trachomatis trong tay, các tác giả đã nghiên cứu thành công để chế tạo được multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân vi khuẩn trên với độ nhạy phát hiện từng tác nhân riêng lẻ
Trang 1Nghiên cứu chế tạo Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân
Chlamydia trachomatis và Neissera gonorrhoeae
P H Van (1) , N P N Ha (2) , N T M Thu (3) , D T T Thuy (4)
Tóm tắt
Với hai chủng vi khuẩn N gonorrhoeae và C trachomatis trong tay, các tác giả đã nghiên cứu thành công để chế tạo được multiplex PCR mix phát hiện đồng thời hai tác nhân vi khuẩn trên với độ nhạy phát hiện từng tác nhân riêng lẻ đạt đến 1 DNA bộ gen vi khuẩn trong thể tích phản ứng, và độ nhạy phát hiện hai tác nhân vi khuẩn trong cùng một phản ứng được tiên đoán là rất thuận lợi trong thực tế trên bệnh nhân
Summary
“Prepare the Multiplex PCR mix detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae sulmutaneously” With two strains of N gonorrhoeae and C trachomatis in hand, the authors have
prepared successfully the multiplex PCR mix detecting these two bacteria sulmutaneously with the sensitivity in detecting these bacteria separately reaches 1 DNA genome of the target bacteria in the volume of reaction; and the study also revealed that the sensitivity in detecting Chlamydia trachomatis
and Neisseria gonorrhoeae simultaneously is favored for the detecting of these bacteria from infected
patients
Đặt vấn đề
C trachomatis và N gonorrhoeae là hai tác
nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng đường sinh dục rất
thường gặp với các hậu quả cũng khá nặng nề nếu
không phát hiện và chữa trị(1,2) Phương pháp
thông thường nhất hiện nay để phát hiện C
trachomatic là dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang trực tiếp để phát hiện vi khuẩn trong các
quệt cổ tử cung, tuy nhiên phương pháp này cho
kết quả khá chủ quan vì tuỳ thuộc vào kỹ năng và
kinh nghiệm người đọc kết quả trên kính hiển vi
huỳng quang Để phát hiện N gonorrhoeae thì
nuôi cấy là phương pháp thường được dùng nhất,
tuy nhiên có rất nhiều trường hợp nuôi cấy thất bại
vì bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước đó Chính
vì vậy phương pháp được cho là nhạy cảm và
thích hợp nhất hiện nay để phát hiện hai tác nhân
C trachomatis và N gonorrhoeae là kỹ thuật PCR
Hiện nay đã có kit phát hiện đồng thời N
gonorrhoeae và C trachomatis bằng kỹ thuật
PCR-ELISA được sản xuất bởi Roche Diagnostic
Tuy nhiên kit này ít được sử dụng tại Việt Nam vì
giá thành khá cao, đồng thời cũng khá phức tạp
khi thực hiện xét nghiệm Trong nước cũng có vài
tác giả cố gắng sản xuất kit PCR phát hiện đồng
thời hai tác nhân này nhưng cũng chưa thành công
vì không có điều kiện thử nghiệm trên chủng vi
khuẩn thật sự, đặc biệt là chủng C trachomatis,
ngoài ra các nơi dự định sản xuất các kit này cũng
không phải là nơi sản xuất chuyên nghiệp với đầy
đủ kinh nghiệm sản xuất cũng như hệ thống kiểm
soát chất lượng Chính vì vậy mặc dù trước đây
chúng tôi đã có kit phát hiện C trachomatis
