Đề tài nghiên cứu khả năng tăng trưởng của một số vi sinh vật trên bề mặt giá đỡ cellulose vi khuẩn (bc – bacterial cellulose

Tổng quan tài liệu Tổng quan tài liệu TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose BC) Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần chính c[.]

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC)

Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phầnchính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của

vi sinh vật Cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) là sản phẩm trao đổichất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ

1.1 Các vi khuẩn sản sinh BC

- BC đuợc tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn Trong đó Acetobacter xylinum sinh tổng hợp BC hiệu quả nhất và được nghiên cứu nhiều nhất Cấu

trúc của BC được tổng hợp khác nhau ở các loài vi khuẩn khác nhau

Bảng 2.1 : Cấu trúc cellulose của một số vi sinh vật [7]

1.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum

- Loài : Acetobacter xylinum

Gần đây, A xylinum đã được xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các loài là G xylinus, G hansenii, G europaeus, G oboediens và G intermedius [7]

1.2.2 Đặc điểm hình thái A xylinum:

- A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc

không và không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn gram âm nhưng gram củachúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do môi trường Tế bào đứng riêng

lẻ hay xếp thành chuỗi A xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì

thế chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trườngkhí và có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [7]

Hình 2.1: Tế bào Acetobacter xylinum

- Trên môi trường rắn sau khoảng 3 – 7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A.

xylinum có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhưng sau một tuần thì

khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần

- Trên môi trường lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng

đục dày, sau 36 – 48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày[11]

1.2.3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của A xylinum

- Phản ứng catalase dương tính

- Oxi hóa ethanol thành CO2 và H2O

- Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer

- Không tạo sắc tố nâu

- Vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn.

- Chuyển hóa glucose thành acid.

- Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton.

- Tổng hợp cellulose

- A xylinum sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào

chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất Chúng có thể chuyển hóaglucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 - 2đơn vị

- Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển là từ 25 - 30°C và pH từ 5,4 –

6,3 A xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12

sợi cellulose có chiều dài từ 1 - 9μm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc,được ổn định bởi các nối hydrogen BC khác với PC về chỉ số kết chặt, vềmức độ polymer hóa.

Hình 2.2: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật [44]

- Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, đượcphân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại.Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà cellulosedạng nào chiếm ưu thế Cellulose I và II đều được tổng hợp trong tự nhiêntrong đó celulose I phổ biến hơn Cellulose I có thể được chuyển thànhcellulose II, nhưng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I Rất ít tế

bào Eukaryote tổng hợp cellulose II A xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại

cellulose I và II

- Cellulose I: được tổng hợp bởi đa số thực vật và A xylinum ở môi

trường tĩnh Các chuỗi β-1,4-glucan được sắp xếp song song với nhau theomột trục Năm 1984 Atalla và Vander Hart đã xác định được cấu trúc cellulose

Iα và cellulose Iβ

- Cellulose II: thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc Cácchuỗi β-1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên, hầu như không song song và nốivới nhau bởi một số lượng lớn nối hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền vềnhiệt [7][24]

Hình 2.3: Sự hình thành vi sợi bởi A xylinum [Iguchi và cộng sự, 2000]

1.3.2 Chức năng sinh lý của cellulose đối với Acetobacter xylinum

- Tế bào A xylinum được bẫy bên trong mạng lưới polymer Mạng lưới

này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luơn ở bề mặt tiếp giáp giữa mơitrường lỏng và khơng khí Cellulose cịn cĩ vai trị tích trữ và cĩ thể được sửdụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng Sự phân hủy celluloseđược xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase

- Nhờ tính dẻo và tính thấm nước của màng cellulose mà vi khuẩn khánglại được những thay đổi bất lợi trong mơi trường sống như giảm lượng nước,thay đổi pH, xuất hiện chất độc và vi sinh vật gây bệnh Cellulose bao quanh

bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế bào A xylinum được bao BC

sống sĩt sau 1 giờ xử lý tia cực tím Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống chỉcịn 3% [7]

