Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ABA Abcisis acid

phiên mã ngược (Complementary DNA)

E coli Escherichia coli

GUS β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)

LEA Late embryogenesis abundant

nptII Neomycin phosphotransferase gene

P5CS pyroline-5-carboxylate synthetase

P5CDH Pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase

P5CR Pyrroline 5 carboxylate reductase

PDH Pyrroline dehydrogenase

rd29A Responsive Dehydration

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 0

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học 4

1.1.3 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương 5

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 6

1.2 CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 10

1.2.1 Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn 11

1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ 11

1.2.1.2 Khả năng cố định nitơ của cây đậu tương trong điều kiện hạn 13

1.2.2 Các tính trạng liên quan đến sự thích ứng của lá cây đậu tương trong điều kiện hạn 14

1.2.2.1 Cường độ thoát hơi nước của khí khổng 14

1.2.2.2 Cường độ thoát hơi nước của biểu bì 15

1.2.2.3 Mật độ lông tơ của lá 16

1.2.2.4 Hiệu quả sử dụng nước 17

1.2.3 Đáp ứng về phương diện hóa sinh của cây đậu tương trong điều kiện hạn 18

1.2.4 Một số gen liên quan đến tính chịu hạn 19

1.3 PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP PROLIN 21

1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp prolin 21

1.3.2 Điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật 23

1.3.3 Vai trò của sự tích lũy prolin đối với tính chống chịu của cây 25

1.3.4 Vai trò của enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase đối với tính chống chịu của cây trồng 27

1.4 PROMOTER VÀ VAI TRÒ ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CỦA GEN DƯỚI ĐIỀU KIỆN KHÔ HẠN 29

1.4.1 Cấu trúc và chức năng của promoter 29

1.4.2 Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học 30

1.4.3 Promoter rd29A 32

1.5 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 32

1.5.1 Nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm 32

1.5.2 Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong chọn dòng đậu tương chịu hạn 33

1.5.3 Sử dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương 35

1.5.3.1 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 35

1.5.3.2 Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây đậu tương chịu hạn 37

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.2.1 Phương pháp sinh lý, hoá sinh 39

2.2.1.1 Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn 39

2.2.1.2 Định lượng protein, lipit, hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt 39

2.2.1.3 Xác định hàm lượng prolin 40

2.2.1.4 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 40

2.2.2 Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro 40

2.2.2.1 Arabidopsis 40

2.2.2.2 Thuốc lá 40

2.2.2.3 Đậu tương 41

2.2.3 Phương pháp sinh học phân tử 44

2.2.3.1 Thiết kế mồi 44

2.2.3.2 Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA 44

2.2.3.3 Phương pháp tổng hợp cDNA 45

2.2.3.4 Phản ứng PCR 45

2.2.3.5 Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention) 46

2.2.3.6 Phương pháp tách dòng 46

2.2.3.7 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 49

2.2.2.8 Thiết kế cấu trúc rd29A::GUS và rd29A::P5CSM……… ………49

2.2.3.9 Các phương pháp phân tích cây biến nạp 52

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 KẾT QUẢ SƯU TẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG CỦA TỈNH SƠN LA 53

3.1.1 Đặc điểm hình thái, hóa sinh của hạt đậu tương 53

3.1.2 Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu 55

3.2 PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC 58

3.2.1 Kết quả phân lập gen P5CS 58

3.2.2 Kết quả khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen P5CS 58

3.2.3 Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ cây đậu tương 69

3.3 PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A 72

3.3.1 Phân lập promoter rd29A 72

3.3.2 Phân tích trình tự promoter rd29A 73

3.3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75

3.3.4 Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS 75

3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM 78

3.4.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 78

3.4.2 Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM 81

3.4.3 Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen 82

3.5 KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN 84

3.5.1 Kết quả tái sinh tạo đa chồi ở giống đậu tương DT84 84

3.5.1.1 Tối ưu thời gian khử trùng hạt 84

3.5.1.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín 87

3.5.1.3 Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng GA3 tới khả năng kéo dài chồi 89

3.5.1.4 Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ 91

3.5.1.5 Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro 93

3.5.2 Kết quả bước đầu chuyển gen GUS vào cây đậu tương DT84 94

3.5.3 Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương 96

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO 102

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.2 Chỉ số chịu hạn và tỷ lệ tăng hàm lượng prolin của 7 giống đậu

tương nghiên cứu

57

Bảng 3.4 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống

(µmol/g)

82

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến khả năng

nảy mầm đậu tương DT84

85

nảy mầm đậu tương DT84

86

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.2 Cơ chế và các tác nhân điều hòa quá trình trao đổi prolin ở

thực vật

23

đậu tương địa phương và giống DT84

Hình 3.7 Trình tự axit amin của Protein do gen P5CS mã hóa ở 3 giống

đậu tương

67

Hình 3.8 Mức độ tương đồng của các axit amin gen P5CS mã hóa của

các giống đậu tương

68

Hình 3.9 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại so sánh mức độ tương đồng

của các axit amin của protein do gen P5CS của các giống đậu

68

Hình 3.11 Phản ứng nối hai đoạn gen theo phương pháp OE-PCR với

cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl -P5CS

70

Hình 3.12 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới

hạn BamHI

71

Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình tự nucleotid và phát hiện đột biến tại

vị trí nucleotid 374 của gen P5CS

71

Hình 3.14 Kết quả nuôi cấy invitro cây Arabidopsis thaliana 72

Hình 2.21 Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen

Hình 3.23 Điện di sản phẩm cloning PCR và cắt hạn chế vector pBT

rd29A::/P5CSM

80

Hình 3.25 Kết quả PCR các dòng chuyển gen bằng cặp mồi rd29A

Hình 3.33

Hình 3.34

Biểu hiện của gen GUS

Sơ đồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm

95

96

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây đậu tương (Glycine max L Merrill) là một trong những cây trồng quan trọng

không chỉ ở Việt Nam mà còn đối với nhiều quốc gia trên thế giới Hạt đậu tương có thể được dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho con người và là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến Đậu tương là loại cây trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao khi sử dụng làm thương phẩm, và được sử dụng cho mục đích cải tạo đất Bên cạnh đó, đậu tương rất dễ canh tác, có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái, khí hậu khác nhau và được trồng ở nhiều vùng quốc gia và vùng lãnh thổ với sản lượng năm 2009 là trên 222 triệu tấn [107]

Tại Việt Nam, cây đậu tương cũng giữ vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng ở nhiều địa phương, với sản lượng trung bình từ 2001 - 2009 là 239,1 nghìn tấn Theo thống kê năm 2009 cho thấy, cây đậu tương được canh tác có hệ thống trên diện tích là 146,2 nghìn ha ở 28 tỉnh thành trải đều từ Bắc vào Nam, nhưng tập trung chủ yếu vẫn là ở miền Bắc với sản lượng của cả nước là 213,6 nghìn tấn [107] Trong khu vực ASEAN, năng suất đậu tương năm 2009 của Việt Nam đứng thứ 3 trong số 6 nước trồng đậu tương là Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan và Việt Nam Tuy nhiên so với các trung tâm sản xuất đậu tương của thế giới là Argentina, Brazil và Hoa

Kỳ thì sản lượng đậu tương của nước ta còn khá thấp [107] Vì thế, để đáp ứng đủ nhu cầu trong nước nên chúng ta phải nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn từ các quốc gia bên ngoài đặc biệt là Hoa Kỳ

Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả những nước sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới như Argentina Thống kê cho thấy, sản lượng đậu tương của Argentina vào vụ mùa năm

2009 giảm từ 34,5 triệu tấn so với cùng thời điểm năm 2008 là 46,2 triệu tấn Ở Việt Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng tại các địa phương làm cho sản lượng đậu tương của năm 2009 giảm xuống chỉ còn 213,6 nghìn tấn so với năm 2007 là 275,2 nghìn tấn

và năm 2008 là 267,6 nghìn tấn [106] Đậu tương là cây trồng thuộc nhóm cây có khả

năng chịu hạn kém Chính vì vậy nghiên cứu tạo giống đậu tương có khả năng sống trong điều kiện bất lợi về nước đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm của các nhà chọn giống Ở Việt Nam, nhiều giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn đã được chọn tạo thành công và đang được triển khai canh tác ở một số địa phương Có thể kể đến các giống DT96, DT2008 do các nhà khoa học tại Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo Dòng đậu tương ML48, ML61 do tác giả Chu Hoàng Mậu chọn tạo có khả năng chịu hạn cao [15] Tuy nhiên các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp và cần phải có quần thể đủ lớn và không ổn định Những nhược điểm của phương pháp truyền thống

có thể được khắc phục bằng việc áp dụng các kỹ thuật mới của công nghệ sinh học Kỹ

thuật chuyển gen ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được

các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng và đạt được những kết quả rất có triển vọng trên cây đậu tương Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa tại Viện nghiên cứu lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã thành công trong việc tạo ra các giống đậu tương mới mang tính kháng sâu bệnh [9] Tuy nhiên, cho đến nay công trình nghiên cứu về chuyển gen chịu hạn vào cây đậu tương vẫn chưa được quan tâm đúng

mức Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ là: “Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 So sánh trình tự gen mã hóa P5CS của giống địa phương thuộc nhóm chịu hạn tốt

và giống đậu tương DT84 Tạo được đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bởi prolin

