Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 62420201
LÊ UYỂN THANH
PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp.
GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA
HỒNG (Rosa spp.) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp.)
TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÒNG TRỊ BỆNH
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: TS Nguyễn Đức Độ
Người hướng dẫn phụ: TS Trần Đình Giỏi
Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ sở.Họp tại: Phòng bảo vệ luận án tiến sĩ, lầu 2, nhà điều hành, trường Đạihọc Cần Thơ Vào lúc 14 giờ ngày 4 tháng 5 năm 2022
Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Đức Hoàng
Phản biện 2: PGS TS Hà Viết Cường
Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng
PGS.TS Nguyễn Văn Thành
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3DANH MỤC NHỮNG BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
[1] Lê Uyển Thanh, Tô Lan Phương, Trần Đình Giỏi, Nguyễn Đức Độ (2021).Phân lập và xác định vi khuẩn từ vùng sinh thái bản địa có khả năng đối
kháng với Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa
spp.) Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ISSN 1859-4581 (Sốchuyên đề Công nghệ Sinh học trong Nông nghiệp, 18: 29-35
[2] Lê Uyển Thanh, Tô Lan Phương, Trần Đình Giỏi, Nguyễn Đức Độ (2021).Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn bản địa đối kháng triển
vọng đối với bệnh đốm lá (Xanthomonas spp.) trên cây hoa hồng (Rosa
spp.) Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam ISSN
1859-1558, 10 (131): 94-99
Trang 4CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, sản xuất nông nghiệp phụ thuộc rất nhiều vào việc sửdụng thuốc bảo vệ thực vật vì chúng cho hiệu lực cao và hiệu quả nhanhchóng Tuy nhiên, thực trạng biến đổi khí hậu ngày càng khiến canh tácnông nghiệp gặp nhiều khó khăn với vệc cây trồng sinh trưởng phát triểnkhông hiệu quả, dịch bệnh dễ bùng phát, và tình trạng ô nhiễm môi trườngngày càng trở nên trầm trọng Tại Đồng Tháp, gần đây đã xuất hiện nhiềudịch bệnh nghiêm trọng Trong đó, bệnh đốm lá vi khuẩn do chi
Xanthomonas gây ra trên hai loài cây trồng chủ lực của tỉnh là cây ớt và
cây hoa hồng lửa là đặc biệt nghiêm trọng Do nông dân đã canh tác liêntục trong năm để tăng thu nhập, kết hợp với việc mở rộng không ngừngvùng chuyên canh đã tạo điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển vàgây hại Để đối phó với bệnh đốm lá vi khuẩn, cây bệnh mới phát thường
bị nhổ bỏ ngay hoặc hạn chế tưới nước, phun các loại thuốc hóa học đặctrị vi khuẩn Tuy nhiên, các biện pháp này chỉ là giải pháp tạm thời vì việc
sử dụng thuốc hóa học phổ rộng và lâu dài sẽ rất tốn kém, gây hại chothiên địch và các vi sinh vật có lợi, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởngđến sức khỏe cộng đồng và dễ làm mầm bệnh kháng thuốc Do đó, cầntập trung nghiên cứu phát triển các phương pháp mới giúp kiểm soát bệnhcây trồng một cách thành công và không tác động xấu đến sức khoẻ conngười và môi trường
Trong trường hợp này, kiểm soát sinh học là một giải pháp thay thếtiềm năng và mang nhiều ưu điểm về tính bền vững, phương thức hoạt
động và độc tính so với thuốc trừ bệnh hóa học (Bale et al., 2008) Chúng
phân tán nhanh hơn vào môi trường và thường ít độc hơn đối với các loàikhông phải mục tiêu Ngoài ra, vì sử dụng các phương thức tác động khácvới thuốc trừ bệnh hóa học thông thường nên chúng có thể giúp ngăn chặn
các mầm bệnh kháng thuốc (Marasco et al., 2012; Bhattacharyya et al.,
2016) Xuất phát từ những hiện trạng trên, luận án “Phân lập vi khuẩn
Trang 5Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây
ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh đồng tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng
phòng trị bệnh” đã được nghiên cứu và thực hiện
1.2 Mục tiêu của luận án
Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng lửa (Rosa spp.) và cây ớt cay (Capsicum spp.).
Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh
đốm lá vi khuẩn do Xanthomonas spp gây ra.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây hại và xác định các dòng
vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng lửa và cây ớt cay.Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với
Xanthomonas spp được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái
bản địa
Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trongđiều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng.Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soátbệnh tiềm năng trong điều kiện ngoài đồng
1.4 Tính mới của luận án
Nghiên cứu đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh đốm
lá trên cây hoa hồng và Xanthomonas spp gây bệnh đốm lá trên cây ớt
nhờ vào các kỹ thuật sinh hóa, MALDI-TOF-MS và sinh học phân tử nhưMLSA
Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận các dòng B velezensis (BR16), B subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp (BP11, X32),
Enterobacter spp (T11), Serratia spp (X16) có khả năng đối kháng đáng
kể Đặc biệt, nghiên cứu đã tuyển chọn được B amyloliquefaciens BR88,
B velezensis BP103, B subtilis G24 có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá
Trang 6vi khuẩn hiệu quả nhất dựa trên các thí nghiệm sàng lọc in vitro, nhà lưới,
ngoài đồng, và xác định danh pháp bằng kỹ thật phân tích
MALDI-TOF-MS và Sinh học phân tử Các dòng vi khuẩn này có thể được sử dụng nhưtác nhân sinh học phòng trị bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt
1.5 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu
1.5.1 Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm khi
phân lập vi khuẩn gây bệnh và tuyển chọn in vitro các dòng vi khuẩn đối
kháng
Nghiên cứu đánh giá khả năng gây hại của các dòng Xanthomonas
spp và đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn đối khángđược thực hiện ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng
1.5.2 Đối tượng nghiên cứu
Giống cây hoa hồng lửa và cây ớt chỉ thiên được sử dụng trong thínghiệm, đây là giống được người dân trồng phổ biến tại tỉnh Đồng Tháp
và được người dân đánh giá là giống có tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất Bêncạnh đó, vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn đối kháng được phân lập từ tỉnhĐồng Tháp
1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.6.1 Ý nghĩa khoa học
Dựa trên các kỹ thuật phân tích liên quan đến sinh hóa và sinh họcphân tử hiện đại, các kết quả đã được xử lý bằng các phân tích khoa họctrên phần mềm được công nhận đã cung cấp một nguồn thông tin khoahọc, tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo Kết quả xác địnhđược các dòng gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng cũng như trên cây ớt.Đồng thời qua các kỹ thuật này cũng xác định được các dòng vi khuẩnđối kháng triển vọng, góp phần vào chứng minh và khẳng định khả năng
áp dụng vào thực tế sản xuất của các dòng vi khuẩn đối kháng này
1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn
Trang 7Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học hướng đến sử dụngcác dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng trong kiểm soát bệnh đốm lá trêncây hoa hồng và cây ớt trong điều kiện sản xuất thực tế, phục vụ sự pháttriển nông nghiệp theo hướng bền vững.
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật
Xanthomonas là một chi vi khuẩn lớn gây bệnh trên thực vật, có
phản ứng gram âm, hình que và sắc tố vàng Chúng gây bệnh trên 400loài vật phân bố trên toàn thế giới và là tác nhân gây bệnh nhiều cây trồngquan trọng như: lúa, cam quýt, sắn, cà chua, mía đường, chanh dây, chuối
Một số Xanthomonas spp gây bệnh cho các loài cây thuộc họ Rosaceae đã được báo cáo, như Xanthomonas fragariae trên dâu tây (Robert et al., 1997), X pruni trên đào (Wert et al., 2006) Tuy nhiên, rất
ít báo cáo về Xanthomonas spp gây bệnh về hoa hồng (Rosa spp.), một
thành viên của họ Rosaceae, bước đầu ghi nhận dòng vi khuẩn này trên
cây hoa hồng thuộc loài Xanthomonas euvesicatoria (Huang et al 2013; Barak et al., 2016).
Trên họ Solanaceae, Jones et al (2004) đã ghi nhận rằng tất cả vi khuẩn thuộc Xanthomonas gây bệnh đốm lá vi khuẩn được phân thành 4 loài là X euvesicatoria, X vesicatoria, X perforans, và X gardneri Trong đó, X euvesicatoria và X vesicatoria gây bệnh trên cả ớt và cà chua Trong khi, một số loài Xanthomonas spp chỉ gây bệnh trên cà chua như X perforans and X gardneri Tuy nhiên, gần đây Potnis et al (2015) lại ghi nhận X perforans đã xuất hiện trên ớt Tại Hàn Quốc, Myung et
al (2015) và Kyeon et al (2016) đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria
gây bệnh trên ớt (Capsicum sp.).