1.3.3 Tính chất độc đáo của BC

- Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất đuợc tổng hợpkhơng cĩ chứa lignin hay hemicellulose Do đĩ BC cĩ thể bị vi khuẩn phânhủy hồn tồn và là nguồn nguyên liệu tái sinh

Vi sợi Cellulose Microfibril

Tiền sợi Lỗ xuất

- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng

kể, lực ẩm cao Màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, nó cóthể hút 60 – 700 lần trọng lượng của nó

- Màng cellulose được hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp

vì vậy việc sản xuất giấy, sợi không cần qua các bước trung gian

- Màng cellulose được định hướng trong quá trình tổng hợp: có khả nănghình thành các sợi biến động, tạo các màng bền theo một trục Theo Brown vàWhite (1989) có thể hình thành một găng tay cellulose không cần khâu bằngcách sử dụng một khối đất xốp mà không khí thấm qua được và dìm xuống

bên trong môi trường lỏng nuôi cấy A xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp

xung quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn

- Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: khithêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp BC thì

có thể làm thay đổi những thuộc tính của BC Nếu cho thuốc nhuộm vào môitrường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quátrình tổng hợp

- Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động lêngen liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạngcellulose, kiểm soát trọng lượng phân tử cellulose [11][31]

1.4 Sinh tổng hợp BC

- Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòamột cách chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, cácphức hợp xúc tác và các protein điều hòa

- Cellulose được tổng hợp từ A.xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự

biến dưỡng carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chutrình pentose phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp với quá trình tạoglucose Sự thủy phân glucose không hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vìchúng không tổng hợp được enzyme quan trọng của con đường này đó là

phosphofructose kinase Ở A.xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ

với quá trình dị hóa và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng có nguồn gốc từnhững phản ứng dị hóa Sự tổng hợp BC không gây trở ngại cho các quá trìnhđồng hóa khác, bao gồm sự tổng hợp protein

- A.xylinum biến đổi nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol,

pyruvate, dihydroxyacetone và các dicarboxylic acid thành cellulose với hiệusuất 50%

- Ngày nay con đường tổng hợp cellulose ở A.xylinum đã được hiểu rất

rõ Đó là một quá trình tổng hợp gồm nhiều bước liên tiếp nhau, gồm hai giaiđoạn chính: giai đoạn polymer hóa, giai đoạn kết tinh

Giai đoạn polymer hóa: trong đó có sự tham gia của enzyme tổng

hợp cellulose xúc tác Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứngphosphoryl hóa glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P) Tiếp theo Glc-6-P bị isomer hóa tạo thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) nhờ enzymephosphoglucosemutase (PGM) Sau đó enzyme UDP-glucosepyrophosphorylase (UGP) xúc tác chuyển Glc-1-P thành UDPGlc, trong đó có

sự hiện diện của UTP Cuối cùng cellulose được tạo thành từ UDPGlc nhờenzyme cellulose synthase và cyclic-di-GMP là yếu tố giúp hoạt hóa enzymenày

Giai đoạn kết tinh: các chuỗi bắt đầu được tổng hợp nối với nhau

bằng liên kết β-1,4-glucan Các chuỗi glucan kết hợp với nhau bằng liên kếtVan der Waals tạo nên lớp các chuỗi glucan Lớp này chỉ tồn tại trong mộtthời gian ngắn, sau đó các lớp này sẽ kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạothành các sợi cơ bản thường gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kếthợp với nhau tạo thành vi sợi, rồi sau đó tạo thành các bó và thành các sợi.Kích thước, hình dạng, độ trong suốt, tỷ lệ các dạng của cellulose tùy thuộcvào vị trí xúc tác của phức chất enzyme

Hình 2.4: Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết

ra cellulose khi glucose được tế bào A xylinum hấp thụ từ bên ngoài [43]

Chu trình Pentose phosphate Chu

trình Krebs

PGI

FK

Fru-6-PFructose

PTS

Fru-1-P

ATP ADP

PGAG6PDH

(NAD, NADP)

