CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SẢN PHẨM CHẨN ĐOÁN _ Đề tài tiểu luận: CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM QUE THỬ

CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SẢN PHẨM CHẨN ĐOÁN Đề tài tiểu luận: CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM QUE THỬ Miếng thấm mẫu: khu vực mẫu rơi xuống Miếng cộng hợp: các vật liệu khác nhau (hạt nano vàng, liposome, carbon,…) được liên kết với kháng nguyên hoặc kháng thể Màng phản ứng: thường là màng nitrocellulose: có chứa vạch kiểm tra và vạch kiểm soát Miếng thấm hút: làm sạch thuốc thử dư thừa và ngăn chặn sự chảy ngược của chất lỏng 1.1. Màng Nitrocellulose (NC) Được coi là yếu tố quan trọng nhất, NC là vật liệu được dùng phổ biến nhất Các thông số quan trọng đặc trưng cho 1 vật liệu màng tốt là lực mao dẫn, tính dễ liên kết và cố định của các protein. Có các loại kích thước lỗ xốp nitrocellulose từ 0,05 đến 12 μm (nhưng được phân bố ko đều do quá trình sản xuất), nên thường dựa vào thời gian chảy của mao quan để lựa chọn vật liệu màng phù hợp. Thời gian chảy của mao quản là thời gian cần thiết để chất lỏng đi đến và lấp đầy hoàn toàn dải màng. Ví dụ: NC 140: 140s chạy hết 4cm màng Liên kết giữa màng và kháng thể: liên kết tĩnh điện và liên kết kỵ nước

Miếng thấm mẫu

Miếng cộng hợp

Màng Nitrocellulose Miếng thấm hút

Vạch Kiểm tra

Vạch đối chứng

Thanh

nhựa đỡ

CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SẢN PHẨM CHẨN ĐOÁN

Đề tài tiểu luận: CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO SINH PHẨM QUE THỬ

1 Cấu tạo

Hình 1: Cấu tạo cơ bản của que thử

- Miếng thấm mẫu: khu vực mẫu rơi xuống

- Miếng cộng hợp: các vật liệu khác nhau (hạt nano vàng, liposome, carbon,…)

được liên kết với kháng nguyên hoặc kháng thể

- Màng phản ứng: thường là màng nitrocellulose: có chứa vạch kiểm tra và vạch

kiểm soát

- Miếng thấm hút: làm sạch thuốc thử dư thừa và ngăn chặn sự chảy ngược của

chất lỏng

1.1 Màng Nitrocellulose (NC)

- Được coi là yếu tố quan trọng nhất, NC là vật liệu được dùng phổ biến nhất

- Các thông số quan trọng đặc trưng cho 1 vật liệu màng tốt là lực mao dẫn, tính dễ liên kết và cố định của các protein

- Có các loại kích thước lỗ xốp nitrocellulose từ 0,05 đến 12 μm (nhưng được phân

bố ko đều do quá trình sản xuất), nên thường dựa vào thời gian chảy của mao quan để lựa chọn vật liệu màng phù hợp Thời gian chảy của mao quản là thời gian cần thiết để chất lỏng đi đến và lấp đầy hoàn toàn dải màng Ví dụ: NC 140: 140s chạy hết 4cm màng

- Liên kết giữa màng và kháng thể: liên kết tĩnh điện và liên kết kỵ nước

Bảng 1: Một số ví dụ về màng có sẵn từ các nhà sản xuất liên quan đến các đặc tính màng khác nhau

1.2 Miếng thấm mẫu:

- Thường được làm bằng cellulose acetate hoặc sợi thủy tinh vì màng cellulose acetate cho thấy ái lực thấp đối với protein và màng sợi thủy tinh cho thấy không có ái lực với protein

-  Đệm mẫu thường được ngâm tẩm với muối đệm, protein, chất hoạt động bề mặt

và các chất lỏng khác để kiểm soát tốc độ dòng chảy của mẫu và để phù hợp với sự tương tác với hệ thống phát hiện Hơn nữa, các lỗ xốp của miếng đệm mẫu có thể hoạt động như một bộ lọc để loại bỏ các vật liệu dư thừa, ví dụ như các tế bào hồng cầu

Hình 2:

1.3 Miếng cộng hợp (conjugate pad)

- Miếng cộng hợp (conjugate pad) là một thành phần rất quan trọng của que thử, nó được đặt ở vị trí cầu nối giữa miếng thấm mẫu và màng nitrocellulose được sử dụng để

cố định cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng Vật liệu làm miếng cộng hợp phải đảm bảo các yêu cầu sau: không làm hỏng hay làm bất hoạt kháng thể, không làm thay đổi liên kết cộng hợp khi sấy khô, có độ thấm ướt phù hợp và ổn định đặc điểm dòng chảy, có khả năng nhả phức cộng hợp kháng thể-hạt nano vàng hoàn toàn