2.2 Các nghiên cứu về Xanthomonas sp gây bệnh đốm lá trên hoa
hồng và cây ớt
Trang 82.2.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng
Năm 2013, Huang et al tiến hành nghiên cứu bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng (Rosa spp.) tại Hoa Kỳ Kết quả ghi nhận những dòng
vi khuẩn này ít có sự biến đổi di truyền đáng kể, chỉ có hai haplotype, và
rơi vào X axonopodis phân nhóm 9.2 (Rademaker et al., 2005), cách đặt tên mầm bệnh rosa được đề xuất theo quyết định danh pháp được mô tả trước đây Barak et al (2016) đã giải trình tự toàn bộ gen đã kết luận dòng
vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng là Xanthomonas
euvesicatoria pv rosa Tên X euvesicatoria pv rose cũng được công
nhận và sử dụng để nghiên cứu về vi khuẩn Xanthomonas gây bệnh hoa hồng (Fan et al., 2022).
2.2.2 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt
Myung et al (2009) đã tiến hành ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh đốm lá trên cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.) trong nhà kính thương mại ở Jinju,
Hàn Quốc vào năm 2014, kết quả cho thấy có tỷ lệ mắc bệnh đốm lá là35%, với các triệu chứng đốm lá điển hình trên cây con Chuỗi gen của
các dòng được phân lập có sự tương đồng 100% với gen của X.
euvesicatoria ICMP 109T Một nghiên cứu khác của Kyeon et al (2016)
với 72 mẫu bệnh trên cây ớt trên khắp Hàn Quốc được sử dụng để xácđịnh tác nhân gây bệnh Kết quả của nghiên cứu này cho thấy đốm vi
khuẩn trên cây ớt ở Hàn Quốc chỉ do X euvesicatoria gây ra Gần đây, Myung et al (2015) đã ghi nhận rằng dòng mới nhất gây bệnh đốm vi khuẩn trên ớt ở Hàn Quốc là do X euvesicatoria.
2.3 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát mầm bệnh
do Xanthomonas spp gây ra trên cây trồng
Các dòng vi sinh vật thuộc nhóm xạ khuẩn Streptomyces sp.,
Bacillus spp có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae
pv oryzae (Xoo) gây bệnh bạc lá lúa, với 4 dòng vi khuẩn thuộc chi
Bacillus spp PD17, PD13.1 (Oanh, 2020) Ngoài ra, Bacillus velezensis,
B subtilis, B amyloliquefaciens trong việc kiểm soát mầm bệnh thực vật
Trang 9do vi khuẩn (Mirik et al., 2008, Huang et al., 2012; Liu et al., 2016; Fira
et al., 2018; Liu et al., 2018).
Kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng vi sinh vật và các sản phẩmcủa chúng đã được chứng minh là đạt hiệu quả trong việc kiểm soát các
loài thuộc chi Xanthomonas (Lanna Filho et al., 2010; Murate et al., 2015; Daungfu et al., 2018; Príncipe et al., 2018) Vì vậy, những nghiên cứu
gần đây trong việc tìm kiếm các vi sinh vật để kiểm soát sinh học của một
số loài Xanthomonas quan trọng đối với nền kinh tế thế giới ngày càng
được quan tâm
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thời gian: Từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 12 năm 2019
- Địa điểm thực hiện: Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiêncứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần thơ; Viện Lúa Đồngbằng Sông Cửu Long; Trường Đại học Đồng Tháp
3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.2.1 Dụng cụ và thiết bị
Lame, Lamelle, đĩa petri, ống nghiệm, ống falcon, bình tam giác,đũa khuấy, eppendorf, micropipette,… Tủ cấy, máy đo pH, Vortex, máy
ly tâm, máy lắc ngang, water bath, tủ ủ ấm, tủ lạnh trữ mẫu, kính hiển vi,
tủ thanh trùng khô, autoclave, cân điện tử
3.2.2 Vật liệu
Các hóa chất cần thiết cho các môi trường, isoamyl alcohol(Merk), sodium acetate (Merk), ethanol 95%, ethanol 70%, nước cất 2lần, Tris HCl (pH 8,0), TE buffer 1X (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mMEDTA), Mastermix (Phusa), ethium bromide (Merk), loading buffer 10
X, ladder 1 kb (Thermo scientific), ladder 100 bp (Thermo scientific),agarose (Merk), 1X TAE buffer (400mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH8), cặp mồi chung 27F/1492R (Weisburg, 1991), 6 cặp mồi cho các gen
Trang 10housekeeping fusA, gap1, gltA, gyrB, lacF, và lepA (Ameida et al.,
