Đồ án tốt nghiệp đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ “sargassum”

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC RONG MƠ “ SARGASSUM” Ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngà[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC

RONG MƠ “ SARGASSUM”

Chuyên ngành: THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn : ThS Trần Thị Ngọc Mai

TP Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan:

- Những kết quả nghiên cứu trong đề tài này chưa được bất kì ai công bố trước đây

- Những nội dung thí nghiệm trong đề tài này là do em thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của cô Trần Thị Ngọc Mai

- Mọi tham khảo dùng trong đề tài đều được trích dẫn rõ ràng, đầy đủ, chĩnh xác về tác giả, tên công trình, thời gian công bố

Nếu xảy ra bất kỳ trường hợp nào liên quan đến bản quyền, em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014

Nguyễn Thị Thuý

ii

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Nhà Trường đã cho chúng em có một môi trường học tập thật tốt, sắp xếp những môn học hợp lý phù hợp với năng lực của

mình Cảm ơn cô Trần Thị Ngọc Mai đã rất tận tình hướng dẫn, giúp đỡ để em

hoàn thành tốt đồ án này Cô là người đã truyền thụ cho em nhiều kiến thức và kinh nghiệm bổ ích trong quá trình thực hiện đồ án, và đây cũng là hành trang để chúng

em có thể vững vàng bước vào đời theo ngành mình đã chọn sau khi rời trường Thứ hai, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quí thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường Trường Đại Học Công Nghệ Tp HCM đã giảng dạy, truyền đạt nguồn tri thức quí báu giúp em có thể hoàn thành tốt đồ án của mình

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên cùng khoá và các anh chị sinh viên khóa trước đã đóng góp ý kiến giúp em hoàn thành đồ án

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn thầy cùng quí thầy cô và gửi lời chúc sức khỏe đến quí thầy cô!

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Giới hạn đề tài 2

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về rong Nâu 3

1.1.1 Phân loại khoa học [1,2,6] 3

1.1.2 Sự phân bố của rong nâu 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật [1,2,7] 4

1.1.3 Thành phần hóa học của rong nâu 5

1.1.5 Nguồn lợi – tình hình khai thác và sử dụng rong nâu 9

1.2 Tổng quan về polyphenol trong rong nâu 11

1.2.1 Đặc điểm 11

1.2.2 Cơ chế kháng nấm của polyphenol 12

1.3 Tổng quan về quá trình trích ly 13

1.3.1 Định nghĩa 13

1.3.2 Cơ sở khoa học 13

1.3.3 Phương pháp trích ly 13

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly 14

1.3.5 Tìm hiểu dung môi trích ly trong đề tài 16

1.4 Tổng quan về phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm 17

1.4.1 Giới thiệu về nấm Aspergillus niger 17

1.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm 18

CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hoá chất và dụng cụ - thiết bị 20

iv

2.1.2.1 Hoá chất 20

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 20

2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23

2.3.1 Đối với dung môi trích ly là nước 23

2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian trích ly 24

2.3.2 Đối với dung môi trích ly là ethanol 25

2.4 Cách tính toán các chỉ tiêu xác định 28

2.4.1.1 Cách tính tỉ lệ thu hồi 28

2.4.1.2 Cách tính hàm lượng polyphenol 28

2.5 Thí nghiệm khảo sát tính kháng nấm 29

2.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết bằng nước 29

2.5.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ethanol 29

2.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi 30

2.6 Sơ đồ và thuyết minh quy trình trích ly thu nhận polyphenol 31

2.6.1 Sơ đồ quy trình 31

2.6.2 Thuyết minh quy trình 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả 34

3.1.1 Đối với dung môi là nước 34

3.1.2 Đối với dung môi là EtOH 42

3.4 Kết quả kháng nấm của dịch chiết thu được 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

❖ EtOH: Ethanol

❖ NL: nguyên liệu

❖ DM: dung môi

❖ P.p: polyphenol

❖ HQ % : hiệu quả kháng nấm

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi

đến hiệu quả trích ly 23

Hình 2 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly 24

Hình 2 3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của dung nhiệt độ đến hiệu quả trích ly 25

Hình 2 4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi đến hiệu quả trích ly 26

Hình 2 5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly 27

Hình 2 6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến hiệu quả trích ly 28