nhưng vì hiện vẫn có nhiều khách hàng muốn được chúng tôi cung cấp thêm kit PCR phát hiện
đồng thời C trachomatis và N gonorrhoeae cho
tiện sử dụng, nên đơn vị R&D của chúng tôi cũng
đã đặt ra mục tiêu chế tạo kit PCR phát hiện đồng thời hai tác nhân này Mục tiêu của công trình này
là tìm hiểu độ nhạy cảm và độ đặc hiệu của kit
PCR này trên các chủng vi khuẩn C trachomatis
và N gonorrhoeae thật sự
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Mẫu thử trong nghiên cứu là các trích biệt
DNA từ các huyền dịch vi khuẩn N gonorrhoeae
và C trachomatis Vi khuẩn N gonorrhoeae là
chủng vi khuẩn được phân lập trên bệnh nhân, được định danh chính xác nhờ hình ảnh song cầu Gram [-], tính chất oxidase [+], và chỉ lên men đường glucose trong thử nghiệm lên men đường nhanh Cummitech 4 Vi khuẩn được phòng R&D của công ty Nam Khoa bảo quản ở -70oC Để chuẩn bị cho thử nghiệm, vi khuẩn được cấy phân lập lại trên thạch nâu, ủ 37oC trong tủ ấm CO2 trong 48 giờ Sau đó vi khuẩn được gặt trong nước muối sinh lý để đạt độ đục tương đương 106 vi khuẩn/ml) Huyền dịch vi khuẩn này được đun cách thuỷ trong 10 phút kể từ lúc nước sôi, sau đó
ly tâm 13.000RPM/5 phút Dịch nổi chính là trích
biệt DNA của N gonorrhoeae Dịch nổi này được
pha loãng trong đệm TE theo hệ số pha loãng 10 (1)BS., TS., Giảng viên Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP HCM; Cố vấn chất lượng và trưởng phòng QA Công
Ty Nam Khoa (2)CN., Trưởng phòng Vi Sinh-SHPT Bệnh Viện Phong và Da Liễu Qui Hòa, Qui Nhơn (3)CN., Nghiên cứu viên phòng R&D Công Ty Nam Khoa (4)BS., ThS., Giảng viên Bộ Môn Hoá Sinh, Khoa Y, ĐHYD
Trang 2để có các độ pha loãng 1 (không pha loãng), 10-1,
10-2, 10-3, 10-4, 10-5, và 10-6 được đặt tên là G0, G1,
G2, G3, G4, G5 và G6 tương đương 104/10µl,
103/10µl, 102/10µl, 10/10µl, 1/10µl và 0.1/10µl
Vi khuẩn C trachomatis là hai dòng vi khuẩn 1 và
2 xin từ Khoa Sinh Học, Đại Học Royal Holloway
thuộc Đại Học London, Anh Hai dòng này được
cung cấp dưới dạng huyền dịch có nồng độ vi
khuẩn đạt 107 vi khuẩn/ml Tại Phòng R&D của
công ty Nam Khoa, hai dòng vi khuẩn được giữ ở
-70oC Trước khi trích biệt DNA, pha loãng hai
huyền dịch vi khuẩn này 1/100 trong đệm TE để
đạt nồng độ vi khuẩn 105/ml Dùng hai phương
pháp trích biệt DNA cho huyền dịch C
trachomatis này: Phương pháp đun cách thuỷ
trong 10 phút kể từ lúc nước sôi và sau đó ly tâm
để lấy dịch nổi – như vậy là có 2 mẫu d1 và d2, và
phương pháp trích biệt DNA bằng bộ
DNAPREP-BOOM do công ty Nam Khoa sản xuất theo đúng
qui trình hướng dẫn kèm theo – như vậy là có 2
mẫu b1 và b2 Ngoài ra, chúng tôi còn dùng thêm
mẫu chứng âm là trích biệt DNA từ quệt cổ tử
cung lấy từ người không nhiễm hai tác nhân trên
đã được xác định bằng phương pháp miễn dịch
huỳnh quang trực tiếp phát hiện C trachomatis
âm tính và cấy cũng như soi trực tiếp âm tính N
gonorrhoeae Mẫu chứng âm này được trích biệt
DNA bằng phương pháp dùng phenol-chloroform
với bộ DNAPREP-PHCHL do công ty Nam Khoa
sản xuất và thực hiện theo hướng dẫn đi kèm
Multiplex PCR mix phát hiện đồng thời C trachomatis và N gonorrhoeae do phòng R&D