2.2 Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương

2.3 Tạo cây đậu tương mang cấu trúc gen liên quan đến đặc tính chịu hạn

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân tích đặc điểm sinh lý, hóa sinh của một số giống đậu tương trồng tại khu vực miền Bắc

3.2 Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa enzyme pyroline-5 carboxylate synthetase (P5CS)

3.3 Tạo đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi (feedback inhibition) bởi prolin bằng phương pháp tạo đột biến điểm

3.4 Phân lập promoter cảm ứng dưới điều kiện khô hạn rd29A từ cây Arabidopsis

thaliana Phân tích hoạt động của promoter dựa vào hoạt động của gen GUS ở các

dòng cây thuốc lá chuyển gen

3.5 Thiết kế cấu trúc mang gen P5CS đột biến được điều khiển bởi promoter rd29A và

chuyển cấu trúc này vào cây thuốc lá

3.6 Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh và khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo

3.7 Biến nạp cấu trúc mang gen P5CS vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Phân tích sự có mặt của gen biến nạp

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX L MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ

VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây đậu tương là một trong những loài cây trồng được biết đến từ rất sớm Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước công nguyên Cây đậu tương được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ VIII, du nhập vào nhiều nước Châu

Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó Cây đậu tương được trồng ở Châu Âu vào thế kỷ XVII và ở Hoa Kỳ thế kỷ XVIII

Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm

Papilionoideae , chi Glycine với tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill Tuy nhiên theo Hymowit và Newell (1984) thì ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja Chi

Glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài

đậu tương trồng Glycine max L Merrill (Ngô Thế Dân và đtg, 1999) [6], (Trần Văn Điền, 2007) [8]

1.1.2 Đặc điểm sinh học

Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân

có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo giống

Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép Mỗi lá kép thường có 3 thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ Hình dạng của lá thay đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn

Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân Hoa mọc thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%

Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm Mỗi quả thường có 2 - 3 hạt Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục…, những giống có hạt màu vàng có giá trị thương phẩm cao Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g Hình dạng

và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống

Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết

quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ Nốt sần có thể dài

1cm, đường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0 - 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha

Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120 ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 -

150 ngày (Ngô Thế Dân và đtg, 1999) [6], (Trần Văn Điền, 2007) [8]

1.1.3 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương

Đậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt Đậu tương được xem là ông hoàng trong các cây họ đậu vì giá trị rất toàn diện của nó (Trần Văn Điền, 2007) [8]

Giá tr ị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong cá, thịt và

cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35 - 50% (phụ thuộc vào giống và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần tạo cholesteron Đậu tương còn được xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipit đậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18% Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, đáng kể là các vitamin

nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa

Giá tr ị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng đầu về cung

cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu đậu tương khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -180C và từ dầu người ta

có thể làm nến, xà phòng, nilon,…Đậu tương còn là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng,…

Giá tr ị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khô đều có thể dùng

làm thức ăn cho gia súc Đậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo đất trồng, một ha đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30 - 60 kg nitơ, thân và lá với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho phân hữu cơ Việc luân canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu

1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới: Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây đậu tương nên đây được

xem là một trong những loại cây trồng chiến lược ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngô và lúa mì Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp đến là Châu Á Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc, diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng 3,6 triệu ha trong vòng 4 năm trở lại đây (năm 2006 là 95,2 triệu ha và năm 2009 là 98,8 triệu ha) [107]

Trong đó, Hoa Kỳ là quốc gia có diện tích gieo trồng cây đậu tương lớn nhất là 30,91 triệu ha tiếp đến là quốc gia Brazil (21,76 triệu ha) và Argentina (16,77 triệu ha) vào năm 2009 (Bảng 1.1) trong khi đó Việt Nam chỉ có 0,15 triệu ha

Mặc dù diện tích gieo trồng cây đậu tương tăng lên đáng kể trong các năm trở lại đây tuy nhiên sản lượng đậu tương của cả thế giới lại có những biến động khác nhau giữa các năm Năm 2006 sản xuất đậu tương của cả thế giới đạt 221,9 triệu tấn, năm 2007 giảm xuống còn 219,5 triệu tấn, tăng lên vào năm 2008 là 230,5 triệu tấn nhưng năm 2009 chỉ còn 222,2 triệu tấn

Bảng 1.1 Diện tích sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

Diện tích gieo trồng (triệu ha)*

Trong bốn năm trở lại đây năng suất cao nhất đạt được vào năm 2007 là 24,3 tạ/ha

và thấp nhất là năm 2009 là 22,4 tạ/ha Trong số các quốc gia trồng cây đậu tương hàng đầu thế giới chỉ duy nhất Hoa Kỳ vẫn duy trì được năng suất cây đậu tương thậm chí có

phần tăng vào năm 2009 so với các năm 2006, 2007 và 2008 (Bảng 1.3) Argentina là nước có năng suất đậu tương giảm mạnh nhất vào năm 2009 chỉ còn 18,48 tạ/ha so với

các năm trước trung bình đạt khoảng 27 tạ/ha (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Năng suất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

Năng suất (tạ/ha)*

Do sự suy giảm năng suất và sản lượng tại hai quốc gia hàng đầu về sản xuất đậu tương là Brazil và Argentina nên đã ảnh hưởng đến sản lượng đậu tương của cả thế

giới (Bảng 1.3)

Ở Việt Nam: Đậu tương được gieo trồng từ lâu đời, trước cây đậu xanh và đậu đen

Tuy nhiên, với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống có năng suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành đậu tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu là lý do khiến cho nông dân không mặn mà với cây đậu tương Diện tích trồng đậu tương tăng qua các năm nhưng vẫn chỉ chiếm một tỉ lệ nhỏ (1,5 - 1,6% tổng diện tích cây nông nghiệp)

Bảng 1.4 Sản lượng sản xuất đậu tương tại các tỉnh và thành phố

Sản lượng các địa phương (nghìn tấn)*

* Theo s ố liệu của Tổng Cục Thống kê [107]

Mặc dù chưa có những số liệu thống kê cụ thể thiệt hại do hạn hán gây ra đối với sản xuất đậu tương ở Việt Nam Tuy nhiên, khi nhìn vào số liệu thống kê sản

lượng đậu tương tại các tỉnh và thành phố của Việt Nam có thể thấy rằng tại nhiều khu vực sản lượng sản xuất đậu tương giảm đáng kể so với những năm trước đây, thêm vào

đó kết hợp với những thông tin về tình hình thời tiết bất thường trong vòng 3 năm trở lại đây có thể thấy rằng bên cạnh những yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học khác thì hạn hán cũng đã ảnh hưởng không nhỏ tới sản lượng đậu tương ở một số tỉnh thành nói riêng và do đó ảnh hưởng đến sản lượng sản xuất đậu tương của cả nước nói

chung

Kết hợp với những số liệu thống kê cụ thể về sản lượng đậu tương ở các quốc gia trên thế giới và đánh giá tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam trong vòng 4 năm trở lại đây có thể khẳng định rằng, vấn đề nâng cao khả năng kháng hạn trở nên cấp thiết đối với cây đậu tương Thêm vào đó những nghiên cứu này hoàn toàn mới đối với tình hình nghiên cứu cây đậu tương tại Việt Nam và phù hợp với xu thế chung trên thế giới

1.2 CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có những phản ứng để có thể thích ứng, sinh trưởng và phát triển Các cơ chế này khá đa dạng nhưng có thể chia thành ba cơ chế chủ đạo bao gồm: cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape),

cơ chế tránh hạn (drought avoiandgce) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance)

Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn cho phép cây có thể hoàn thành chu kì sống của mình trong giai đoạn được cung cấp đủ nước trước khi hạn xảy ra Các giống đậu tương ngắn ngày được trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế này

để thích ứng với các điều kiện bất lợi về nước Các giống này có tính chín sớm và bắt đầu nở hoa vào cuối tháng 4 và tạo quả trong tháng 5, chính vì thế mà các giống này

có thể hoàn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước xảy ra từ tháng 6 tới tháng 8 Đối với cơ chế tránh hạn thì các giống đậu tương sẽ có các cơ chế để duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn thông qua việc tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận khác nhau của cây Ở các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có thể duy trì sức căng của các mô và tế bào, chính vì thế các quá trình trao đổi chất có

thể diễn ra bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất thấp Sức căng của các mô và tế bào của cây được duy trì thông qua việc tổng hợp mạnh các chất chống áp suất thẩm thấu, các chất trao đổi (Nguyen và đtg, 2007) [68]