Hình 2 7 Sơ đồ quy trình trích ly thu nhận polyphenol 31

viii

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong nâu là một trong các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất Rong nâu chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao Đó là các chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose,…); 17 acid amin; các acid béo không no; các chất khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự

do nguy hiểm; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu ; alginat là chất giải độc thiên nhiên; polyuronan có hoạt tính kháng u não; laminaran có tác dụng rất tích cực trong việc hỗ trợ điều trị bệnh có liên quan đến mạch máu tim, chất kháng ung thư,chất bảo vệ phóng xạ, kháng đông lạnh, chất kích thích hạt giống nảy mầm, tăng trưởng cây trồng và fucoidan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viên nhiễm, ngăn ngừa ung thư Trong rong nâu, hàm lượng polysaccharide chiếm khoảng từ 40 - 80% khối lượng rong khô, là những chất có giá trị nhất và có ứng dụng hết sức rộng rãi nhờ các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng Theo các nhà khoa học Nga, polysaccharide tồn tại trong rong nâu được chia làm 2 nhóm chính: nhóm tan trong kiềm là acid alginic, đã được nghiên cứu từ những năm

30 của thế kỷ trước và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm; nhóm tan trong nước bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan là những chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá mới được nghiên cứu sử dụng trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây Đặc biệt fucoidan được tìm thấy trong vách tế bào rong nâu là chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá: hoạt tính chống đông máu và chống đông tụ (Anticoagulant và Antithrombotic), hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch, hoạt tính kháng virus, trị bệnh dạ dày, bệnh về da Ngoài ra fucoidan còn được sử dụng để điều trị các bệnh dị ứng, lão hóa, viêm khớp, suyễn, đái tháo đường, tăng nhãn áp, huyết áp cao, cholesterol cao, bệnh tim, viêm gan C, HIV, bệnh gan, loét dạ dày, đột quỵ, tuyến giáp, thiên đầu thống Việt Nam có hệ động vật, thực vật vô cùng phong phú, có nhiều gen quý hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Một trong những điều kiện tạo nên

sự phong phú và giàu có ấy chính là vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài hơn 3200

2

km bao bọc hết phía đông và nam đất nước Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và có giá trị mà vùng biển ban tặng cho chúng ta là rong biển

Nhằm đáp ứng nhu cầu của xã hội hiện đại, đồng thời tận dụng được nguồn nguyên liệu dồi dào, các nhà khoa học của nước ta đã và đang tăng cường nghiên cứu, chuyển nguồn rong biển và phế thải từ rong biển thành các sản phẩm có giá trị, bằng cách sản xuất ra các loại thực phẩm khác nhau, tách chiết ra các thành phần khác nhau có hoạt tính sinh học hoặc hỗn hợp các thành phần có hoạt tính sinh học

để gia tăng giá trị rong biển Việt Nam

Đi chung với xu hướng đó nhóm thực hiện đề tài tiến hành nghiên cứu :

“Đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ Sargassum”

2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ

Sargassum ở các nồng độ khác nhau

3 Giới hạn đề tài

Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học, trong điều kiện kiến thức còn hạn chế, điều kiện cơ sở vật chất, kinh phí nghiên cứu còn thiếu thốn, ngoài việc nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ của giảng viên hướng dẫn cùng với các Thầy phụ trách phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, nhóm nghiên cứu đã hoàn thành đề tài được giao Tuy nhiên, đề tài không tránh khỏi những thiếu sót, nhóm thực hiện đề tài rất mong được sự góp ý chân thành của các Thầy/Cô để đề tài được hoàn thiện hơn

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rong Nâu

1.1.1 Phân loại khoa học [1,2,6]

Ngành: Ochrophyta

Lớp: Phaeophyceae Bộ: Fucales

Họ: Sargassaceae

Chi: Sargassum Loài: Sargassum virgatum (rong mơ chổi), Sargassum feldmannii P.Hoang (rong mơ Việt Nam), Sargassum mcclurei setchell (rong mơ McClurei), Sargassum graminifolium (rong mơ cỏ), Sargassum carpophyllum (rong mơ chụm), Sargassum horneri (rong mơ Horner), v.v …