của công ty Nam Khoa điều chế gồm các thành phần chính: Taq polymerase và PCR buffer của Biorad, dNTP của Roche, dUTP và UNG của Amersham, mồi đặc hiệu (đặt Invitrogen tổng hợp) cho đoạn DNA dài 241bp trên crytic plasmid
của C trachomatic, mồi đặc hiệu (đặt Invitrogen
tổng hợp) cho đoạn DNA dài 390bp trên crytic
plasmid của N gonorrhoeae, MgCl2 của Biorad
Có hai loại multiplex PCR mix được pha, loại chứa hàm lượng mồi 50pm/thể tích phản ứng, và loại chứa hàm lượng mồi 25pm/thể tích phản ứng Hai loại PCR mix này được đặt tên là Multiplex GNC PCR mix 50pm và Multiplex CHL-GNC PCR mix 25pm Thể tích của PCR mix là 40µl, để thể tích của mẫu thử cho vào là 10µl, và như vậy thể tích phản ứng là 50µl
Trước hết chúng tôi tìm hiểu phương pháp
trích biệt DNA của huyền dịch C trachomatis
bằng phương pháp BOOM và bằng phương pháp đun cách thuỷ, phương pháp nào tốt hơn? Đồng thời chúng tôi cũng tìm hiểu hàm lượng mồi 50pm
và 25pm đặc hiệu C trachomatis và N gonorrhoeae, hàm lượng nào cho kết quả khuếch
đại tốt hơn? Để trả lời hai câu hỏi này chúng tôi thực hiện thử nghiệm PCR với các mẫu trích biệt DNA đã chuẩn bị ở trên cho vào 9 tube PCR mix 50pm và 7 tube PCRmix 25pm theo như trình bày trong bảng 1 sau đây
Bảng 1: Mẫu trích biệt DNA và thể thích mẫu (µl) được cho vào hai loại PCR mix
Các PCR mix sau khi đã cho các mẫu thử
được cho vào máy PCR, chúng tôi sử dụng máy
iCycler loại Dual-block của Biorad, và chạy PCR
theo chương trình luân nhiệt sau: 40oC/10 phút,
95oC/5 phút, 40 chu kỳ 94oC/45 giây – 55oC/45
giây – 72oC/1 phút, 72oC/7 phút Sản phẩm
khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên thạch
agarose 2% pha trong TBE 0.5X và có trộn thêm
0.01mg ethidium bromide trong 50ml thạch
Thạch điện di được pha từ bộ thuốc thử điện di
AGE do công ty Nam Khoa sản xuất theo hướng
dẫn đi kèm Thang DNA được chạy điện di song song với sản phẩm PCR cũng do công ty Nam Khoa sản xuất, đây là thang 100-1000bp với khoảng cách mỗi vạch là 100bp
Sau khi đã có kết quả xác định được PCR mix
có hàm lượng mồi nào là thích hợp nhất và trích
biệt nào là tốt nhất đối với huyền dịch C trachomatis, chúng tôi tiến hành xác định độ nhạy cảm của PCR mix này trong phát hiện C trachomatis và N gonorrhoeae riêng lẻ cũng như
Trang 3trong phát hiện đồng thời Phương pháp xác định
độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân riêng lẻ
được tiến hành như sau: (1) Trước hết pha loãng
trích biệt DNA (cho kết quả tốt nhất) trong TE
theo hệ số pha loãng 10 để có các độ pha loãng 1
(không pha loãng), 10-1, 10-2, 10-3được đặt tên là
C0, C1, C2, và C3, tương đương 103/10µl, 102/10µl,
10/10µl, và 1/10µl (2) Cho các độ pha loãng của
trích biệt DNA của C trachomatis vừa chuẩn bị
và các độ pha loãng của trích biệt DNA của N
gonorrhoeae đã chuẩn bị trước đó (các mẫu G0,
G1, G2, G3, G4, G5 và G6) vào các PCR mix, lượng
mẫu cho vào là 10µl (3) Chạy PCR theo chương
trình luân nhiệt sau: 40oC/10 phút, 95oC/5 phút, 40
chu kỳ 94oC/45 giây – 55oC/45 giây – 72oC/1 phút,
72oC/7 phút (4) Sản phẩm khuếch đại được phát