1.2.1 Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn

1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ

Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật Ở cây đậu tương sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ

để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu (Taylor và đtg, 1978) [93] Bên cạnh đó hệ thống rễ sợi phát triển cũng giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ

ẩm cao và tìm kiếm các chất dinh dưỡng Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng đến độ sâu của rễ đậu tương là tỉ số kéo dài rễ trụ (taproot elongation rate) Do rễ trụ được hình thành đầu tiên ở đậu tương, chính vì thế việc xác định các giống đậu tương

có đặc tính kéo dài rễ trụ nhanh sẽ cho phép xác định khả năng đâm sâu của rễ Sự khác nhau về tính trạng kéo dài bộ rễ ở các giống đậu tương đã được nghiên cứu khá chi tiết ở trong điều kiện nhà lưới (Kaspar và đtg, 1984) [54] đã đánh giá 105 giống đậu tương khác nhau cho thấy tỉ số kéo dài rễ trụ khác nhau giữa các giống vào khoảng 1,3cm/ngày Những nghiên cứu tiếp theo trên các giống có tỉ số kéo dài rễ trụ cao cho thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều sâu trên 120cm so với các giống còn lại Một vài nghiên cứu cũng đã được thực hiện đối với hệ thống rễ nhánh của cây đậu tương cho thấy trong điều kiện hạn số lượng rễ nhánh trên đơn vị chiều dài rễ trụ tăng đáng kể, nhưng chiều dài và đường kính rễ trụ không thay đổi Hạn chế về nước ở cây đậu tương thường làm tăng sinh khối của rễ, từ đó làm tăng tỉ lễ rễ : thân Ở cây đậu tương không được tưới nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn ở cây đậu tương được tưới nước (Huck và đtg, 1983) [47] Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan rất chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ như khối lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ nhánh ở các giống chịu hạn Những tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có tính chịu hạn Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương được chia thành hai giai đoạn là sinh trưởng sinh dưỡng (V) và sinh trưởng sinh sản (R) Giai đoạn V

được chia thành VE đến VN, trong giai đoạn VN đỉnh sinh trưởng xuất hiện và các giai đoạn VN được đánh số phụ thuộc số lượng lá bánh tẻ xuất hiện Giai đoạn R được chia thành các giai đoạn từ R1 đến R8 Trong hai giai đoạn đầu R1 và R2 hình thành hoa, giai đoạn R3 và R4 là sự hình thành quả đậu tương, các giai đoạn chín và làm chắc hạt là từ R5 tới R8 Ở cây đậu tương, khi hạn hán xảy ra ở các giai đoạn sớm hay muộn của giai đoạn sinh trưởng sinh sản làm tăng mạnh sự phát triển bộ rễ, đặc biệt là

hệ thống rễ ở các lớp đất sâu Khả năng phát triển bộ rễ không quá bị ảnh hưởng khi hạn hán xảy ra ở giai đoạn R4 và R5 (Hoogenboom và đtg, 1987) [43] Trong một nghiên cứu khác cho thấy cây đậu tương khi bị xử lý hạn ở giai đoạn trước khi ra hoa

sẽ cho năng suất hạn cao những cây đậu tương bị xử lý hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa, điều này được giải thích là do chúng đã phát triển bộ rễ đầy đủ để thích ứng với điều kiện hạn trước khi nở hoa (Hirasawa và đtg, 1994) [39] Các kết quả này cho thấy nếu khi cây đậu tương phát triển bộ rễ lớn ở những giai đoạn sớm của quá trình sinh trưởng sinh dưỡng sẽ giúp cho cây có thể thích ứng tốt trong các điều kiện hạn

Các kết quả từ các nghiên cứu được trình bày trên đây cho thấy những tính trạng bộ rễ có thể sử dụng để cải thiện tính chịu hạn ở cây đậu tương bằng các phương pháp nhân giống thông thường Tuy nhiên, các phương pháp đo đạc các tính trạng liên quan đến bộ rễ thường rất khó thực hiện Thay vào đó các phương pháp phân tử sẽ là công cụ hỗ trợ cho các phương pháp truyền thống để nghiên cứu các tính trạng về rễ Quá trình chọn lọc các gen liên quan đến các tính trạng về rễ bao gồm các nghiên cứu sàng lọc gen từ các cơ sở dữ liệu, thiết kế mồi để nhân bản gen, xác định sự đa dạng, phát triển phương pháp phân tích hệ gen, xác định quần thể nghiên cứu Phương pháp này đã thành công trong việc xác định nhiều gen quý quy định các tính trạng rễ ở lúa trong điều kiện hạn (Valliyodan và đtg, 2006) [98] Thêm vào đó, việc hiểu biết các cơ chế sinh lý và quá trình điều hòa di truyền của sự thích nghi của bộ rễ dưới điều kiện hạn sẽ giúp ích cho việc xác định các gen đặc hiệu, các quá trình chuyển hóa để sử dụng cho việc nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp sử dụng chỉ thị gen hoặc kỹ thuật chuyển gen

1.2.1.2 Khả năng cố định nitơ của cây đậu tương trong điều kiện hạn

Khả năng cố định nitơ ở các loài cây họ đậu thường rất nhạy cảm đối với tình trạng nước ở trong đất Trong điều kiện hạn, cây đậu tương không chỉ giảm khả năng

cố định CO2, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố định nitơ cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng Kết quả này làm giảm sinh tổng hợp protein (Purcell và King, 1996) [75] Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định nitơ trong điều kiện hạn đã được xác

sần giảm, hoạt tính của enzym sucrose synthase giảm, hàm lượng ure và axit amin tự

do tăng (King và Purcell, 2005) [56] Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước của lá và nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn Hoạt tính của enzym nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó quá trình quang hợp giảm khoảng 5% Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng khuyếch tán oxy Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần

Sự thay đổi về di truyền cũng được xác định ở các cá thể nhạy cảm với khả năng cố định nitơ trong điều kiện hạn Khi so sánh các giống đậu tương có hoặc không

có khả năng duy trì tính căng mô (tissue turgidity) dưới điều kiện hạn ở giai đoạn sinh trưởng sinh sản cho thấy, giống có khả năng duy trì tính căng mô tốt hơn có năng suất hạt tốt hơn với những giống còn lại (Hàm lượng ure ở cuống lá cũng là một trong những chỉ tiêu để sàng lọc các dòng cây đậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn trong điều kiện khô hạn Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng đậu tương dựa vào chỉ tiêu này, 8 dòng đậu tương có khả năng cố định nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt hơn Nghiên cứu sâu hơn các dòng đậu tương này, Sinclair và đtg (2007) [86] tìm ra rằng quá trình dị hóa ure không phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên cứu Giống đậu tương Jackson, giống kháng hạn và có khả năng cố định nitơ cao, đã được dùng làm thể bố mẹ trong các cặp lai để tạo ra giống đậu tương có năng suất cao

ở các điều kiện hạn Hai dòng con lai từ các cặp lai này là nguồn gen tốt được dùng để cải thiện khả năng cố định nitơ và năng suất trong các điều kiện ngập úng (Sinclair và

đtg, 2007) [86] Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể giải thích được liệu khả năng cố định nitơ trong điều kiện hạn có được điều hòa ở mức độ cơ thể của cây đậu tương hay không hay quá trình này chỉ tồn tại khu trú trong nốt sần Chúng ta đã biết rằng, tín hiệu điều hòa quá trình cố định nitơ là do cơ chế phản hồi bởi nitơ (nitrogen feedback mechanism) bao gồm cả trạng thái nitơ ở thân và lá King và Purcell (2005) [56] đề xuất giả thiết là sự kết hợp ure và axit aspartic ở nốt sần và quá trình vận chuyển một số các axit amin từ lá có thể tham gia vào cơ chế ức chế phản hồi ở cây đậu tương Gần đây một nghiên cứu trên hệ thống rễ phân tách ở điều kiện hạn cho thấy hoạt tính cố định nitơ được điều khiển ở mức độ khu trú (local) hơn là ở mức độ tín hiệu nitơ hệ thống (Marino và đtg, 2007) [64] Nhiều nghiên cứu cũng đang được thực hiện theo hướng này để hiểu hơn bản chất phân tử các nhân tố hạn chế và điều hòa quá trình cố định nitơ trong điều kiện hạn ở cây đậu tương