Glucose

Glc-6-P

GKADP

Hình 2.5: Con đường sinh tổng hợp BC ở Acetobacter xylinum [44]

- UDPGlc pyrophosphorylase là enzyme quyết định sự tổng hợpcellulose vì vài kiểu hình đột biến không tổng hợp cellulose thiếu enzyme này(Valla et al.,1989)

- Hơn nữa, hoạt tính pyrophosphorylase khác nhau giữa những loài A xylinum khác nhau và hoạt tính cao nhất thì được phát hiện trong những loài sản xuất cellulose hiệu quả nhất như là A xylinum ssp sucrofermentans BPR2001

- Ngoài ra có vài loài thích sử dụng fructose như là nguồn cacbon và thểhiện hoạt tính phosphoglucoisomerase cao và có hệ enzyme trao đổi phosphor

và phụ thuộc vào phosphoenolpyruvate Hệ này xúc tác biến đổi fructosethành fructose-1-phosphate và thành fructose-1,6-biphosphate [7][6]

1.5 Nguyên liệu để nuôi Acetobacter xylinum nhằm thu BC

1.5.1 Nước dừa già

- Nước dừa già là môi trường cổ điển để thu nhận BC từ A xylinum Đây

là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích sinh trưởng:1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol, sorbitol…

- Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản từ 3 ngày rồi đem sửdụng làm môi trường lên men Nếu để lâu lượng đường trong nước dừa giảm,chất lượng dinh dưỡng của nước dừa cũng không đảm bảo Môi trường nướcdừa cần cung cấp thêm nguồn cacbon (sucrose, glucose hoặc nguồn cacbonkhác), nguồn nitơ (SA, DAP)

1.5.2 Rỉ đường

- Là phần nước đường không thể kết tinh hết cũng như còn lẫn các tạpchất sau khi ly tâm nhiều lần nước mía để tách lấy đường kết tinh Rỉ đường làmột hỗn hợp khá phức tạp Ngoài lượng đường khá cao, rỉ đường còn chứa cáchợp chất nitrogen, vitamin và các hợp chất vô cơ khác

- Thành phần của rỉ đường có chứa 15 – 20% nước, 80 – 85% chất khôhòa tan và nhiều loại vitamin như: thiamine, riboflavin, acid nicotinic, acidfolic, biotin …

- Chất khô hòa tan trong rỉ đường gồm:

 Đường tổng số chiếm hơn 50%, trong đó saccharose chiếm 30 –35%, đường khử chiếm 15 – 20% (gồm glucose, fructose) Chất khử không lênmen thường chiếm 1,7%

 Thành phần chất khô còn lại chiếm dưới 50%, trong đó có 30 –32% chất hữu cơ và chất vô cơ 18 – 20%

- Khi được bảo quản lâu ngày, chất lượng rỉ đường thường giảm Vì vậycần có chế độ bảo quản hợp ý để quá trình lên men đạt hiệu quả cao

- Ngoài ra, còn sử dụng nước mía và các nguyên liệu khác từ côngnghiệp thực phẩm để lên men thu BC [7]

1.6 Các phương pháp sản xuất BC

1.6.1 Nhân giống

- Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum được giữa trong ống thạch

nghiêng trong điều kiện lạnh sâu Khi cần nuôi cấy thì tiến hành hoạt hóachúng Khi lấy giống ra sử dụng cần cấy chuyền qua môi trường rắn

- Cấy khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã hấp khử trùng,hoạt hóa ở nhiệt độ 28°C trong 18 – 24 giờ được giống cấp 1 Giống cấp 1 cóthể tiếp tục được nhân giống cấp 2, 3… Tỉ lệ giống so với môi trường từ 1 –10%

1.6.2 Lên men

 Lên men tĩnh: môi trường dinh dưỡng để lên men A xylinum

được cho vào các khay lên men có bề mặt thoáng rộng Trong quá trình lênmen các khay được đậy bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữamôi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năngnhiễm khuẩn Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30°C Sợi

cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt môi trường nuôi cấy tạothành lớp màng cellulos nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và khôngkhí Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên Sau 7 –

