Công nghệ sản xuất amylase và ứng dụng

-Amylase Năm 1971: Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đãxác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase Amylase và glucoAmylase trong canh trườngnấ

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

ENZYME AMYLASE VÀ ỨNG

DỤNG

TP.Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2014

I TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE: 3

1 Lịch sử phát triển 3

2 Amylase là gì? 3

3 Phân loại 4

3.1 Enzyme α-Amylase (Amylase (α-Amylase (1,4-Amylase (glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): 5

3.2 Enzyme β-Amylase (Amylase (β-Amylase (1,4-Amylase (glucan-Amylase (maltohydrolase) (EC 3.2.1.2): 7

3.3 Enzyme γ-Amylase (Amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3): 8

3.4 Oligo 1,6-Amylase (glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10) 9

3.5 Enzyme pullulanase (α-Amylase (dextrin6-Amylase (glucosidase) (EC 3.2.1.41) 10

3.6 α-Amylase (glucosidase hay maltase (α-Amylase (D,glucoside-Amylase (glucohydrolase) (EC 3.2.1.20) 10

4 Cơ chất tác dụng 10

II PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE 11

1 Đơn vị đo hoạt tính 11

1.1 Đơn vị Enzyme quốc tế (UI) do hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) định nghĩa 11

1.2 Đơn vị Katal 11

2 Hoạt tính riêng của Enzyme 12

3 Phương pháp xác dịnh 12

3.1 Xác định hoạt tính Enzyme α-Amylase (Amylase theo Rukhliadeva 12

3.2 Xác định hoạt tính Enzyme γ-Amylase (Amylase (glucoAmylase) 12

3.3 Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase 13

III ĐIỀU KIỆN CẦN VÀ ĐỦ ĐỂ THU NHẬN ENZYME AMYLASE 13

1 Chủng giống vi sinh vật 13

2 Môi trường dinh dưỡng: 13

3 Điều kiện nuôi cấy 15

3.1 Nhiệt độ 15

3.2 Độ ẩm canh trường 15

3.3 pH môi trường 16

3.4 Cung cấp oxy 16

IV THU NHẬN ENZYME AMYLASE: 16

1 Nguồn thu nhận: 16

2 Giải thích quy trình 18

2.1 Nuôi cấy vi sinh vật giống 18

2.2 Thu dịch Enzyme 22

2.3 Cô đặc thu chế phẩm Enzyme thô 22

2.4 Thu chế phẩm Enzyme tinh khiết 23

V THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE 24

1 Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae: 24

2 Quy trình len men và thu nhận Amylase theo phương pháp lên men bề mặt: 25

2.1 Quy mô phòng thí nghiệm 25

2.2 Quy mô công nghiệp 26

2.3 Nhân giống vi sinh vật 27

2.4 Chuẩn bị môi trường lên men 29

2.5 Tiệt trùng môi trường 30

2.6 Lên men sinh tổng hợp enzyme 30

2.7 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô 34

2.8 Tách và tinh sạch enzyme 35

2.9 Sấy 39

3 Các dạng chế phẩm enzyme 40

4 Một số chế phẩm amylase thương mại 40

4.1 Chế phẩm α – amylase 40

4.2 Chế phẩm glucoamylase 43

4.3 Ngoài ra còn có một số loại chế phẩm khác: 43

VI ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE: 44

1 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Chế Biến Thực Phẩm Gia Súc 44

2 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Dược Phẩm 45

3 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Công Nghiệp Dệt 45

4 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Việc Tẩy Màu Giấy 46

5 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Sản Xuất Bia 48

6 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Sản Xuất Cồn: 49

VII TÀI LIỆU THAO KHẢO 51

I TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE:

-Amylase ( Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thànhđường Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và độngvật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu

-Amylase ( Năm 1862, Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấpthụ chọn lọc

-Amylase ( Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase (Amylase là 19000 -Amylase ( Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của -Amylase (Amylase là 250000 -Amylase ( Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4Enzyme α-Amylase (Amylase

-Amylase ( Năm 1971: Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đãxác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase (Amylase và glucoAmylase trong canh trườngnấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt tính dextrinase và transglucosilase

2 Amylase là gì?

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộcnhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharidevới sự tham gia của nước:

RR’ + H-Amylase (OH RH + R’OHAmylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạnchế Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóacủa người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Trongnước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa,chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non

nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin) Amylase của malt thủy phân tinhbột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men.

Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong côngnghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm

3 Phân loại

Hiện nay, có 6 loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ).