1.2.2 Các tính trạng liên quan đến sự thích ứng của lá cây đậu tương trong điều kiện hạn

1.2.2.1 Cường độ thoát hơi nước của khí khổng

Cường độ thoái hơi nước của khí khổng là một trong những tính trạng sinh lý của lá có liên quan chặt chẽ đến khả năng sử dụng nước của cơ thể thực vật khi cây gặp điều kiện khô hạn Khi cây gặp bất lợi về nước, cơ thể thực vật sẽ thực hiện quá trình chuyển đổi từ pha trung hòa nước, mà trong đó việc sử dụng nước ở trong cơ thể không tùy thuộc vào lượng nước ở bên ngoài, sang pha thứ cấp khi mà việc sử dụng nước sẽ liên quan trực tiếp đến lượng nước ở bên ngoài (Sinclair và đtg, 1986) [85] Quá trình chuyển hóa này liên quan đến việc giảm cường độ thoát hơi nước qua khí khổng ở lá và có thể xảy ra ở nhiều loài cây khác nhau trong các điều kiện khác nhau Cường độ thoát hơi nước là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự trao đổi khí và hơi nước ở lá Ảnh hưởng của hạn hán đến sự sinh trưởng của lá, cường độ thoát hơi nước và lượng nước ở trong cây được nghiên cứu khá chi tiết ở đậu tương Chúng ta biết rằng, hạn hán làm giảm tốc độ mở rộng của lá, cường độ thoát hơi nước của khí khổng và sức căng của lá Trong đó, nó làm tăng hàm lượng axit abscisic (ABA) ở lá

và xylem Nghiên cứu này cho thấy việc giảm cường độ thoát hơi nước của khí khổng xảy ra đồng thời với việc tăng hàm lượng ABA ở trong xylem và xảy ra trước khi có

những thay đổi về sức căng của lá Điều này chỉ ra rằng các tín hiệu hóa học ABA bắt nguồn từ rễ điều khiển hoạt động của khí khổng khi tính trạng thiếu nước tương đối ở trong đất xảy ra (Liu và đtg, 2003) [61] Sự khác nhau về mặt di truyền về khả năng duy trì khí khổng mở dưới điều kiện bất lợi về nước đã được nghiên cứu ở đậu tương Khi so sánh các loài cây họ đậu khác với cây đậu tương cho thấy, cây đậu xanh, đậu đen và đậu đũa có khả năng điều khiển sự đóng mở khí khổng tốt hơn khi cây bị mất nước Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh rất rõ ràng rằng cường độ thoát hơi nước của khí khổng giảm tỉ lệ thuận với sự mất nước ở cây đậu tương (Liu và đtg, 2005) [62] Khả năng điều khiển cường độ thoát hơi nước của khí khổng dưới điều kiện hạn là một đặc tính sinh lý tốt để phát hiện các giống đậu tương chịu hạn do các phương pháp đo đạc chính xác đã được phát triển Tuy nhiên, khả năng di truyền tính trạng này cũng là một yếu tố rất quan trọng cần được quan tâm

1.2.2.2 Cường độ thoát hơi nước của biểu bì

Đặc tính sinh lý thứ hai của lá cũng có thể được sử dụng để đánh giá và xác định khả năng chịu hạn và khả năng sinh trưởng của cây trồng trong điều kiện hạn đó

là cường độ thoát hơi nước của biểu bì của lá (Epidermal conductance) Cường độ thoát hơi nước tổng số của lá được tính bằng tổng của cường độ thoát hơi nước của khí khổng và của mặt biểu bì Khi khí khổng mở, quá trình thoát hơi nước của biểu bì thường không được tính đến khi tính toán cường độ thoát hơi nước tổng số của lá Tuy nhiên, khi lá bị thiếu nước hay bị bóng tối, trong các điều kiện này thì khí khổng thường đóng, thì hệ thống thoát hơi nước ở bề mặt biểu bì có thể vượt qua cả cường độ thoát hơi nước của khí khổng Trong những điều kiện thiếu nước nghiêm trọng khi khí khổng đóng hoàn toàn, cường độ thoát hơi nước của biểu bì được dùng để xác định lượng nước mất mát của mô lá Nhiều loại thực vật sống trong môi trường khô có cường độ thoát hơi nước của biểu bì rất thấp (Riederer và đtg, 2001) [77], và những loài cây trồng có cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp thường duy trì khả năng sống tốt và dài hơn trong những điều kiện khô hạn (Jovanovi và đtg, 1996) [52] Nghiên cứu trên 74 giống đậu tương thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau cho thấy

sự khác nhau đáng kể về cường độ thoát hơi nước của biểu bì ở các giống này và có quan hệ chặt chẽ với môi trường mà các giống nghiên cứu sinh sống Điều đang quan

tâm đó là sự khác nhau này không liên quan đến sự khác nhau về mật độ khí khổng ở

lá Những giống có cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp có thể cải thiện khả năng phát triển và sinh trưởng của lá ở những điều kiện bất lợi về nước, vì thế diện tích lá được duy trì đảm bảo sự sinh trưởng của cây sau khi bị hạn Nghiên cứu gần đây cho thấy mối tương quan nghịch (r = -0,74) giữa cường độ thoát hơi nước của biểu bì và hiệu quả sử dụng nước trong điều kiện hạn, kết quả này dẫn đến một giả thiết cho rằng cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp sẽ là một chỉ tiêu đáng tin cậy về tính chịu hạn (Hufstetler và đtg, 2007) [48] Giống đậu tương dại có cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp hơn hẳn so với các giống đậu tương canh tác Trong số các giống đậu tương được gieo trồng ngày nay, các giống ở khu vực nhiệt đới có cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp nhất và thế năng thẩm thấu nhỏ hơn so với các giống ở khu vực khí hậu ôn hòa, điều này có thể là do quá trình chọn lọc tự nhiên dưới các điều kiện môi trường (James và đtg, 2008a) [49] Nghiên cứu trên các quần thể lai cho thấy cường độ thoát hơi nước của biểu bì khác nhau một cách có ý nghĩa dao động từ 60 -93% (James và đtg, 2008b) [50] Như vậy tính trạng này có tính di truyền khá cao Tuy nhiên, để khẳng định tính hữu dụng của các tính trạng này trong việc tạo ra các giống đậu tương có tính kháng hạn cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để xác định mối quan hệ giữa cường độ thoát hơi nước của biểu bì, khả năng duy trì sức căng của lá và sức sống của cây

1.2.2.3 Mật độ lông tơ của lá

Hệ thống lông tơ của lá là một đặc điểm chung của các loài thực vật chịu hạn, cũng như một số loài cây trồng trong đó có đậu tương Trong điều kiện hạn thì đây là một trong những tính trạng thích nghi quan trọng của cây đậu tương Các dòng có mật

độ lông tơ cao có sức sinh trưởng sinh dưỡng tốt hơn, mật độ rễ nhiều hơn và rễ đâm sâu hơn Mật độ lông tơ của lá tăng lên làm tăng tính kháng ở các lớp bề mặt của lá lên tới 50% Nhiệt độ của lá giảm, sự mất nước bị giới hạn và quá trình quang hợp tăng lên do sự thâm nhập của phóng xạ thấp hơn cũng có liên quan đến mật độ lông tơ của

lá (Specht và đtg, 1985) [87] Hơn nữa, nếu hệ lông tơ càng dày đặc thì có thể làm giảm hiện tượng nhiễm bệnh gây ra bởi virus khảm đậu tương Tuy nhiên, mật độ lông

tơ được điều khiển bởi hai allen là Pd1 và Pd2, tăng lên sẽ tạo ra những hiệu ứng có lợi

và không có lợi về mặt nông học Đặc biệt, các allen này đã được chứng minh là làm giảm năng suất hạt, làm trễ quá trình chín và tăng chiều cao của cây đi kèm với làm tăng diện tích trồng (Specht và đtg, 1985) [87] Chính vì vậy, mối liên quan bất lợi giữa mật độ lông tơ của lá và năng suất hạt cần được xem xét trước khi đưa tính trạng này vào các dòng/giống đậu tương quý

1.2.2.4 Hiệu quả sử dụng nước

Hiệu quả sử dụng nước của cây được định nghĩa chung là lượng sinh khối tích lũy trên một đơn vị nước sử dụng Sự đa dạng về di truyền liên quan đến hiệu quả sử dụng được đã được nghiên cứu nhiều năm trên nhiều đối tượng cây trồng bao gồm cây đậu tương Hiệu quả sử dụng nước cao giúp cải thiện năng suất của cây trồng trong điều kiện hạn Mối tương quan thuận giữa hiệu quả sử dụng nước và năng suất sinh khối tổng số trong điều kiện hạn cho thấy việc cải thiện hiệu quả sử dụng nước của một cây trồng có thể dẫn tới năng suất cao nếu chỉ số thu hoạch được duy trì Giống đậu tương “Young” có hiệu quả sử dụng nước tương đối cao (4,4g dw/l) trong điều kiện nhà lưới Trong một nghiên cứu khác cho thấy giống đậu tương “Jackson” tích lũy sinh khối tốt hơn và lượng nitơ tổng số cao hơn các giống khác trong cùng điều kiện hạn nhân tạo Mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và năng suất trung bình là một bằng chứng cho thấy hiệu quả sử dụng nước của cây đậu tương có thể được cải thiện một cách đơn giản bằng cách chọn lọc cá thể mang kiểu gen có năng suất trung bình cao hơn Trong một nghiên cứu trên 24 giống đậu tương khác nhau, hiệu quả sử dụng nước dao động từ 2,7g trọng lượng khô/kg nước cho tới 3,4g trọng lượng khô/kg nước (Hufstetler và đtg, 2007) [48] Một giả thiết được đặt ra là khả năng mở khí khổng có thể được điều hòa theo các mức độ đóng của khí khổng tùy theo sự mất nước

