các giống này có thể chứa gen hữu hiệu khác xa-5 và Xa-21 hoặc xẩy ra tái tổ hợp, cần phải nghiên cứu tiếp theo
Các giống lúa địa phương Việt Nam chứa nguồn gen chống bệnh hữu hiệu rất phong sử dụng trong chương trình chọn tạo giống chống bệnh
Tài liệu tham khảo
Khush GS Bacalangco, E Ogawa T (1991) RGN 7: 121 – 122
Phan Huu Ton (2000) Application ò PCR-based markers to identify rice bacterial blight resistance genes, xa-5, Xa-13 and Xa-21 in Vietnamese germplasm collection Tap ch KH Nông nghiệp (1) 9/2000, tr 59 – 66
Naruto Furuya, Satoru Taura, Bui Trong Thuy, Masaru Matsumoto, Seint San Aye and Phan Huu
Ton (2002) Isolation and Preervation of Xanthomonas oryzae pv oryzae from Vietnam in
2001 - 2002