hiện bằng điện di trên thạch agarose 2% pha trong
TBE 0.5X như trên, đọc kết quả xác định độ nhạy
cảm là hàm lượng thấp nhất của DNA bộ gen của
hai vi khuẩn C trachomatis và N gonorrhoeae
còn cho được kết quả sản phẩm khuếch đại Để xác định độ nhạy cảm trong phát hiện hai tác nhân
C trachomatis và N gonorrhoeae đồng thời,
chúng tôi thực hiện thử nghiệm PCR với các độ
pha loãng của các trích biệt DNA của C
trachomatis và N gonorrhoeae các cho vào 16 PCR mix sao cho các nồng độ DNA của C
trachomatis đều gặp được các nồng độ DNA của
N gonorrhoeae Sau đó chạy PCR và phát hiện và
đánh giá các kết quả sản phẩm khuếch đại điện di trong thạch agarose 2% như phương pháp đã trình bày ở trên Bảng 2 dưới đây trình bày cách cho
các pha loãng mẫu trích biệt DNA của C
trachomatis và N gonorrhoeae vào các PCR mix
để đạt được yêu cầu này
Bảng 2: Các pha loãng mẫu trích biệt DNA và thể tích mẫu (µl) được cho vào PCR mix
Kết quả
Kết quả điện di trong hình 1 cho thấy phương
pháp trích biệt DNA của C trachomatis bằng
phương pháp đun tỏ ra có hiệu quả hơn phương
pháp Boom vì trong cả hai mẩu C trachomatis 1
và C trachomatis 2, vạch khuếch đại sản phẩm
PCR với DNA trích biệt bằng phương pháp đun
cách thuỷ (giếng 2, 4, 11 và 13) cho kết quả sáng
đậm hơn và rõ nét hơn phương pháp Boom (giếng
1, 3, 10 và 12) Ngoài ra kết quả trên hình 1 cũng
cho thấy PCR mix 50pm có vẻ tốt hơn PCR mix
25pm vì với mẫu trích biệt DNA của C
trachomatis bằng phương pháp Boom, kết quả
PCR cho thấy mẫu b1 không cho sản phẩm khuếch
đại với PCR mix 25pm, nhưng vẫn cho sản phẩm
khuếch đại với PCR mix 50pm Từ kết quả này,
chúng tôi chọn phương pháp trích biệt DNA cho
huyền dịch vi khuẩn C trachomatis là phương
pháp đun cách thuỷ, đồng thời chúng tôi chọn PCR
mix có hàm lượng mồi 50pm cho các thí nghiệm
xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix
Kết quả điện di trong hình 2 cho thấy Multiplex CHL-GNC PCR mix 50pm có độ nhạy
cảm phát hiện N gonorrhoeae và C trachomatis
riêng lẻ đạt đến 1 bộ gen vi khuẩn trong một thể tích mẫu cho vào tube phản ứng Tuy nhiên, kết quả điện di trong hình 3 thì cho thấy trong phát hiện hai tác nhân vi khuẩn này cùng một lúc thì
với các mẫu thử có hàm lượng DNA bộ gen C
trachomatis cao thì sẽ ức chế khả năng phát hiện N
gonorrhoeae Trong khi các mẫu có hàm lượng DNA bộ gen của N gonorrhoeae dù rất cao (đến
104 bộ gen DNA trong thể tích phản ứng) vẫn
không ảnh hưởng đến khả năng phát hiện C
trachomatis Kết quả này rất thuận lợi trong thực
tế phát hiện bệnh vì thông thường nếu một người
nhiễm C trachomatis thì số lượng vi khuẩn trong mẫu thử sẽ rất thấp, trong khi đó nếu nhiễm N
gonorrhoeae thì số lượng vi khuẩn trong mẫu thử
sẽ cao hơn
Trang 4C 0 C 1 C 2 C 3 mk mk G 2 G 3 G 4 G 5 G 6
Hình 2: Kết quả xác định độ nhạy cảm của
Multiplex CHL-GNC PCR mix 50
trong phát hiện từng tác nhân C
trachomatis (gel bên trái) và N gonorrhoeae (gel bên phải) Kết quả
cho thấy PCR mix có khả năng phát
hiện N gonorrhoeae đến nồng độ G5, tương đương 1 bộ gen vi khuẩn trong thể tích 10µl mẫu trích biệt DNA cho vào tube phản ứng; khả năng phát hiện