1.1.2 Sự phân bố của rong nâu

Rong nâu phân bố dọc theo bờ biển nước ta, ở miền Trung và miền Nam rong tập trung chủ yếu ở các tỉnh: Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu, Kiên Giang và các đảo: Lý Sơn, Phú Quý, Phú Quốc, quần đảo Trường Sa Ở các tỉnh phía Bắc, rong nâu có ở các tỉnh: Quảng Ninh, Hải Phòng, và một số đảo như Cô Tô, Cát Bà…

Diện tích rong nâu ở vùng biển Quảng Nam Đà Nẵng khoảng 190.000 m2, trữ lượng khoảng 800 tấn rong tươi Diện tích rong nâu ở tỉnh Bình Định khoảng hơn 40.000 m2, trữ lượng rong khoảng hơn 100 tấn/năm Vùng biển Khánh Hoà là vùng biển có diện tích rong nâu mọc cao nhất khoảng 2.000.000 m2, trữ lượng có thể khai thác được hàng năm khoảng 11.000 tấn rong tươi Sản lượng rong nâu trung bình của các tỉnh duyên hải miền trung là 18,00 tấn rong tươi/vụ

4

1.1.2 Đặc điểm thực vật [1,2,7]

Rong dài ngắn tùy loài và tùy thuộc vào điều kiện môi trường, thường gặp

rong dài từ vài chục centimet đến vài ba

mét hay hơn Chúng bám vào vật bám

nhờ đĩa bám hay hệ thống rễ bò phân

nhánh Đĩa bám thường chắc hơn rễ và

sóng biển thường đánh đứt rong hơn là

nhổ được đĩa bám

Thân rong gồm một trục chính rất ngắn, đa số thường dài trên dưới 1cm,

hình trụ, sần sùi Đỉnh của trục chính sẽ phân ra làm 2 đến 5 nhánh chính, hai bên nhánh chính sẽ mọc ra nhiều nhánh bên Nhánh chính và nhánh bên sẽ tạo ra chiều dài của rong Chiều dài này khác nhau tuỳ vào các chi, loài và trong cùng một loài kích thước này cũng thay đổi tuỳ vào điều kiện sống, nơi phân bố

Trên các nhánh có các cơ quan dinh dưỡng gần giống như lá và các túi chứa đầy không khí được gọi là phao Khi rong trưởng thành trên các nhánh bên mọc ra các nhánh phụ, ngắn (thường từ tháng 3 đến tháng 6) có mang nhiều cơ quan sinh sản đực và cái gọi là đế Nhờ có hệ thống phao rong luôn giữ vị trí thẳng đứng trong môi trường biển Nếu nước cạn rong khá dài thì phần trên của rong nằm trên mặt nước

Hình 1 2 Hình 1 1 Hình thái rong nâu

1.1.3 Thành phần hóa học của rong nâu

Bảng 1 1 Thành phần hoá học chính của rong nâu

1.1.3.1 Sắc tố

Sắc tố trong rong nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố (Xantophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten) Tùy theo tỷ lệ các loại sắc tố

mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục Nhìn chung sắc tố của rong nâu khá bền [1]

1.1.3.2 Gluxit

➢ Monosacaride [1]

Monosacaride quan trọng trong rong nâu là đường mannitol được Stenhouds phát hiện ra năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm Mannitol có công thức tổng quát: HOCH2 – (CHOH)4 – CH2OH Mannitol tan được trong alcol,

dễ tan trong nước, có vị ngọt Hàm lượng từ 14% ÷ 25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý nơi sinh sống

➢ Polysaccharide

• Alginic

Công thức cấu tạo của acid alginic là (C6H6O6)n Là một acid hữu cơ có trong tảo nâu, có trọng lượng phân tử từ 32.000 - 200.000, do D - Mannuroic acid và L - Guluronic acid liên kết với nhau bởi liên kết glucozit Nó tồn tại dưới dạng sợi, hạt hay bột màu trắng đế vàng nâu, được dùng làm chất tạo đông, chất ổn định, chất tạo gel, chất nhủ hóa, không tan trong nước và dung môi hữu cơ, tan chậm trong dung

6

Hình 1 2 Cấu trúc của acid alginic

• Axit Fucxinic: có tính chất gần giống với axit alginic

• Fuccoidin: Là loại muối giữa axit fuccoidinic với các kim loại hóa trị

khác nhau như: Ca, Cu, Zn Fuccoidin có tính chất gần giống với alginic, nhưng hàm lượng thấp hơn alginic