ở đất có thể làm tăng hiệu quả sử dụng nước (Liu và đtg, 2005) [62] Mặc dù có nhiều kết quả khả quan đạt được theo hướng này nhưng vẫn còn nhiều điều không chắc chắn liên quan đến việc thực hiện các kỹ thuật tưới tiêu ở các loài cây trồng khác nhau ở các điều kiện môi trường khác nhau Do đó, những hiểu biết sâu sắc bản chất sinh lý quá trình điều hòa hoạt động khí khổng và để cải thiện hiệu quả sử dụng nước khi cây bị hạn là cần thiết

Một tính trạng liên quan đến hiệu quả sử dụng nước khác đó là hiệu quả thoát hơi, mà được định nghĩa là quá trình đồng hóa và tích lũy chất khô trên một đơn vị thoát hơi nước Quá trình thoát hơi nước được kiểm soát bởi yếu tố di truyền và loại bỏ lượng nước mất mát do sự bay hơi của đất, và do vậy cần phải được xem như là một tính trạng tiềm năng

1.2.3 Đáp ứng về phương diện hóa sinh của cây đậu tương trong điều kiện hạn

Một trong những đáp ứng về phương diện hóa sinh thường thấy ở thực vật khi cây gặp tình trạng khan hiếm về nước, đó là khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào Áp suất thẩm thấu được định nghĩa là sự tích lũy chủ động các chất trao đổi trong mô, thế bào của thực vật để duy trì sức căng của tế bào và mô khi lượng nước bên ngoài tế bào thụt giảm Áp suất thẩm thấu có thể duy trì cường độ thoát hơi nước của khí khổng và quá trình quang hợp trong các trường hợp thế năng nước thấp, làm chậm quá trình úa của lá, giảm quá trình héo hoa, kích thích rễ phát triển và tăng cường khả năng hút nước từ đất (Turner và đtg, 2001) [96] Ở cây đậu tương áp suất thẩm thấu của tế bào dao động từ 0,3 tới 1,0 Mpa, độ dao động ít hơn so với đậu cove

và đậu pigeon (Turner và đtg, 2001) [96] Trong số 6 loài đậu tương nghiên cứu thì áp suất thẩm thấu của lá đo được giao động từ 0,3 cho tới 0,5 Mpa trong điều kiện gây hạn thực nghiệm Trong một nghiên cứu gần đây các nhà khoa học đã thử đo đạc thế năng thẩm thấu ở lá của các giống đậu tương trồng và đậu tương dại Kết quả cho thấy thế năng thẩm thấu của lá trong điều kiện hàm lượng nước tương đối chỉ là 70% ở các giống đậu tương trồng dao động từ -2,3 cho tới -3,5 Mpa và ở các loài đậu tương dại là -4,3 Mpa Các nhà khoa học cũng đã xác định được mối tương quan rất có ý nghĩa (r = 0,98) giữa hàm lượng nước tương đối của lá và thế năng thẩm thấu tương đối trong số các giống đậu tương nghiên cứu, kết quả này chỉ ra rằng, đối với các giống có thế năng thẩm thấu cao hơn thì hàm lượng nước tương đối của lá giảm chậm hơn do đó khả năng duy trì sức căng của mô dài và mạnh hơn trong điều kiện hạn (James và đtg, 2008b) [50] Hầu hết các nghiên cứu được công bố về áp suất thẩm thấu ở các loài cây trồng chỉ được thực hiện đơn thuần bởi các đo đạc ở lá và chỉ rất ít các nghiên cứu đưa

ra được mối quan hệ giữa áp suất thẩm thấu và năng suất cây trồng Trên đối tượng cây lúa mì, đã chứng minh được tiềm năng và giá trị của áp suất thẩm thấu đối với

năng suất cây trồng, ở cây đậu răng ngựa thì mối quan hệ giữa áp suất thẩm thấu ở lá

và năng suất trong điều kiện giới hạn về nước lại không ổn định (Turner và đtg, 2001) [96] Nghiên cứu các dòng đậu răng ngựa thu thập từ các khu vực khác nhau trên thế giới đã chứng minh được rằng sự khác nhau về khả năng duy trì áp suất thẩm thấu ở loài cây này có khả năng di truyền, nhưng khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu lại không ổn định và khác nhau đối với mỗi vụ gieo trồng Thêm vào đó các nhà khoa học cũng nhận thấy rằng sự khác nhau về khả năng duy trì áp suất thẩm thấu không ảnh hưởng nhiều đến năng suất trong điều kiện hạn cục bộ hay khi gieo trồng trong điều kiện tưới tiêu đầy đủ Những kết quả này có thể bắt nguồn từ nguyên nhân là do tập tính sinh trưởng, mức độ hạn và các đặc tính của các giống nghiên cứu Ngoại trừ duy nhất mà các nhà khoa học tin rằng khả năng duy trì áp suất thẩm thấu giữ vai trò quan trọng, đó là khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của bộ rễ do ảnh hưởng đến sức căng của rễ sẽ giúp cho việc đâm sâu vào các lớp đất và vì vậy khả năng thu nhận nước sẽ được cải thiện hơn cho cây trong các điều kiện hạn Tính trạng này sẽ là một tính trạng đáng được quan tâm trong việc nâng cao khả năng chống chịu hạn của cây trong điều kiện bất lợi về nước Vấn đề chính gặp phải đối với việc chọn lọc các giống có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu đó là sự giới hạn về số lượng nguồn gen Mặc dù vậy, (Turner và đtg, 2001) [96] đã nhận định rằng sự phát triển các công cụ chỉ thị phân tử

ở lúa và lúa mì có thể ứng dụng với mục đích chọn lọc các giống có khả năng duy trì

áp suất thẩm thấu mạnh ở cây đậu tương

1.2.4 Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các

kỹ thuật di truyền làm tăng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi đã được ứng dụng rộng rãi trong cải thiện di truyền của một số giống cây trồng khác nhau Việc sử dụng các gen liên quan đến chống chịu đã được thiết kế chuyển vào hệ thống thực vật, cải thiện mức độ chống chịu các điều kiện bất lợi của một số giống cây trồng Gần đây các nghiên cứu đã phát hiện rằng sự tác động của tác nhân bất lợi có liên quan đến sự biểu hiện của một số gen chia làm 3 nhóm chính: (1) nhóm gen mã hóa protein chức năng liên quan trong trao đổi các chất gây áp suất thẩm thấu, các protein bảo vệ, … (2) nhóm nhân tố điều hòa sự phiên mã (transcription factors) và (3) nhóm nhân tố tín hiệu

(signaling factors) Ở thực vật khi bị thiếu hụt nước sẽ xảy ra sự hoạt hóa phosphoryl hóa các protein Có vài protein kinase đã được miêu tả như nhân tố truyền tín hiệu (signal transduction factor) liên quan đến phản ứng thẩm thấu ở thực vật Trong đó, SnRK2 (SNF1- related protein kinase 2) là protein kinase liên quan đến các phản ứng thích nghi với điều kiện bất lợi của môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA

(Umezawa và đtg, 2004 [97]; Hiroaki Fujii đtg, 2009) [40] Một số nghiên cứu cũng đã

chứng minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đến phản ứng điều kiện mất nước và siêu biểu hiện gen này có khả năng làm tăng khả năng chống chịu điều kiện khô hạn của cây trồng (Umezawa và đtg, 2004 [97])

Protein chịu nóng (Hsps) chịu nóng, muối và nhiệt độ cao, tích tụ nước, đóng vai trò quan trọng việc bảo vệ tế bào (Vierling và đtg, 1992 [99],Thomashow 1998 [94]) Hsps có 5 dòng: Hsp100, Hsp90, Hps 70, Hps 60 và sHps sHsps không chỉ được nhấn mạnh trong phản ứng với độ nóng, mà còn với nước, muối, quá trình oxihóa và nhiệt độ thấp (Sabehat và đtg, 1998 [78], Hamilton và đtg, 2001 [36]) sHsps và Hsps đóng vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng chống chịu trong điều kiện bất lợi của môi trường