C trachomatis đến nồng độ C3, tương đương 1 bộ gen vi khuẩn trong thể tích 10µl mẫu trích biệt DNA cho vào tube phản ứng
1 2 mk 3 4 5 6 7 8 9 mk
PCR mix 50pm 10 11 12 13 14 15 16 mk PCR mix 25pm
Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR, gel bên trái là PCR mix 50, gel bên phải là PCR mix
25 Giếng 1,3, 10, 12: trích biệt DNA của C trachomatis bằng phương pháp Boom;
giếng 2, 4, 11, 13 là trích biệt DNA của C trachomatis bằng phương pháp đun cách thuỷ; Giếng 5 đến 16 là trích biệt DNA của N gonorrhoeae bằng phương pháp đun
cách thuỷ với giếng 5, 14 là G1; giếng 6, 15 là G2; giếng 7, 16 là G3; giếng 8 là G4
G 3 G 4 G 5 G 6 G 3 G 4 G 5 G 6 G 3 G 4 G 5 G 6 G 3 G 4 G 5 G 6
C 0 C 0 C 0 C 0 C 1 C 1 C 1 C 1 C 2 C 2 C 2 C 2 C 3 C 3 C 3 C 3
Hình 3: Kết quả xác định độ nhạy cảm của Multiplex CHL-GNC PCR mix 50 trong
phát hiện cùng một lúc hai tác nhân C trachomatis (vạch khuếch đại 241bp) và
N gonorrhoeae (vạch khuếch đại 390bp)
Trang 5Bàn luận
Chlamydia trachomatis là một trong các tác
nhân nhiễm trùng lây truyền bằng đường tình dục
phổ biến nhất tại các nước đang phát triển(1) Bởi
vì hầu hết các trường hợp nhiễm bệnh đều không
có triệu chứng do vậy mà các trường hợp phát
hiện được bệnh chỉ là một phần nổi của một tảng
băng chìm(1) Người ta phỏng đoán ở Hoa Kỳ mỗi
năm có 3-4 triệu trường hợp nhiễm bệnh và trên
toàn thế giới có đến 90 triệu trường hợp nhiễm
bệnh(3) Tỷ lệ phụ nữ dưới 25 tuổi nhiễm C
trachomatis có thể rất cao (đến 30%), trong đó
nguy cơ cao nhất là ở phụ nữ có hoạt động tình
dục nhiều(3-5) Nếu nhiễm bệnh mà không điều trị
thì có thể đưa đến viêm vùng chậu và dẫn đến các
di chứng nghiêm trọng như thai ngoài tử cung hay
vô sinh(1,2) Tuy nhiên nhiễm trùng C trachomatis
là một nhiễm trùng rất dễ dàng để điều trị bằng
kháng sinh do vậy việc phát hiện và điều trị được
các trường hợp riêng lẻ là một trong các chìa khoá
trong chương trình kiểm soát nhiễm trùng Chính
vì thế có nhiều nơi, người ta đã khuyến cáo là các
thanh niên nam nữ trưởng thành dưới 25 tuổi nên
được sàng lọc phát hiện nhiễm C trachomatis mỗi
năm một hay thậm chí hai lần(4-7) Cũng như vậy,
nhiễm N gonorrhoeae mạn tính hay không triệu
chúng là một trong các yếu tố gây lây lan lậu trong
cộng đồng(8) Lậu không triệu chứng hay mạn tính
có ở cả đàn ông và phụ nữ(9,10) Một trong các tiếp
cận tốt nhất để kiểm soát và loại trừ được bệnh lậu
chính là việc phải phát hiện và điều trị cho được
các trường hợp mang mầm bệnh này vì đây chính
là các nhân tố nguy cơ cao
Độ nhạy của các phương pháp truyền thống
như nuôi cấy hay phát hiện kháng nguyên để phát
hiện C trachomatis hiện nay đã bị các phương
pháp khuếch đại nucleic acid qua mặt Cũng như
vậy, phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống đã
bị chứng minh là không đủ nhạy cảm để phát hiện
được N gonorrheae trong các đối tượng nhiễm
lậu không triệu chứng hay mạn tính, do vậy các
phương pháp khuếch đại nucleic acid hiện đang
rất được quan tâm để áp dụng Có nhiều phương