10 ngày có thể thu BC

Hình 2.6: Miếng BC được hình thành từ lên men tĩnh [24]

 Lên men động: vi khuẩn A xylinum thường được nuôi cấy trong

môi trường nuôi cấy lắc Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vàomôi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trongcác máy lắc ổn nhiệt ở 28 - 30°C, 180 – 200 vòng/phút BC được tạo từ môitrường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốttrong môi trường Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự

sinh trưởng và khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A xylinum Do đó, quá

trình lên men đạt hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sửdụng để lên men

Hình 2.7: Hạt BC được hình thành từ nuôi cấy lắc [24]

Tác nhân vận chuyển thuốc

Da nhân tạoChất làm co mạch

Đánh móng dày và mỏng hơnMôi trường Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn

Hấp thu chất độcQuần áo, giày dép tự phân hủy

Trang phục Sản xuất sợi nhân tạo

Y phục quân đội

Hình 2.8: Sản phẩm trị bỏng da Biofill thương mại làm từ màng BC[7].

Hình 2.9: Ứng dụng BC làm giá

thể nuôi cấy cụm chồi thuốc

lá[7].

Hình 2.10: Ứng dụng BC trong vật liệu mới làm tấm xốp [7].

 Ứng dụng BC làm giá đỡ nuôi cấy tế bào vi sinh vật

 BC phù hợp với các yêu cầu cơ bản của giá đỡ trong kĩ thuậtnuôi cấy tế bào vi sinh vật

 Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học: hình dạng, kíchthước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra hình dạngmong muốn Đây là ưu điểm của BC so với các giá đỡ khác

 BC có tính cơ lý bền và ổn định: độ chịu lực của BC khá cao.Tính chất cơ lý bền và ổn định của BC giúp cho BC chịu được sự tác độngcủa môi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực

 BC không tan trong môi trường phản ứng

 Giá đỡ BC có độ trương nở tốt: độ trương nở cao giúp cho sựkhuếch tán của cơ chất, sản phẩm Môi trường trong và ngoài giá đỡ không có

sự khác biệt giúp cho tế bào vi sinh vật giữ nguyên được các đặc điểm sinhhóa của tế bào tự do

 BC đã qua xử lý không gây tác động kìm hãm đến hoạt độngsống của vi sinh vật vì sau giai đoạn xủ lý, BC chỉ là giá đỡ trơ về mặt hóahọc và có độ trương nở tốt

 Giá thành BC: so với các vật liệu khác thì BC thấp hơn rất nhiều

 BC có khả năng tái sử dụng

 BC an toàn cho môi trường sống

Thuận lợi của việc sản xuất BC theo phương pháp lên men là: tốc độsinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, giá thành rẻ Tuy nhiên điểm hạn chếcủa nó là không thể nuôi cấy những vi sinh vật tạo ra cellulase vì bản chất của

BC là cellulose [12]

2 Giới thiệu về Saccharomyces cerevisiae

2.1 Đặc điểm của S cerevisiae

- S cerevisiae là tế bào nhân chuẩn đơn bào, được dùng làm đối tượng

mô hình cho nghiên cứu sinh vật nhân chuẩn

- Ứng dụng sớm trong lên men rượu và làm bánh mì Hiện nay ứng dụngtrong công nghiệp lên men rượu với quy mô lớn

- Đối tượng sinh vật nhân chuẩn đơn bào dùng để sản xuất protein tái tổhợp

2.1.1 Cấu tạo và sinh sản của S cerevisiae

- Phân loại:

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Giống: Saccharomyces Loài: Saccharomyces cerevisiae

- Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào, tế bào giống như ở động

và thực vật [9]

- S cerevisiae thường có dạng hình tròn hay bầu dục Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn Kích thước thay đổi trong khoảng (3 –

10)μm x (4,5 – 15)μm