- Miếng cộng hợp có ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử Các vật liệu thường dùng để làm miếng cộng hợp bao gồm: sợi thủy tinh, sợi cellulose, polyester và polypropylene được đặc trưng bởi kích thước lỗ màng, độ dày và trọng lượng

1.4 Hạt nano vàng

1.4.1 Đặc điểm

Hình 3: Hình ảnh hạt vàng chụp bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

- Ưu điểm: tính ổn định hóa học cao, diện tích riêng lớn, dễ tổng hợp, chi phí thấp

và các bước chuẩn bị dễ dàng Các đặc tính này làm cho thời gian phân tích ngắn và cung cấp phân tích đáng tin cậy tại chỗ

- Hình dạng, kích thước và độ ổn định của AuNPs là những thông số quan trọng ảnh hưởng đến sự thành công của LFA Kích thước và màu sắc của AuNPs phụ thuộc vào lượng natri citrat được sử dụng để khử vàng AuNPs có đường kính nhỏ hơn 15 nm nhỏ

để tạo ra màu sắc mạnh; tuy nhiên, vàng keo nano có đường kính 20 nm được sử dụng làm thuốc thử dò Các AuNP có đường kính lớn hơn 60–70 nm tự kết tụ dễ dàng và không ổn định

- Liên kết giữa hạt vàng và kháng thể: tương tác không cộng hóa trị, chẳng hạn

như lực London-Van der Waals và các tương tác kỵ nước

- 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất cộng hợp KT lên hạt vàng là pH và lượng kháng thể.

1.4.2 Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng

Hiện nay, hai phương pháp cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng là liên kết không cộng hóa trị (hấp phụ) và liên kết cộng hóa trị với những ưu nhược điểm riêng:

- Hấp phụ vật lý: kháng thể được hấp phụ lên bề mặt hạt nano vàng nhờ các tương

tác vật lý gồm: tương tác kỵ nước, tương tác ion và lực Van der Waals Liên kết này có

độ bền không cao do kháng thể hấp phụ lên bề mặt của các hạt nano vàng thông qua lớp citrate, phụ thuộc rất lớn vào pH, áp suất, nhiệt độ, điều kiện khuấy trộn, … và có khả năng nhả hấp phụ nếu các điều kiện môi trường không được duy trì ổn định Tuy nhiên, thao tác tạo cộng hợp lại khá đơn giản và ít tốn kém, dễ dàng điều khiển

- Liên kết cộng hóa trị: Ở phương pháp này, kháng thể gắn lên bề mặt vàng bằng

liên kết cộng hóa trị Để làm được việc đó, các hạt nano vàng được gắn sẵn lớp polyethylene glycol (PEG) với đầu hướng ra ngoài là nhóm cacboxyl Nhóm này sau khi được xúc tác bởi tác nhân EDC/NHS sẽ hình thành liên kết cộng hóa trị với kháng thể Đây là liên kết bền vững, khó bị phá vỡ Tuy nhiên, cần nhiều hóa chất và thời gian hơn

1.5 Một số vật liệu thay thế hạt nano vàng

Hình 4:

1.5.1 Ống nano carbon và hạt nano carbon

Diện tích bề mặt lớn và các tính năng điện và quang học tốt làm cho chúng trở thành vật liệu hỗ trợ thích hợp trong cảm biến sinh học và vật liệu tín hiệu trong dải sắc ký miễn dịch Các hạt nano carbon cho thấy cường độ màu cao hơn các hạt vàng trên dải sắc

ký miễn dịch

Các ưu điểm khác là chi phí rất thấp, dễ dàng chuẩn bị và sự ổn định của các liên hợp

Bảng 2: Một số nghiên cứu sử dụng ống carbon hoặc hạt nano carbon

1.5.2 Các vật liệu nano khác

Các vật liệu được dùng để thay thế khác như hạt nano silika, hạt latex, hạt nano platinium, hạt nano seradyn, các hạt nano lưỡng kim platinium-vàng

Các hạt nano phát quang: chấm lượng tử, Lanthanide

1.6 Miếng thấm hút:

Miếng thấm hút liên kết với màng ở vị trí cuối cùng trong que thử, có chức năng chính

là tăng tổng thể tích mẫu vào que thử, đồng thời tham gia vào việc duy trì tốc độ dòng chảy của chất lỏng qua màng, không cho dòng chảy quay ngược trở lại Do tổng thể tích mẫu tạo thành tín hiệu được điều khiển bởi thể tích hòa tan các hạt đánh dấu ở vạch kiểm tra và vạch đối chứng, chứ không phải thể tích mẫu đi vào que thử nên các miếng thấm hút tác động rất ít đến độ nhạy của phép thử Vật liệu làm miếng thấm hút được đặc trưng bởi các thông số kỹ thuật là: kích thước, độ bền cơ học, độ dày …