pháp khuếch đại nucleic acid đã được đưa ra
thương mại như các phương pháp dựa vào kỹ
thuật LCR (Abbott), PCR (Roche)(11), TMA
(Bayer), hay SDA (BD) Trong các phương pháp
này, dễ tiếp cận nhất là phương pháp PCR vì đây
là phương pháp mà các nhà nghiên cứu dễ dàng
thiết kế nhất và không cần phải bị phụ thuộc vào
một hệ thống kín nào Mục tiêu chính của công
trình này là thiết kế được multiplex PCR mix phát
hiện được đồng thời cả hai tác nhân C
trachomatis và N gonorrhoeae, và cả hai tác nhân
này đều có thể hiện diện cùng một lúc trong bệnh
phẩm chứ không phải là có tác nhân này thì không
có tác nhân kia Chính vì vậy khi thiết kế Multiplex PCR này, phải dự đoán được sự cạnh tranh của cả hai loại DNA đích của cả hai tác nhân khi cùng tham gia vào phản ứng khuếch đại
Kết quả nghiên cứu cho thấy, để phát hiện từng tác nhân riêng lẻ, Multiplex PCR mix do chúng tôi chế tạo có khả năng phát hiện rất cao, có thể nói là lý tưởng: đạt mức phát hiện tối thiểu chỉ cần 1 DNA bộ gen của vi khuẩn đích có mặt trong phản ứng là hoàn toàn có thể phát hiện được Đây chỉ là sự tính toán lý thuyết vì với phương pháp trích biệt DNA mà chúng tôi sử dụng trong công trình này chỉ là phương pháp đun cách thuỷ do vậy lượng DNA bộ gen trích ra ngoài dung dịch chắc
sẽ thấp hơn lượng DNA bộ gen thật sự có trong huyền dịch vi khuẩn
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy đối với
huyền dịch C trachomatis, phương pháp BOOM
để trích biệt DNA bộ gen tỏ ra không hiệu quả Điều này hoàn toàn có thể giải thích được nếu chúng ta hiểu được nguyên tắc trích biệt DNA của phương pháp BOOM, đó là dùng triton X100 để phá huỷ tế bào giải phóng DNA, dùng Guanidine thiocyanate để bất hoạt các men nuclease Các DNA tự do sẽ bám vào các hạt silica nhờ vậy mà trích biệt được DNA Tuy nhiên vì trong dịch cấy
C trachomatis là dịch cấy tế bào, do vậy bên cạnh DNA của C trachomatis, vẫn có nhiều DNA của
tế bào và chính các DNA này đã cạnh tranh với
DNA của C trachomatis khi bám vào các hạt silica do vậy khả năng DNA của C trachomatis
được trích biệt sẽ thấp đi nhiều Do vậy, dù chúng tôi là những người đầu tiên mang về Việt Nam kỹ thuật BOOM để trích biệt DNA nhưng không áp dụng BOOM một cách máy móc vào tất cả các bệnh phẩm mà phải xác định các bệnh phẩm nào không lẫn nhiều DNA tạp nhiễm mới dùng BOOM
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy là trong
phát hiện đồng thời cả hai tác nhân N gonorrhoeae và C trachomatis; nếu C trachomatis trong mẫu thử có lượng DNA bộ gen
là 103 thì ngưỡng phát hiện N gonorrhoeae là 10 DNA bộ gen trong mẫu thử, nếu C trachomatis
có lượng DNA bộ gen là 102 thì ngưỡng phát hiện
N gonorrhoeae là 1, nếu C trachomatis có lượng DNA bộ gen là 10 và 1 thì ngưỡng phát hiện N gonorrhoeae là 0.1 bộ gen trong mẫu thử Ngược lại lượng DNA bộ gen của N gonorrhoeae không
có ảnh huởng nhiều đến ngưỡng phát hiện C trachomatis Như vậy có nghĩa là lượng vi khuẩn
C trachomatis trong mẫu cao thì sẽ ức chế khả năng phát hiện N gonorrhoeae Trên thực tế thì thông thường với một người nhiễm C trachomatis