2010), giống cây hoa hồng lửa, cây ớt chỉ thiên, vi khuẩn gây bệnh đốm
lá (từ cây bệnh tại Đồng Tháp) và vi khuẩn được phân lập từ cơ chất, đấtvùng rễ, đất vùng sinh thái bản địa
Đối với các thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng sử dụng Cây hoahồng thuộc giống hồng lửa được trồng trong chậu nhựa, trên giá thể làrơm oai mục, sau 45 ngày trồng và được cắt cành vào 7 ngày trước khi thínghiệm Cây ớt được trồng từ hạt (2 tuần),sau đó được trồng trong chậunhựa chứa giá thể vô trùng gồm đất, xơ dừa và trấu, phân mùn với tỷ lệ5:3:2, xử lý các thí nghiệm trên lá của cây con đạt 4 tuần tuổi
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Luận án đã thực hiện 14 thí nghiệm, tương ứng với 4 nhóm nộidung là (1) Phân lập, khảo sát khả năng gây hại và xác định các dòng vikhuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng lửa và cây ớt cay, với 3 thínghiệm; (2) Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với
Xanthomonas spp được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái
bản địa, 4 thí nghiệm; (3) Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vikhuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn đối kháng triểnvọng, 4 thí nghiệm; (4) Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểmsoát bệnh tiềm năng trong điều kiện ngoài đồng, 4 thí nghiệm
3.3.1 Nội dung 1: Phân lập và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt
3.3.1.1 Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp từ các mẫu bệnh
Mục tiêu: Phân lập được những dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây
hoa hồng lửa và cây ớt phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát khả năng lâynhiễm, định danh và đối kháng về sau
Phương pháp
- Thu thập mẫu bệnh đốm lá vi khuẩn: Mẫu bệnh đốm lá vi khuẩn
có triệu chứng bệnh điển hình (Lowell et al., 1991; Jones et al., 2004;
Trang 11Agrios, 2006; Huang et al., 2013; Cúc & Thủy, 2014; Kyone et al., 2016)
trên hai loại cây trồng là ớt (20 vườn) và hoa hồng lửa (20 vườn) tại tỉnh
Đồng Tháp (Burgess et al., 2009).
- Phân lập vi khuẩn gây bệnh: dòng dịch vi khuẩn ứa ra từ mẫubệnh được cấy lên đĩa petri chứa môi trường King's B theo Thước (2007)
Các bước phân lập theo phương pháp của Burgess et al (2009); Kyeon et
al (2016) Trữ giống ở điều kiện lạnh sâu (–200C), có kết hợp glycerol
vô trùng 30% (Araújo et al., 2012; Kyeon et al., 2016).
- Đặt tên vi khuẩn: Ký tự chữ là viết tắt chi vi khuẩn và đối tượngcây chủ, ký hiệu số là chỉ số dòng thu thập được từ 1 đến 20
3.3.1.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên các cây trồng đã chọn của các dòng Xanthomonas spp gây bệnh
Mục tiêu: Đánh giá được khả năng lây nhiễm lên cây chủ của các
dòng vi khuẩn gây bệnh tương ứng Chọn lọc được dòng vi khuẩn có khảnăng gây bệnh cao nhất, trung bình và thấp nhất, phục vụ cho các nghiêncứu tiếp theo
Phương pháp: Trên 2 đối tượng cây chủ là cây hoa hồng lửa và
cây ớt tương ứng với 2 thí nghiệm Trên mỗi thí nghiệm, bố trí ngẫu nhiên,
3 lần lặp lại với 21 nghiệm thức, với mỗi lần lặp lại trên 4 cây (đối vớicây hoa hồng) và trên 10 cây (đối với cây cây ớt) Bao gồm:
- NT 1: Không lây nhiễm bệnh
- NT 2 đến 21: Xử lý lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh được phân lậpriêng lẻ từ dòng 1 đến dòng 20
Ghi nhận chỉ tiêu: Mức độ bệnh qua 16 ngày sau lây nhiễm với tỷ
lệ bệnh và chỉ số bệnh theo QCVN 01– 38: 2010/BNNPTNT, (IRRI,2002; Sharma, 2004); Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian AUDPC đượctính theo Jeger &Viljanen-Rollinson (2001)
3.3.1.3 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp dựa vào hình
thái và phương pháp sinh hóa
Trang 12Mục tiêu: Xác định được tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây hoa
hồng và cây ớt
a) Xác định ba dòng XP17, XP7, XP1 (gây bệnh đốm lá trên cây ớt) theocác xét nghiệm sinh hóa
Phương pháp: Tiến hành nuôi cấy và khảo sát ba dòng XP17,
XP7, XP1 theo các chỉ tiêu sinh hóa như: Phản ứng Gram, hoạt tính
catalase (Schaad et al., 2001; Kyeon et al., 2016).