1.7 Một số dạng que

(2) (3) (4) (5) (6) (7)

Hình 5: Dạng cơ bản của que thử (A) Dòng chảy ngang; Que nhúng (B) cộng hợp

trong ống epp và (B’) cộng hợp trên que

2 Nguyên lý của xét nghiệm dòng chảy bên dựa trên kháng thể

- Kháng thể chính: liên kết cụ thể với một số kháng nguyên nhất định của nó: vạch

kiểm tra

- Kháng thể thứ cấp: Kháng thể liên kết với kháng nguyên chứa kháng thể, hoặc 1

kháng thể khác: Vạch kiểm soát

- Có 2 dạng: dạng sandwich và dạng cạnh tranh

2.1 Định dạng sandwich (hình a)

- 3 kháng thể khác nhau được sử dụng:

 Kháng thể 1: đặc hiệu cho Epitope 1 của kháng nguyên mẫu, được ghép với hạt nano vàng (hoặc hạt nano carbn,…) và cố định trên miếng cộng hợp

 Kháng thể 2: được gọi là kháng thể phát hiện, đặc hiệu cho vị trí Epitope thứ 2 của kháng nguyên mẫu, được làm khô trên màng tại vạch kiểm tra

 Kháng thể 3: một loại kháng thể kháng globulin miễn dịch đặc hiệu cho loài, được

cố định trên màng tại vạch kiểm soát và tương tác với kháng thể 1

(B’)

- Khi dung dịch mẫu có kháng nguyên đích được thêm vào miếng đệm mẫu, chất phân tích đích và kháng thể 1 sẽ tạo thành 1 phức hợp trong miếng đệm liên hợp và di chuyển đến đệm hấp phụ nhờ lực mao dẫn Liên hợp kháng thể đánh dấu chất phân tích đích phản ứng với kháng thể phát hiện trên đường thử nghiệm và một bánh sandwich được hình thành Kháng thể được gắn nhãn, không chứa chất phân tích vượt quá vạch thử nghiệm, được liên kết với kháng thể 3 và tạo thành vạch kiểm soát Khi có chất phân tích trong mẫu, hai vạch đỏ sẽ xuất hiện ở vạch kiểm tra và vạch chứng, và nếu không có chất phân tích trong mẫu

- Thường dùng trong thử nghiệm phát hiện các chất phân tích lớn, có nhiều vị trí kháng nguyên

2.2 Định dạng cạnh tranh của thử nghiệm dòng chảy bên (hình b)

- Để thử nghiệm các chất phân tích nhỏ, có trọng lượng phân tử thấp hơn và các chất quyết định kháng nguyên đơn lẻ Các phân tử nhỏ không thể liên kết đồng thời với hai kháng thể

- Hai kháng thể khác nhau được sử dụng trong định dạng này

 Kháng thể 1, đặc hiệu cho kháng nguyên mẫu, được ghép với hạt nano (vàng, carbon,…)

 Kháng thể 2 là một loại globulin chống miễn dịch đặc hiệu cho loài được làm khô trên vạch đối chứng

- Liên hợp phân tử mang kháng nguyên (thường là albumin huyết thanh bò (BSA)) được cố định trên màng tại vạch thử nghiệm

- Khi có chất phân tích trong mẫu, một vạch đỏ sẽ xuất hiện ở vạch kiểm soát, và khi không có chất phân tích trong mẫu, hai vạch đỏ sẽ xuất hiện ở vạch kiểm tra và đối chứng

- Định dạng cạnh tranh có hai cách sắp xếp

 Trong sự sắp xếp đầu tiên, chất phân tích đích được gắn với các hạt nano và gắn vào miếng đệm liên hợp Đối với mẫu âm tính, chất phân tích được đánh dấu di chuyển qua dải và liên kết với kháng thể sơ cấp trên vạch thử nghiệm và kháng thể thứ cấp trên

vạch chứng Màu đỏ được giám sát trên cả đường thử nghiệm và đường kiểm soát Đối với mẫu dương tính, chất phân tích không dán nhãn trong mẫu và chất phân tích được dán nhãn sẽ cạnh tranh và chất phân tích không dán nhãn liên kết với đường thử nghiệm Chất phân tích được gắn nhãn liên kết với kháng thể thứ cấp trong dòng đối chứng Chỉ có đường màu đỏ được hình thành trên đường kiểm soát