Khi cây trồng gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như: nóng, lạnh, phèn, mặn, hạn, làm cho tế bào bị mất nước LEA (Late embryogenesis abundant protein) là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi, nó là một trong những nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nước của tế bào, nhóm gen mã hoá loại protein LEA còn đóng vai trò trong sự chịu khô hạn của hạt Khi hiện tượng mất nước xảy ra, gen LEA phiên mã một lượng lớn mARN và protein LEA được tổng hợp Ngoài ra LEA không những điều chỉnh quá trình mất nước sinh lí khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nước bắt buộc do các điều kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra (Trần Thị Phương Liên [13], Close T.J, 1997 [25], Porcel

R và đtg, 2005) [74] Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi axit absisis (ABA) và độ mất nước của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào Nhiều gen LEA đã được nghiên cứu, phân lập, xác định chức năng LEA được chia thành các nhóm sau: nhóm 2-D19, nhóm 2-D11 (còn gọi là dehydrin) (Close T.J.1997 [25]), nhóm 3-D7; nhóm 4-D113; nhóm5-D29; nhóm 6- D95 (Trần Thị Phương Liên và đtg, 1999 [13],

Close T.J, 1997 [25]) Khi điều kiện mất nước xảy ra, protein LEA được tổng hợp với

số lượng lớn, trong đó dehydrin có thể chiếm tới 1% tổng số protein hoà tan của hạt (Close T.J, 1997) [25]

P5CS (pyroline-5-carboxylase) là một trong những enzym chức năng, liên quan quá trình tổng hợp prolin, một chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điểu chỉnh

áp suất thẩm thấu khi cơ thể thực vật sống trong các điều kiện bất lợi như hạn, mặn (Kohl và đtg, 1988 [59]; Kavi Kishor và đtg, 1995 [55]; Peng và đtg, 1996 [73]; Hua

và đtg, 1997 [46]; Zhang và đtg, 1997 [104]; Delauney và Verma, 1993 [30]) Gen

nước ở một số loại cây trồng (Zhang và đtg, 1995 [103]; Hong và đtg, 2000 [42])

Tính chịu hạn là tính trạng đa gen, đòi hỏi những nghiên cứu tổng thể về mặt sinh

lý, hóa sinh kết hợp với sinh học phân tử, lập bản đồ gen dựa vào các chỉ thị phân tử đồng thời với việc phân lập các gen liên quan đến tính chịu hạn trên từng đối tượng cây, trong đó, việc nghiên cứu sâu hơn về protein liên quan đến tính chống chịu vẫn luôn cần thiết (Trần thị Phương Liên, 2010) [13]

1.3 PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYM P5CS TRONG CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP PROLIN

1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp prolin

Sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao có thể được thực hiện qua hai con đường hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine Prolin được tổng hợp từ glutamate được coi là một trong những chu trình sinh tổng hợp quan trọng nhất của cơ thể thực vật ở những điều kiện sinh lý nhất định, khi cây bị giới hạn về nguồn nitơ hay gặp phải những bất lợi về

áp suất thẩm thấu (Csonka và đtg, 1988) [26] Trong khi đó con đường sinh tổng hợp prolin thông qua ornithine thường xảy ra khi cây ở trong các điều kiện thừa nitơ (Delanuney và Verma, 1993) [30] Sinh tổng hợp prolin ở thực vật được minh họa tại hình 1.1

Hình 1.1 Chu trình sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao

(Delanuney và Verma, 1993) [30]

P5CS là enzym giữ hai chức năng, thứ nhất enzym hoạt hóa glutamate trở thành dạng hoạt động và thứ hai xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra pyrroline-5-carboxylate Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi enzym pyroline-5-carboxylate reductase để tạo prolin (Hu và đtg, 1992) [44]

Trong quá trình sinh tổng hợp gốc amin của ornithine có thể được chuyển thành glutamic semialdehyde bởi sự xúc tác của ornithine aminotransferase hoặc thành keto-aminovalerate bởi sự xúc tác của ornithine aminotransferase Theo con đường thứ nhất, glutamic semialdehyde sẽ được đóng vòng để tạo pyroline-5-carboxylate do hoạt tính của pyroline-5-carboxylate reductase Ở con đường thứ hai keto-aminovalerate được đóng vòng tạo pyroline-2-carboxylate do hoạt tính của pyroline-2-carboxylate reductase (Hình 1.1) Những phân tích về sự biểu hiện của ornithine aminotransferase

ở cây đậu cho thấy gen mã hóa cho enzym này biểu hiện rất yếu trong điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi, nhưng trong điều kiện thừa nitơ thì gen này biểu hiện rất mạnh (Armengaud và đtg, 2004) [20] Chính vì lý do này mà quá trình tổng hợp prolin

từ ornithine được cho là xảy ra trong các điều kiện thừa nitơ Mặc dù vậy, trong một

vài trường hợp đặc biệt như ở cây cỏ ngọt và lá non của cây Arabidopsis thì hàm

lượng mRNA của gen ornithine aminotransferase tăng lên rất mạnh ở các điều kiện bất

lợi về áp suất thẩm thấu Vì vậy, sự tích lũy prolin theo chu trình này cũng được coi là

có vai trò đối với tính chống chịu của cây khi gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu

1.3.2 Điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật

Mặc dù quá trình trao đổi prolin ở thực vật đã được nghiên cứu trên 40 năm, nhưng kiến thức về cơ chế điều hòa quá trình này còn rất hạn chế Hình 1.2 mô tả cơ chế và các tác nhân có vai trò trong quá trình điều hòa trao đổi prolin ở thực vật Quá trình sinh tổng hợp prolin được hoạt hóa và quá trình dị hóa prolin bị hạn chế khi cây

bị xử lý bởi hạn, trong khi đó cung cấp nước trở lại cho cây thì các quá trình này sẽ hoạt động theo hướng ngược lại

Hình 1.2 Cơ chế và các tác nhân điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật

(Szabados và đtg, 2009) [89]

Ở thực vật, quá trình sinh tổng hợp prolin được kiểm soát bởi hoạt tính của hai gen mã hóa cho enzym P5CS Hai gen này có độ tương đồng rất cao về trình tự mã hóa nhưng biểu hiện lại rất khác nhau trong những điều kiện khác nhau Ở cây

Arabidopsis, gen P5CS2 là một gen “giữ nhà” (housekeeping), hoạt động của gen này

chủ yếu ở các mô phân sinh như đầu rễ và đỉnh chồi, ở hoa và các tế bào nuôi cấy

(Székely và đtg, 2008) [90] Cả hai gen P5CS đều hoạt động ở các mô phân sinh của

hoa, chủ yếu để cung cấp prolin cho quá trình phát triển của hoa (Mattioli và đtg,

2009) [65] Gen P5CS1 của cây Arabidopsis hoạt động rất mạnh và được cảm ứng bởi

các yếu tố bất lợi về thẩm thấu, mặn và nó cũng được hoạt hóa bởi axit abscisic Ngoài

ra, hoạt động của gen này và sự tích lũy prolin cũng bị kích thích bởi ánh sáng và bị ức chế bởi các hợp chất brassinosteroid Trong điều kiện bình thường, enzym phospholip

D (PLD) giữ chức năng như một chất điều hòa quá trình tích lũy prolin, trong khi đó

calcium và phospholipase C (PLC) kích thích quá trình phiên mã gen P5CS và sự tích lũy prolin khi cây bị bất lợi về mặn Ở loài cây chịu mặn Thellungiella halophila, PLD

lại là một chất điều hòa có tác dụng kích thích và PLC được cho là chất điều hòa có tác dụng bất hoạt sự tích lũy prolin trong tế bào Calcium có chức năng như một chất truyền tín hiệu tương tác với nhân tố phiên mã MYB2 để hoạt hóa sự phiên mã của

gen P5CS1

Tương tự như cơ chế điều hòa quá trình trao đổi prolin thông qua điều hòa sự phiên mã các gen P5CS, hoạt tính của enzym P5CS cũng được kiểm soát bởi quá trình trao đổi Một trong những ví dụ điển hình đó là sự ức chế ngược hoạt tính P5CS bởi prolin (Zhang và đtg, 1995) [103] Khi enzym P5CS không bị ức chế bởi prolin thì sự tích lũy axit amin này sẽ tăng rất mạnh trong tế bào Quá trình chuyển hóa P5C thành prolin không phải là bước giới hạn trong chu trình sinh tổng hợp prolin, chính vì vậy

sự điều hòa hoạt tính enzym P5CR cho thấy sự phức tạp trong cơ chế điều hòa sự

phiên mã của gen này Khi phân tích promoter của gen P5CR ở cây Arabidopsis đã xác