Ghi nhận chỉ tiêu: Ghi nhận các kết quả như khuẩn lạc có màu
vàng; phản ứng Gram (–) âm tính; Cho hoạt tính catalase (+) dương tính.b) Xác định danh pháp ba dòng XR13, XR9, XR18 (gây bệnh đốm lá trêncây hoa hồng) theo phương pháp MALDI-TOF-MS
Phương pháp: Ba dòng vi khuẩn được nuôi cấy, các bước xét
nghiệm theo Strejcek et al (2018); Ribeiro et al (2019) Khối phổ được
phân tích qua máy Biotyper (Bruker Daltonics, Đức) Kết quả thể hiệnqua giá trị điểm (score value - SV) từ 0 đến 3, với SV< 1,7 là chưa xácđịnh được danh pháp; SV từ 1,7 - 2,0 được xem là có thể xác định chi,
SV từ 2,0 - 2,3 là xác định được chi và có thể về loài, SV≥ 2,3 là có thểxác định chắc chắn về chi và loài
Ghi nhận chỉ tiêu: kết quả được đánh giá qua hệ thống tự động, so
sánh với hướng dẫn của hệ thống đến mức độ chi hoặc loài
c) Xác định danh pháp ba dòng XR13, XR9, XR18 (gây bệnh trên câyhoa hồng) theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MLSA)
Phương pháp
- Các phân tích sáu gen housekeeping fusA, gap1, gltA, gyrB, lacF,
và lepA (Ameida et al., 2010; Huang et al., 2013) của dòng XR13 có khả
năng lây nhiễm bệnh cao nhất
- Chuẩn bị và giải trình tự các gen của XR13: Khuếch đại trình tự
được chọn với các mồi PCR và các điều kiện khuếch đại theo Almeida et
al (2010) Sản phẩm khuếch đại được giải trình tự nhờ hệ thống BigDye
Trang 13Terminator Cycle Sequencing Chemistry and ABI 3730 XL Sequencer(Applied Biosystems).
- Xử lý trình tự các gen của XR13 được giải: Các chuỗi đã đượccanh chỉnh bằng BioEdit phiên bản 7.2.5, được so sánh với cơ sở dữ liệutrên Ngân hàng gen (NCBI) nhờ kỹ thuật BLASTn, và được gửi đăng kýaccession number vào Ngân hàng Gen (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/)
- Các dòng Xanthomonas spp phục vụ so sánh được tải xuống từ
hệ thống PAMDB.org (Ameida et al., 2010) Trình tự các gen của dòng
Xanthomonas euvesicatoria pv R07 và Stenotrophomonas maltophilia
R551 được tải về từ hệ thống Genbank (NCBI)
- Phân tích phát sinh loài trên chương trình MEGA X với phân tíchneighbor-joining tree, kỹ thuật Maximum Composite Likelihood Đánhgiá ma trận tương đồng theo kỹ thuật Distance/compute pairwisedistances của MEGA X
Ghi nhận chỉ tiêu: Kết quả so sánh trên GenBank qua kỹ thuật
BLAST được ghi nhận; Cây phát sinh loài, sự tương đồng giữa các loàithu được qua phân tích trên MEGA X
3.3.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có nguồn gốc từ cơ chất vùng
rễ và đất vùng sinh thái bản địa có khả năng đối kháng với
Xanthomonas spp gây bệnh đã được phân lập
3.3.2.1 Phân lập vi khuẩn
Mục tiêu: Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng đối
kháng triển vọng đối với các dòng Xanthomonas spp được chọn.
Phương pháp:
- Thu mẫu đất theo TCVN 5297:1995: (Mẫu đất, cơ chất từ vùng
rễ của những cây có sự sinh trưởng tốt vượt trội, không có dấu hiệu bệnh;với VQG Tràm Chim -18 mẫu, Khu du lịch sinh thái Gáo Giồng - 9 mẫu,Khu di tích Xẻo Quýt - 9 mẫu)
Trang 14- Phân lập theo Thước, (2007); Điệp & Hiệp (2011); Trữ giống ởđiều kiện lạnh sâu (–200C) trong môi trường Nutrient Broth kết hợpglycerol vô trùng 30%.