 Theo cách sắp xếp thứ 2, kháng thể chính được đánh dấu được làm khô trên tấm đệm liên hợp Vạch thử nghiệm và vạch kiểm soát lần lượt chứa liên hợp phân tử mang chất phân tích mục tiêu và kháng thể thứ cấp Chất phân tích mục tiêu trong mẫu và phân

tử chất mang chất phân tích mục tiêu trên đường thử nghiệm cạnh tranh để liên kết với kháng thể chính được đánh dấu (kháng thể 1) Khi có mặt của chất phân tích đích trong mẫu, nó liên kết với kháng thể được đánh dấu và di chuyển đến vạch kiểm soát Một vạch

đỏ được giám sát tại vạch kiểm soát trên que

Hình 6: Nguyên lý que thử a) Dạng sandwich và b) Dạng cạnh tranh

3 Ưu điểm, nhược điểm

- Thời gian phân tích nhanh, thể tích

mẫu phân tích nhỏ

- Dễ chế tạo, chi phí chế tạo rẻ

- Ổn định với các điều kiện môi

trường khác nhau, thời gian bán hủy lâu

- Dễ sử dụng, linh hoạt, không cần

phòng thí nghiệm

- Phân tích tại chỗ (on-site), không

- Chủ yếu phân tích định tính/bán định lượng

- Dạng que cạnh tranh, kết quả tương quan với nồng độ chất phân tích

- Tốc độ dịch chuyển mẫu trên que thử khó điều khiển

- Khó để thiết kế que thử để phân tích nhiều đối tượng cùng lúc

cần chuẩn bị trước

- Tiềm năng thương mại cao

- Dễ tích hợp với hệ điện tử

- Dải ứng dụng rộng

- Không, hoặc ít tiêu tốn năng lượng

- Thời gian phân tích phụ thuộc vào bản chất mẫu phân tích

4 Ứng dụng

 Phát hiện:

- Protein

- Tác nhân truyền nhiêm

- Kháng nguyên

- Axit nucleic

- Kháng thể: IgG, IgM

- Hoocmon

- Độc tố

- Kháng sinh

- Hợp chất hữu cơ

 Ứng dụng:

- Chẩn đoán y khoa: rối loạn chuyển hóa, tác nhân lây nhiễm

- Khoa học pháp y

- Theo dõi điều trị

- Môi trường

- Nuôi trồng thủy sản

- Nông nghiệp

- Thú y

- Chẩn đoán tiêu dùng

- An toàn thực phẩm

5 Cơ hội và thách thức

 Cơ hội

- Ứng dụng trên các chất sinh học khác: nước mắt, nước bọt, mồ hôi

- Tỷ lệ ứng dụng thương mại cao: đặc biệt trong lâm sàng và thú y

- Các ứng dụng mới có thể đi trước các công nghệ khác do phát triển nhanh hơn

 Thách thức

- Cạnh tranh thị trường

- Công nghệ lab-on-chip

Ví dụ: Que thử nhanh SARS-COV2

Hình 7: Que thử nhanh SARS-CoV-2 hãng Kyvobio chẩn đoán bằng xét nghiệm

nhanh IgG / IgM TÀI LIỆU THAM KHẢO [1–6]

Que thử:

https://www.kyvobio.com/en/read/newsletter-26/sars-cov-2-covid-19-diagnosis-by-2264.html

1 Sajid M, Kawde AN, Daud M (2015) Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review J Saudi Chem Soc 19:689–705 https://doi.org/10.1016/j.jscs.2014.09.001

2 Huang Y, Xu T, Wang W, et al (2020) Lateral flow biosensors based on the use of micro- and nanomaterials: a review on recent developments Microchim Acta 187: https://doi.org/10.1007/s00604-019-3822-x

3 Bahadır EB, Sezgintürk MK (2016) Lateral flow assays: Principles, designs and labels TrAC - Trends Anal Chem 82:286–306 https://doi.org/10.1016/j.trac.2016.06.006

4 de Puig H, Bosch I, Gehrke L, Hamad-Schifferli K (2017) Challenges of the Nano–Bio Interface in Lateral Flow and Dipstick Immunoassays Trends Biotechnol 35:1169–1180 https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2017.09.001

5 Wong RC, Tse HY (2009) Lateral Flow Immunoassay

6 Posthuma-Trumpie GA, Korf J, Van Amerongen A (2009) Lateral flow (immuno)assay: Its strengths, weaknesses, opportunities and threats A literature survey Anal Bioanal Chem 393:569–582 https://doi.org/10.1007/s00216-008-2287-2