- Endoamylase : gồm có α-Amylase (Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh Nhóm

Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-Amylase (dextrin6-Amylase (glucanohydrolase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-Amylase (1,6-Amylase (glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-Amylase (1,6-Amylase (glucosidase (EC 3.2.1.10) Các Enzyme này thủyphân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

-Amylase ( Exoamylase: Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi

polysaccharide Nhóm này gồm có:

+ β-Amylase (Amylase (EC 3.2.1.2)

+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase (Amylase) (EC 3.2.1.3)

Khử gián tiếpoligo-Amylase1,6-Amylaseglucosidase(transglucosylase)

Và amylo 1,6-Amylaseglucosidase

3.1 Enzyme α-Amylase (Amylase (α-Amylase (1,4-Amylase (glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1):

a Cấu tạo:

Enzyme α-Amylase (Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng50.000 đến 60.000 Dal Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase (Amylase từ loài vi khuẩn

Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến nay người ta đã biết rất

rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase (Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase (Amylase là taka-Amylase (

Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase (Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình

thể không gian cấu trúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗimạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả cácEnzyme α-Amylase (Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau

Hình 2.Cấu trúc không gian của α-AmylaseAmylase

b Cơ chế tác dụng của α-AmylaseAmylase:

α-Amylase (Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau α-Amylase (Amylase có

khả năng phân cắt các liên kết α-Amylase (1,4-Amylase (glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất

( tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả

α-Amylase (Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bộtnguyên song với tốc độ rất chậm

Dưới tác dụng của α-Amylase (Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose,glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-Amylase (Amylase chỉ thủy phântinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ítmaltose Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase (Amylase là tính chất đặc trưng của nó Vìvậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịchhóa

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase (Amylase:

+ Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:

Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide

Amylase oligosacharide poliglucose

Maltose maltotriose maltotetrose

c Đặc tính α-AmylaseAmylase

α-Amylase (Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loạiα-Amylase (Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-Amylase (Amylase là một protein giàutyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Điểm đẳng điện nằm trong vùngpH=4,2 -Amylase ( 5,7 ( Bernfeld P, 1951 )

α-Amylase (Amylase là một metaloEnzyme Mỗi phân tử α-Amylase (Amylase đều có chứa 1-Amylase (30nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 -Amylase ( 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào

sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme(Modolova, 1965)

α-Amylase (Amylase

α-Amylase (Amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-Amylase (1,6 glucoside của amylopectin, nênkhi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh Đây là một cấu trúc phân tửtinh bột do Enzyme α-Amylase (Amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh.

Hình 3 Cấu trúc mạng phân tử amylopectin

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợichủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Nồng độ α-Amylase (Amylase của VSV tương đối lớn

có thể chuyển hóa 70 -Amylase ( 85% tinh bột thành đường lên men Còn các α-Amylase (Amylase củanấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 -Amylase ( 87%

Điều kiện hoạt động của α-Amylase (Amylase từ các nguồn khác nhau thường khônggiống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-Amylase (Amylase từ nấm sợi là 4,0 -Amylase ( 4,8 ( có thểhoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 -Amylase ( 5,8 )

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-Amylase (Amylase từ các nguồn khác nhaucũng không đồng nhất, α-Amylase (Amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt.Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C (Kozmina, 1991 )

3.2 Enzyme β-Amylase (Amylase (β-Amylase (1,4-Amylase (glucan-Amylase (maltohydrolase) (EC 3.2.1.2):

a Cấu tạo:

β-Amylase (Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm Ở trong cáchạt ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase (Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-Amylase (glucan trongtinh bột , glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khửcủa mạch Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase (Amylase có cấu hình β

Ở ngũ cốc, β-Amylase (Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trìnhnảy mầm của hạt Ở lúa, β-Amylase (Amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầunhư không được tổng hợp ở hạt khô Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nóđược tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này

là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease

sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da

b Cơ chế tác dụng của β-AmylaseAmylase:

β-Amylase (Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme) Tiến trình phân giải bắt đầu

từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-Amylase (Amylase phân cắt các liên kếtα-Amylase ( 1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-Amylase (1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-Amylase (1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tửlớn có chứa rất nhiều liên kết α-Amylase (1,6 glucoside và được gọi là β-Amylase (dextrin

Cơ chế tác dụng của β-Amylase (Amylase lên tinh bột

Tinh bột     -Amylase ( amylase  maltose (54-Amylase (58%)+ β-Amylase (dextrin(42-Amylase (46%) (glucogen)Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-Amylase (Amylase thì lượng tinh bột thuỷ phân tới 95%

3.3 Enzyme γ-Amylase (Amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3):

a Cấu tạo:

γ-Amylase (Amylase ( glucoamylase hay α-Amylase (1,4-Amylase (glucan-Amylase (glucohydrolase ) là những Enzyme có thểthuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-Amylase (glucan để giải phóng ra ở dạng β

Glucoamylase hay γ-Amylase (Amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật Đặc biệt là kiểu nấm

mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus

Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao độngrất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme

Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một nửagốc cystein Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động củaEnzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều làglucoprotein chứa từ 5 -Amylase ( 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid glucosemannose, galactose và glucosamin

Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoEnzyme I và II khác nhau ở khảnăng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng Amyloglucosidase I tự hấp

thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinhchất này

b Cơ chế hoạt động:

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-Amylase (D-Amylase (glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiềulần các liên kết α-Amylase (1,4 của mạch α-Amylase (glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được cácliên kết α-Amylase (1,6 và α-Amylase (1,3 nhưng rất chậm (10 -Amylase ( 30 lần ) Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vàobản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kíchthuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân Nhất là với các α-Amylase (glucan mạch dài ( amylose vàamylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 500C Nóbền với acid hơn α-Amylase (Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệbởi Ca2+

3.4 Oligo 1,6-Amylase (glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10)

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-Amylase (1,6 – glucoside trong isomaltose , panose vàcác dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có ở VSV nhưng đồng thờicũng có trong các hạt nảy mầm ( đại mạch, thóc nảy mầm ) Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệdextrinase của hạt ngũ cốc , hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R–Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-Amylase (6-Amylase (glucocanhydrolase Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase (Amylase vàβ-Amylase (Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn

Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là 5,1

3.5 Enzyme pullulanase (α-Amylase (dextrin6-Amylase (glucosidase) (EC 3.2.1.41)

Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-Amylase (1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và cácdextrin tới hạn Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-Amylase (1,6 có ảnh hưởng lớn đến tácđộng của Enzyme Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-Amylase (1,4 nằm liền kề bên liên kết α-Amylase (1,6

là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân cắt liên kết này

Pullulanase phân giải các liên kết α-Amylase (1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kếtα-Amylase (1,4 Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốcmaltose nối nhau bằng liên kết α-Amylase (1,6 glucoside Tác dụng hiệp đồng của α-Amylase (Amylase vàpullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn

3.6 α-Amylase (glucosidase hay maltase (α-Amylase (D,glucoside-Amylase (glucohydrolase) (EC 3.2.1.20)

Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này Giống như glucomylase, nó thủy phânmaltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột Maltase và glucozyltranferase là mộtEnzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-Amylase (1,4, trong các glucopiranoside vừa

có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu

4 Cơ chất tác dụng

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:

 Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ (như khoai lang,khoai tây, khoai mì… ), trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là(C6H12O6)n.Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin(Meyer, 1940) Các loại tinh bột đều có 20-Amylase (30% amylase và 70-Amylase (80% amylopectin Trong thựcvật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng:

• Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200-Amylase (1000 phân

tử D-Amylase (glucose nối với nhau bởi liên kết α-Amylase (1,4-Amylase (glucoside tạo thành một mạch xoắn dàikhông phân nhánh

• Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được cấu tạo từ

600-Amylase (6000 phân tử D-Amylase (glucose, nối với nhau bởi liên kết α-Amylase (1,4-Amylase (glucoside và α-Amylase (1,6-Amylase (glucosidetạo thành mạch có nhiều nhánh Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn hợpgồm nước và tinh bột bị đun nóng (60-Amylase (850C) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồtinh bột

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bịphân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và

đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếptục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose Cabohydrate trong thực phẩm là nguồncung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người Rau và quả cũng là nguồn cung cấptinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose.Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu làđường và tinh bột.

 Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật vàđược cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóaglucid ở tế bào động vật, vi sinh vật Glucogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhaubởi liên kết α-Amylase (1,4-Amylase (glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-Amylase (1,6-Amylase (glycoside Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột, phân tử lượng ở trong khoảng 2 -Amylase ( 3 triệu

Da Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thểchúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ Ở động vật và người, glycogen tập trungchủ yếu ở trong gan

II PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE

1 Đơn vị đo hoạt tính

Mục đích xác định hoạt tính Enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính Có một số cách định nghĩa như sau:

1.1 Đơn vị Enzyme quốc tế (UI) do hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) định nghĩa

Một đơn vị Enzyme là lượng Enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được 1micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1U = 1µmol sản phẩm = 1µmol cơ chất (10-Amylase (6mol)/phút