3.3.2.2 Khảo sát khả năng đối kháng in vitro trước các dòng Xanthomonas spp được chọn của những dòng vi khuẩn phân lập được
từ mẫu đất
Mục tiêu: Lựa chọn được những dòng vi khuẩn đối kháng triển
vọng trước Xanthomonas spp gây bệnh được chọn.
Phương pháp: Chuyển huyền phù vi khuẩn phân lập được (OD600
= 0,3) từ mẫu đất sang đĩa petri chứa mầm bệnh, đặt ở 280C trong 24 giờ
(Li et al., 2006; 2008).
Ghi nhận chỉ tiêu: đường kính vùng ức chế vi khuẩn.
3.3.2.3 Khảo sát mật độ đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng đối với Xanthomonas spp XP17 và XR13
Mục tiêu: Xác định được mật độ vi khuẩn đối kháng tối thiểu có
khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh
1000 và 10000 lần
- Hút và nhỏ giọt 5 µL huyền phù vi khuẩn đối kháng vào đĩa petri
đã chứa Xanthomonas spp Các đĩa petri được giữ ở 28 ± 2o
C trong 36giờ
Ghi nhận chỉ tiêu: Đường kính vùng ức chế hình thành bởi vi
khuẩn đối kháng chống lại Xanthomonas spp
Trang 153.3.2.4 Định danh một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng
a) Xác định danh pháp vi khuẩn đối kháng theo phương pháp TOF-MS
MALDI-Mục tiêu: Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được định danh
đến mức độ chi hoặc loài theo kỹ thuật MALDI-TOF
Phương pháp: Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng nhất được
xác định với kỹ thuật MALDI-TOF-MS theo Strejcek et al (2018); Ribeiro et al (2019) Khối phổ được phân tích qua máy Biotyper (Bruker
Mục tiêu: Các dòng vi khuẩn triển vọng chưa xác định được qua
MALDI-TOF-MS được xác định qua kỹ thuật sinh học phân tử
Phương pháp: Tách chiết DNA, khuếch đại gen 16S rRNA với
cặp mồi chung 27F/1492R (Weisburg, 1991) và giải trình tự qua hệ thốngABI 3730 XL Sequencer; Các trình tự gen này được so sánh trên ngânhàng gen (NCBI) bằng công cụ BLAST-N, xác định tên của vi khuẩn vàđăng ký “accession number” trong ngân hàng gen (NCBI)
3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng
Mục tiêu: Đánh giá được hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá trên cây
hoa hồng lửa, ớt của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng
Phương pháp: Gồm 4 thí nghiệm, tương ứng nhóm vi khuẩn đối
kháng và các dòng Xanthomonas spp được chọn (Bảng 3.3).
Trang 16Bảng 3.3: Các thí nghiệm khảo sát khả năng kiểm soát bệnh trong điềukiện nhà lưới
Ba dòng vi khuẩnđối kháng triểnvọng từ vùng sinhthái bản địa
XR13,XR9,XR18
XP17,XP7,XP1
NT 1: Không xử lý vi khuẩn đối kháng hoặc lây bệnh;
NT 2, 3, 4: Không xử lý vi khuẩn đối kháng và có lây bệnh nhân
tạo với một trong ba dòng Xanthomonas spp được chọn;
NT 5, 6, 7: Lá được phun với một trong ba dòng vi khuẩn đối khángđược chọn với mật độ 107
CFU/mL, được phun trước 48 giờ lây bệnh
nhân tạo với một trong ba dòng Xanthomonas spp được chọn (108
CFU/mL)
Ghi nhận chỉ tiêu: Mức độ bệnh qua 16 ngày sau lây nhiễm với tỷ
lệ bệnh và chỉ số bệnh theo QCVN 01– 38: 2010/BNNPTNT, (IRRI,2002; Sharma, 2004); Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian AUDPC đượctính theo Jeger &Viljanen-Rollinson (2001); Hiệu quả giảm bệnh theoAbbott (1925)
3.3.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn ở điều kiện ngoài đồng
Mục tiêu: Đánh giá được hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn
của các dòng đối kháng triển vọng ở điều kiện ngoài đồng