định được một đoạn trình tự có chiều dài 69 nucleotid qui định hoạt động đặc hiệu mô của gen (Hua và đtg, 1999) [45] Tuy nhiên, các nhân tố tác động dạng trans liên kết với đoạn trình tự cho đến nay vẫn chưa được xác định

Trong khi quá trình sinh tổng hợp prolin bị kích hoạt bởi ánh sáng và các yếu tố bất lợi về áp suất thẩm thấu thì quá trình dị hóa prolin lại được hoạt hóa trong điều kiện không có ánh sáng và trong quá trình cây gặp các tác động bất lợi từ môi trường Quá trình này được kiểm soát bởi hai enzym là PDH và P5CDH (Hình 1.2) Quá trình phiên mã của gen PDH được hoạt hóa bởi prolin và khi cây được cung cấp đủ nước sau khi bị hạn, nhưng sự phiên mã của gen lại bị ức chế khi cây gặp điều kiện hạn do

đó đảm bảo prolin không bị phân giải khi cơ thể gặp các điều kiện bất lợi từ môi trường Sự phiên mã của gen PDH1 bị ức chế vào ban ngày và được hoạt hóa vào buổi

tối do đó hoạt động của gen ngược với hoạt động của gen P5CS1 Phân tích promoter

của gen PDH1 đã xác định được nhân tố cảm ứng với trạng thái thẩm thấu và prolin,

và nhân tố giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình hoạt hóa của gen (Satoh và đtg, 2002) [83] Yếu tố phiên mã liên kết với nhân tố trên là họ protein giàu leucine

(Leucine Zipper Protein) Phân tích hoạt động của gen P5CDH cho thấy gen biểu hiện rất yếu ở các mô của cây Arabidopsis và biểu hiện của gen tăng lên khi bổ sung prolin Trên promoter của gen phân lập từ Arabidopsis và lúa, các nhà khoa học cũng xác định

được các nhân tố tương tự trên promoter của gen PDH1 Hoạt động của gen FIS1 mã hóa cho enzym P5CDH ở cây lanh bị hoạt hóa khi cây bị nhiễm virus và bị tổn thương Kết quả phân tích cơ chế điều hòa hậu phiên mã (post-transcription) cho thấy các đoạn đối mã tồn tại trong tự nhiên của gen P5CDH tạo ra các cấu trúc ức chế RNA nhỏ

(small interfering RNA) hoạt hóa cho quá trình cắt các phân tử RNA của gen P5CDH,

do vậy làm giảm mức độ phiên mã của gen khi cây gặp các điều kiện bất lợi từ môi trường Kết quả này cho thấy cơ chế ức chế hoạt động của gen ở mức độ hậu phiên mã

là rất quan trọng trong việc điều khiển hoạt động của gen P5CDH ở thực vật (Borsani

và đtg, 2005) [24]

1.3.3 Vai trò của sự tích lũy prolin đối với tính chống chịu của cây

Prolin được xem là một chất thẩm thấu có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội bào

và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu Tuy nhiên,

sự tích lũy prolin có thể ảnh hưởng đến tính chống chịu của cơ thể thực vật theo nhiều con đường khác nhau Hình 1.3 khái quát các vai trò của prolin đối với tính chống chịu

ở thực vật

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả vai trò của prolin đối với tính chống chịu của cây

(Szabados và đtg, 2009) [89]

Prolin có vai trò như là một chất định hình phân tử (molecular chaperone) trong việc bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của nhiều loại enzym khác nhau Các ví dụ điển hình có thể kể đến đó là khả năng ổn định hoạt tính của M4 lactate dehydrogenase khi có các tác động bất lợi về nhiệt độ xảy ra; bảo vệ nitrate reductase khi tế bào gặp các tác động bất lợi về áp suất thẩm thấu và kim loại nặng; ổn định hoạt động của các ribonuclease và protease trong điều kiện nồng độ arsen ngoài môi trường tăng cao Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò của prolin như một chất chống oxy hóa với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng (reactive oxygen residues) và bất hoạt các gốc oxy tự do (singlet oxygen quencher) (Matysik và đtg, 2002) [66] Khi xử

lý các tế bào nấm men bằng prolin cho thấy hàm lượng các gốc oxy phản ứng giảm, do

đó làm chậm quá trình gây chết tế bào theo chương trình (programmed cell death) Đối với các tế bào người, prolin có thể ngăn ngừa tác động của các chất có khả năng gây ung thư, trong khi đó đối với các tế bào tảo nuôi cấy ở các điều kiện có nồng độ kim loại cao thì prolin có thể làm giảm quá trình phân giải các hợp chất béo Dẫn chứng trên cây lúa cho thấy, prolin làm giảm độc tính của thủy ngân thông qua quá trình phân cắt các gốc oxy phản ứng như hydro peroxide Hiệu ứng phá hủy của các gốc oxy tự do đối với hệ thống quang hóa II có thể bị ức chế bởi prolin khi nghiên cứu trên hệ màng thylakoid Tác động của tia phóng xạ đến các tế bào tảo và cây thuốc lá chuyển gen tăng cường tích lũy prolin cũng bị giảm thiểu khá mạnh (Szavados và đtg, 2009) [89]

Sự tích lũy prolin đã được chứng minh là có tính đặc hiệu loài, tuy nhiên liệu sự khác nhau này có liên quan đến tính thích ứng của mỗi loài hay không vẫn còn là câu

hỏi mở đối với các nhà khoa học Ở hai loài cây chịu mặn có họ hàng với Arabidopsis

là Thellungiella halophila và Lepidium crassifolium, tích lũy prolin mạnh hơn hẳn so với Arabidopsis ở trong điều kiện mặn Sự tích lũy prolin của cây Thellungiella là kết quả của sự tăng cường hoạt động của gen P5CS và giảm hoạt động của gen PDH (Taji

và đtg, 2004) [92] Hàm lượng prolin cao có thể cải thiện tính chịu mặn ở loài cây ưa

mặn Pancratium maritimum thông qua khả năng ổn định hoạt động của nhiều enzym

khử độc và của bộ máy luân chuyển protein và kích thích sự tích lũy các protein có

chức năng bảo vệ Hàm lượng prolin ở các loài cây ưa mặn khác như Camphorosma

annua và Limonium spp không cao nhưng thay vào đó ở các loài này lại tích lũy mạnh

nhiều chất thẩm thấu khác như các loại carbohydrate hay các chất tổng hợp từ betain (Murakeozy và đtg, 2003) [67] Những nghiên cứu trên đây cho thấy, sự tích lũy prolin thường đi kèm với những đặc tính chống chịu ở các loài cây; vì thế có thể cho rằng, quá trình này là để giúp tăng cường tính chống chịu, tuy nhiên đây lại không phải là một yếu tố quá cần thiết cho sự thích ứng của các loài thực vật khác nhau đối với các điều kiện khắc nghiệt từ môi trường (Szabados và đtg, 2009) [89]

1.3.4 Vai trò của enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase đối với tính chống chịu của cây trồng

Thuốc lá là cây trồng đầu tiên được chuyển gen P5CS phân lập từ cây nho được

điều khiển bởi promoter 35S Phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen này cho thấy: hoạt động của enzym P5CS rất mạnh và hàm lượng prolin tích lũy tăng lên từ 10-18 lần so với cây đối chứng không chuyển gen Tăng cường tích lũy prolin ở các dòng thuốc lá này còn kích thích sự phát triển của sinh khối rễ khi cây bị xử lý mặn trong các điều kiện thí nghiệm tại nhà lưới Do hàm lượng prolin tăng lên rất mạnh ở các dòng chuyển gen nên kết quả này cho thấy hoạt tính của enzym P5CS giữ vai trò quyết định tới quá trình sinh tổng hợp prolin ở cây Đặc biệt hơn, khi bổ sung thêm nitơ vào môi trường nuôi cấy các dòng thuốc lá này thì hàm lượng prolin tăng lên đáng kể so với dòng thuốc lá chuyển gen không được bổ sung nitơ Những nghiên cứu ở enzym P5CS tinh sạch từ cây đậu xanh cũng cho thấy, enzym này bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng

ức chế ngược bởi prolin và hoạt tính của enzym này giảm tới 50% khi bổ sung 50mM prolin ngoại bào Bên cạnh đó, nitơ đóng vai trò như là cơ chất và cũng là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi prolin và cũng giữ chức năng điều hòa hoạt động của

prolin Nghiên cứu trên cây Arabidopsis, các nhà khoa học đã chứng minh được mối

quan hệ chặt chẽ giữa hoạt động của enzym P5CS và sự tích lũy prolin trong điều kiện cây bị xử lý mặn; và hiệu ứng ức chế ngược của prolin tới hoạt tính của P5CS cũng bị ảnh hưởng trong các điều kiện bất lợi này Khi chuyển gen P5CS đã bị gây đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược bởi prolin vào cây thuốc lá, các nhà khoa học đã nhận

ra rằng các dòng thuốc lá chuyển gen này tăng cường tích lũy prolin nhiều hơn gấp 2

lần so với các dòng thuốc lá được chuyển gen P5CS kiểu dại Thêm vào đó, khi xử lý

các dòng chuyển gen này với 200mM NaCl thì kích thích sự tích lũy prolin (Hong và