1.2 Đơn vị Katal

Năm 1979, hội đồng danh pháp của IUB khuyến cáo sử dụng đơn vị Katal làm đơn vị

cơ bản của hoạt tính Enzyme

Một Katal là lượng Enzyme xúc tác chuyển hóa được 1mol cơ chất sau 1giây ở điềukiện tiêu chuẩn

1Kat = 1mol cơ chất/giây = 60 mol/phút = 60.106 µmol/phút = 6.107 U

2 Hoạt tính riêng của Enzyme

-Amylase ( Hoạt tính riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩmEnzyme Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị Enzyme/mg protein (U/mg proteinhoặc Kat/kg protein)

-Amylase ( Hoạt tính phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi 1 phân tửEnzyme sau 1 phút

-Amylase ( Hoạt tính của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất được chuyển hóa trên 1 trungtâm hoạt tínhng sau 1 phút

 Hoạt tính xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sảnphẩm phản ứng tạo thành trên 1 đơn vị thời gian càng lớn

-Amylase ( Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biến

thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

* Có nhiều phương pháp xác định hoạt tính Enzyme Nhưng khi so sánh chất lượng giữacác chế phẩm với nhau thì phải dùng 1 phương pháp thống nhất

3.1 Xác định hoạt tính Enzyme α-Amylase (Amylase theo Rukhliadeva

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme α-Amylase (Amylase có trong dịchchế phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạothành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quangđiện sẽ tính được hoạt tính Enzyme

Đơn vị hoạt tính Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1g tinh bột tan thành cácdextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1 giờ

3.2 Xác định hoạt tính Enzyme γ-Amylase (Amylase (glucoAmylase)

Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong chếphẩm nghiên cứu Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt tính Enzyme.

Đơn vị hoạt tính glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tanpH= 4.7 ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ giải phóng được 1 mg glucose

3.3 Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase

Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoAmylase có trongdịch chế phẩm nghiên cứu Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệucủa Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt tính Enzyme

Đơn vị hoạt tính glucoAmylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan

pH = 4.7 ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 phút giải phóng được 1 μmol glucose.mol glucose

III ĐIỀU KIỆN CẦN VÀ ĐỦ ĐỂ THU NHẬN ENZYME AMYLASE

điều kiện nhất định nào đó Ta cần tìm cách phân lập và tạo ra các giống mới có hoạt tính

ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột biến, tách và cấy gen

Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng

Asp.awamori 78 -Amylase ( 2 và Asp.awamori 22 có hoạt tính Amylase cao hơn 2-Amylase (3 lần so với ban đầu.

2 Môi trường dinh dưỡng:

Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh trườngrắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổnghợp Amylase

Cám lúa mì thường chứa khoảng 20-Amylase (30% tinh bột, 10-Amylase (12% protit Ngoài ra còn chứamuối khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin

Để tiết kiệm cám người ta còn trộn thêm các nguyên liệu khác vào môi trường nhưtrấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia

Ở nước ta do không có cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bộtngô vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau

Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase có hoạt tính cao từ Asp.awamori là

cám 75% (hàm lượng tinh bột 29%), bột ngô 6% (hàm lượng tinh bột 55%) và 19% trấu Hàmlượng tinh bột chung là 25% Điều kiện tối ưu khi nuôi cấy là: to 32OC, độ ẩm 57% và nuôitrong 42 giờ

Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin Sự có mặt của glucose,fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sựtích tụ Amylase Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm mốc pháttriển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase

Ngoài gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đềucần đến chất chứa nitơ Tốt nhất là nguồn đạm vô cơ vì:

+ Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể bổ sung thêm từkhô lạc, khô đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure Khi đó lượng Enzyme được tổng hợpnhiều hơn

Ví dụ: Theo kết quả nghiên cứu của giáo sư Phenicxôva, nấm mốc Asp.awamori có thể

phát triển tốt trong môi trường chứa 0,05% đạm vô cơ nhưng để tạo α-Amylase (Amylose thì cần tăngnồng độ tới 0,15%, để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%

+ Nguồn đạm hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốcnhưng ít có hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme

Ví dụ: Khi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngô vào canh trường thì việc tích tụEnzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vô cơ Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươmmầm vào canh trường lại có tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme

Sự tạo thành và tích tụ Amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg2+, Ca2+ vàphotpho, đặc biệt là magie Trong môi trường thiếu Mg2+, Amylase hầu như không được tạothành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05% Sau Mg2+ là photpho, ion P đóng vai trò quan trọngtrong việc tạo thành acid nucleic Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng 0,1 -Amylase ( 0,2%

Canxi có trong thành phần của α-Amylase (Amylase Tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc

số ion canxi có trong phân tử

Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém Hoạt tính Amylase gắn liền với

sự có mặt của nhóm –SH Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảmbảo cho hoạt tính Amylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml Nếu giảm tới 0,004% hoạt tính

Amylase của Asp.orysee chỉ còn 50% và bằng 180 đv/100ml.