Trang 6thì ít khi lượng vi khuẩn trong mẫu cao đến mức
103 vi khuẩn trong 10µl mẫu thử tức là đến 105/ml
mẫu thử vì nếu với những người đã từng quan sát
phát hiện C trachomatis trong các quệt cổ tử cung
bằng thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
thì không bao giờ có thể thấy được vi khuẩn này
nhiều trên quang trường quan sát Do vậy hiệu
ứng này chắc chắn sẽ không ảnh hưởng đến việc
phát hiện cả hai tác nhân này cùng một lúc trên
thực tế mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân
Kết luận
Nghiên cứu đã thành công trong việc chế tạo
được multiplex phát hiện đồng thời cả hai tác nhân
C trachomatis và N gonorrhoeae trong mẫu thử,
ngoài ra còn xác định được độ nhạy cảm trong
phát hiện hai tác nhân vi khuẩn này một cách
riêng lẻ hay đồng thời Thành công này là chìa
khóa để có thể tiến tới chế được bộ thử nghiệm
PCR phát hiện C trachomatis và N gonorrhoeae
trong các bệnh phẩm lấy từ đường tiết niệu và sinh
dục bệnh nhân
Tài liệu tham khảo
1 Centers for Disease Control and Prevention 2001
Sexually transmitted disease surveillance 2000
supplement: Chlamydia Prevalence Monitoring Project
U.S Department of Health and Human Services, CDC,
Atlanta, Ga
2 Centers for Disease Control and Prevention 2002
Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2002
Morb Mortal Wkly Rep 51:1–78
3 Burstein, G., C A Gaydos, M Diener-West, M R Howell, J Zenilman, and T C Quinn 1998 Incident
Chlamydia trachomatis infections among inner city
adolescent females: implications for frequency of chlamydial screening JAMA 280:521–526
4 Burstein, G., G Waterfield, A Joffe, J M Zenilman, T
C Quinn, and C A Gaydos 1998 Screening for gonorrhea and chlamydia by DNA amplification in adolescents attending middle school health centers: opportunity for early intervention Sex Transm Dis 25:395–402
5 Burstein, G R., J M Zenilman, C A Gaydos, M Diener-West, M R Howell, W Brathwaite, and T C
Quinn 2001 Predictors of repeat Chlamydia trachomatis
infections diagnosed by DNA amplification testing among inner city females Sex Transmit Infect 77:26–
32
6 Centers for Disease Control and Prevention 2002
Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and
Neisseria gonorrhoeae infections, 2002 Morb Mortal
Wkly Rep 51:1–38
7 U.S Preventive Services Task Force 2001 Screening for chlamydial infection, recommendations and rationale Am
J Prev Med 20:90–94
8 Handsfield, H H 1990 Neisseria gonorrhoeae, p 1613–
1631 In G L Mandell, R G Jr Douglas, and J E Bennett (ed.), Principles and practice of infectious diseases, 3rd ed Churchill Livingstone, New York, N.Y
9 Biro, F M., S L Rosenthal, and M Kiniyalocts 1995 Gonococcal and chlamydial genitourinary infections in symptomatic and asymptomatic adolescent women Clin Pediatr 34:419–423
10 Dalabetta, G., and E W Hook III 1987 Gonococcal infections Infect Dis Clin N Am 1:25–24
11 Roche Diagnostic Systems Inc 1996 AMPLICOR™
Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae (CT/NG)
test package insert Roche Diagnostic Systems,Inc., Branchburg, N.J