Fuccoidin hay fucoidan là một polysaccharide sulfate hóa dị hợp, trong đó fucose chiếm từ 18,6% ÷ 60% [18], sulfate chiếm từ 17,7% ÷ 39,2%, ngoài ra còn

có mặt các thành phần đường khác như: galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose, và acid uronic Hàm lượng fucoidan trong các loại rong nâu khoảng 2

÷ 9% so với rong khô Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường mà rong sinh sống

Fucoidan là môt hợp chất chống oxy hóa được chiết xuất từ thành phần chất

nhờn “sliminess” của tảo nâu Mozuku (Cladosiphon okamuranus) và Mekabu (phần

cuốn nằm gần gốc của Wakame) Cấu trúc hóa học của fucoidan là một chuỗi dài polysaccharide giàu sulfate fucose Giáo sư Kylin.H.Z của đại học Uppsala Thụy Điển, vào năm 1913 đã điều chế thành công fucoidan từ tinh chất nhờn của loài rong

Konbu và đặt tên là fucoidin Sau đó, hiệp hội thế giới đồng ý đổi tên fucoidin thành

fucoidan

Fucoidan được chiết xuất từ tảo nâu Okinawa Mozuku và Mekabu Nhiều

nghiên cứu đã chứng minh fucoidan tăng cường hoạt động của các Natual Killer Cell (tạm dịch là tế bào tiêu diệt tự nhiên) cũng như thúc đẩy sự hoạt động của Macrophage (đại thức bào), Helper T - cells và B - cells làm cho các tế bào có hại trong cơ thể giảm đi đáng kể và thậm chí tự tiêu biến đi Đó là kết quả chứng tỏ

fucoidan đã tăng cường miễn dịch cho cơ thể và để tấn công trực tiếp loại bỏ các tế bào có hại (hiện tượng này được gọi là Apoptosis)

Fucoidan là thành phần chứa nhóm các phân tử đường (polysaccharide) chỉ có trong các loại tảo biển, có tác dụng đặc biệt khiến cho tế bào ung thư vốn liên tục tự tăng lên có thể tự tiêu diệt (apoptosis)

Fucoidan chính là thành phần “nhớt” đặc biệt có trong các loại tảo biển màu nâu, một loại sợi thuộc nhóm hợp chất đa đường phân tử cao do đường fucoza kết hợp với axit sulfuric tạo thành đường fucoza chứa lưu huỳnh hóa trị cao, cùng với các loại đường như galactoze, mannoza liên kết với nhau

Có 3 loại Fucoidan là F - FUCOIDAN, U - FUCOIDAN, G - FUCOIDAN Trong 3 loại này, U - FUCOIDAN là loại được quan tâm nhiều nhất Đó là do các nghiên cứu đã chứng minh trong U - FUCOIDAN có chất làm cho tế bào ung thư trong cơ thể con người tự hủy diệt U - FUCOIDAN có nhiều trong các loại tảo biển

như Konbu, Mozuku, Hijiki, trong đó các phân tử đường đơn như glucuronic acid,

mannoza, fucoza đứng cạnh nhau

CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA U - FUCOIDAN

Tế bào con nguời sau khi hoàn thành nhiệm vụ của mình thì sẽ tự chết đi (hiện tượng apoptosis), đây là cơ chế mang tính di truyền Tuy nhiên, riêng đối với tế bào ung thư, khác với tế bào thường, cơ chế này không xảy ra và tế bào ung thư cứ được nhân lên mãi

Tuy nhiên, một loại U - FUCOIDAN bao gồm các sợi đa đường vốn có nhiều

trong các loại tảo biển Konbu, Wakame, Mozuku…có tác dụng làm các tế bào ung thư

tự tiêu biến

Khi U - FUCOIDAN kết hợp với cơ quan thụ cảm, sẽ xuất hiện dấu hiệu khởi động cơ chế tự tiêu biến của tế bào ung thư, khi đó tế bào ung thư sẽ tự cắt DNA đi

và mất khả năng sinh tồn Hiện tượng này đã được xác minh tại Nhật Bản Phương pháp này là phương pháp tiêu diệt tế bào ung thư từ bên trong, khác với phương pháp dùng tế bào miễn dịch tấn công tế bào ung thư từ bên ngoài

• Laminarin: Laminarin là tinh bột của rong nâu Laminarin thường ở

dạng bột không màu, không mùi và có hai loại: loại hòa tan và loại không hòa tan