đtg, 2000) [42] Những kết quả này là những dẫn chứng rất rõ ràng rằng hiệu ứng ức chế ngược của enzym P5CS bởi prolin giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp prolin trong cả điều kiện bình thường và khi cây gặp phải các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu Ở các loài thực vật tổng hợp mạnh prolin thì cây có tính chống chịu tốt hơn so với các loài thực vật khác trong các điều kiện hạn, mặn… Ví dụ

cây lúa chuyển gen P5CS phân lập từ cây đậu có tính kháng mặn tốt hơn hẳn các dòng

lúa đối chứng không chuyển gen Tương tự như vậy, khi các nhà khoa học tiến hành

chuyển trực tiếp gen P5CS vào hạt phấn của của cây lúa mì và tiến hành kiểm tra tính

kháng trong điều kiện mặn thì cũng cho thấy các kết quả tương tự như ở cây lúa Ở cây

cà rốt khi được chuyển gen P5CS các dòng cà rốt có tính kháng muối cao hơn tới 6 lần

so với dòng đối chứng Những kết quả này không chỉ được chứng minh ở thực vật bậc

cao mà còn cả ở loài vi tảo Chlamydomonas reinhardtii khi được chuyển gen P5CS

Các dòng vi tảo chuyển gen tích lũy prolin cao hơn 80% so với các dòng không chuyển gen Những dòng chuyển gen này sinh trưởng nhanh hơn trong môi trường có chứa 100 micromole cadmium và khả năng tích lũy cadmium cao hơn tới 4 lần so với

dòng đối chứng Gần đây, gen P5CS được phân lập thành công từ cây lúa và khi được

chuyển trở lại lúa nhằm tăng cường hoạt động của gen này các nhà khoa học đã nhận

thấy rằng tính chịu mặn và chịu lạnh được cải thiện rõ rệt Promoter của gen P5CS cũng được nghiên cứu khá chi tiết ở cây Arabidopsis chuyển gen trong điều kiện hạn

(Kishor và đtg, 2005) [57] Bảng 1.5 trích dẫn những loài thực vật đã được chuyển gen

P5CS và các đặc điểm quan tâm được cải thiện

Bản chất tính kháng muối cũng được các nhà khoa học nghiên cứu trên đối

tượng cây thuốc lá Nicotinana plumbaginifolia đột biến bằng phương pháp sử dụng

đồng vị phóng xạ của carbon Các nhà khoa học sgử dụng glutamate mang ion carbon

13 làm cơ chất cho sự tổng hợp prolin Trong điều kiện mặn, các dòng đột biến tích lũy prolin mạnh hơn các dòng kiểu dại Nghiên cứu chỉ ra, rằng hoạt tính của các enzym trong chu trình sinh tổng hợp prolin từ ornithine và quá trình dị hóa prolin không bị ảnh hưởng và enzym P5CS cũng không bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng ức chế ngược bởi prolin do đột biến ở các dòng thuốc lá này

Bảng 1.5 Cây chuyển gen P5CS

Tên loài Kiểu hình của cây chuyển gen

trong điều kiện muối

tổng hợp prolin nhiều gấp 2 lần

Arabidopsis Cây chuyển gen đối mã cho thấy cây dễ bị hạn và hình

thái cây không bình thường trong điều kiện nuôi cấy bình thường

lợi về áp suất thẩm thấu

Chlamydomonas Dòng chuyển gen tích lũy nhiều prolin hơn tới 80% và

chống chịu kim loại nặng tốt hơn

(Kishor và đtg, 2005) [57]

1.4 PROMOTER VÀ VAI TRÒ ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CỦA GEN TRONG ĐIỀU KIỆN KHÔ HẠN

1.4.1 Cấu trúc và chức năng của promoter

Promoter là vùng DNA trong gen của sinh vật có chức năng khởi đầu quá trình phiên mã của gen Tận dụng chức năng tự nhiên của promoter, các nhà khoa học có thể điều khiển hoạt động của các gen một cách có chủ đích ở các cá thể Ở

các loài sinh vật nhân thực, cấu trúc của một promoter bao gồm các thành phần

chính như sau: Phần lõi (Core) promoter

• Vị trí khởi đầu phiên mã (TSS)

− Vị trí khoảng -35

nhỏ (small nuclear RNA)

RNA nhỏ khác

• Ví trí bám của các nhân tố phiên mã

• Phần cận biên (Proximal) promoter

− Vị trí khoảng -250

• Phần ngoại biên (Distal) promoter

− Ví trí xa hơn ở phía thượng nguồn (upstream) (ngoại trừ enhancer hoặc

các vùng điều hòa không phụ thuộc vị trí và chiều)

Promoter là nhân tố quan trọng phối hợp với enhancer, silencer, nhân tố liên kết trong việc quyết định mức độ biểu hiện của một gen nhất định [108]

1.4.2 Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học

Promoter của sinh vật nhân thực thường rất đa hình và khó xác định Chúng có thể nằm cách điểm khởi đầu phiên mã vài kilobase Người ta thường tìm thấy hộp TATA trong nhiều promoter của sinh vật nhân thực Các liên kết giữa protein với hộp TATA có tác dụng hỗ trợ việc hình thành phức hệ phiên mã của RNA polymerase Hộp TATA thường nằm khá gần vị trí khởi đầu phiên mã (trong khoảng 50 base) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005) [7]

Trình tự điều hòa promoter của sinh vật nhân thực thường liên kết với các protein gọi là nhân tố phiên mã

Những nghiên cứu về promoter đã giúp các nhà khoa học tìm ra các hướng mới nhằm điều khiển sự hoạt động của gen Việc đi sâu vào nghiên cứu cấu trúc, chức năng

và các yếu tố liên quan của promoter đã cho thấy khả năng thay đổi sự biểu hiện gen trong sinh vật cũng như các gen quan tâm bằng việc sử dụng cấu trúc (Promoter + Gen) Do đó promoter được coi như là một nhân tố rất quan trọng trong việc kiểm soát quá trình biểu hiện của gen (Goicoechea và đtg, 2005) [34], (Sambrook và đtg, 1989) [81] (Xu và đtg, 2004) [101]

Phân loại các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học phụ thuộc vào từng loại gen cụ thể Các loại promoter này bao gồm:

Nhóm các promoter biểu hiện toàn phần: Những promoter này điều khiển hoạt

động của gen quan tâm ở tất cả các mô và tế bào Sự biểu hiện của các gen quan tâm này hoàn toàn không phụ thuộc vào các yếu tố tác động từ bên ngoài như môi trường… Chính vì những ưu điểm này nên các loại promoter thuộc nhóm này thường được dùng với phổ rất rộng ở các loài và các giới thực vật khác nhau

Nhóm các promoter biểu hiện đặc hiệu mô hoặc ở các giai đoạn phát triển: Khác

với nhóm trên, các loại promoter thuộc nhóm này sẽ điều khiển sự biểu hiện các gen quan tâm ở các mô nhất định trong cơ thể thực vật hoặc ở các giai đoạn phát triển nhất định của cây Ở thực vật, hoạt động của promoter ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen ở các loại mô quan tâm bao gồm hệ thống bó mạch, các mô liên quan đến quá trình quang hợp, ở các cơ quan dự trữ như củ hay hạt và ở các cơ quan sinh sản như hoa đối với những trường hợp khác loài (thông thường được áp dụng cho các loài có quan hệ họ hàng xa)… Tuy nhiên sự biểu hiện đặc hiệu chỉ thường đạt được đối với các promoter được phân lập từ các đối tượng nghiên cứu có quan hệ họ hàng gần như

cùng loài, chi hoặc họ Điều này có thể là do tương tác của các yếu tố phiên mã đến sự điều hòa hoạt động của các promoter (Hai và đtg, 2003 [35], (Hawkins và đtg, 1997) [37]

Nhóm các promoter cảm ứng: Điểm khác biệt của các promoter thuộc nhóm này là

hoạt động của chúng không phụ thuộc vào các nhân tố nội sinh nhưng lại phụ thuộc vào các yếu tố từ môi trường bên ngoài hay các yếu tố kích thích nhân tạo Trong nhóm này, hoạt động của nhiều promoter được kích hoạt bởi các nhân tố sinh học như ánh sáng, nồng độ oxy, nhiệt độ và các yếu tố gây tổn thương Bên cạnh đó, các loại