Bảng 1 Hoạt tính của một số chủng nuôi trên môi trường cám lúa mì theo phương pháp

3 Điều kiện nuôi cấy

Chủng giống và môi trường nuôi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đó ta còn phải chú

ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme Bao gồm:

phát triển của tạp khuẩn.Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà độ ẩm có thể khốngchế ở 50-Amylase ( 60%

Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhưng nấm mốccũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéo dài thời gian Do đó phải thựchiện tốt công việc vệ sinh

3.3 pH môi trường

pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, thường pH tự nhiên củamôi trường vào khoảng 5,5-Amylase (6,0 Nhưng lại có ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, nên cần

sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luôn trong giới hạn tối ưu

pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụEnzyme

Trong môi trường lỏng có những khác biệt Trong canh trường lỏng tế bào nấm mốcphân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của chúng với oxy phải thông qua canh trường , vì vậykhuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy có thể hòa tan vào dung dịch.dùng phổ biến nhất

IV THU NHẬN ENZYME AMYLASE:

1 Nguồn thu nhận:

-Amylase ( Để thu nhận Amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus (Asp.

oryzae, Asp niger, Asp usamii, Asp awamo-ri, Asp batatae) và Rhizopus (Rh delemar, Rh lonnesis, Rh neveus, Rh joponicum, Rh fokinesis, Rh lopninen-sis).

-Amylase ( Nấm men và giả nấm men thuộc giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsis,

Endomyces cũng tạo Amylase Đặc biệt người ta đã tuyển chọn được giống Endomycopsis specise 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ glucoAmylase.

-Amylase ( Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo một lượng lớn Amylase như: Bac.polymyxa,

Bac.cassavanum, Phytomonas destructans, Clostridium acetobutulicum, Pseudomanas saccharophila,…Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng tăng trưởng nhanh (4-Amylase (6 lần vi khuẩn ưa

ẩm), đặc biệt là Bac.circulans được phân lập từ đất sinh trưởng tốt ở 65-Amylase (70oC và tạo Amylasemạnh nhất ở 50oC Trong số các vi khuẩn ưa ẩm tạo Amylase mạnh, thì Bac.subtilis được

nghiên cứu nhiều hơn cả và được sử dụng rộng rãi nhất Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của

Hình 4 Quy trình công nghệ chung

Chuẩn bị môi trường

Phá vỡ tế bào

Nuôi cấy Vi sinh vật giống

Enzyme ngoại bàoEnzyme nội bào

Lọc hoặc lytâm

2 Giải thích quy trình

2.1 Nuôi cấy vi sinh vật giống

-Amylase ( Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phânlập và chọn giống vi sinh vật để tuyển lấy những chủng hoạt tínhng mạnh, đồng thời phải tiếnhành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoácác điều kiện nuôi Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tínhchất di truyền của vi sinh vật mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặchiệu

-Amylase ( Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quátrình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase Trong cácyếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi vi sinh vật thìthành phần môi trường, tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độthoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu tố cơ bản tối quan trọng

a Nuôi vi sinh vật tạo Amylase bằng phương pháp bề mặt:

-Amylase ( Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triểntrên bề mặt môi trường Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:

+ Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện Quy trình công nghệ không phức tạp

+ Lượng Enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so vớinuôi cấy chìm Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương phápnuôi cấy bề mặt hiện nay lại phát triển mạnh

+ Chế phẩm Enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật,Enzyme và nước) Sau khi thu nhận sẽ rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

+ Nuôi cấy bề mặt không cần nhiều sử dụng các thiết bị phức tạp, do vậy mà việcvận hành công nghệ cả việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém

+ Trường hợp nhiễm các vi sinh vật lạ, ta thường dễ dàng xử lý Môi trường đăc làmôi trường tĩnh, không bị xáo trộn nên khi khu vực nào bị nhiễm ta chỉ loại bỏ khu vực đó rakhỏi khối nuôi cấy Khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn

-Amylase ( Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: phương pháp này tốn khá lớn diện tíchnuôi cấy Phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng haymôi trường đặc) nên rất cần diện tích lớn

 Yêu cầu đối với môi trường thành phần dinh dưỡng

 Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo Amylasecũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo Enzyme khác.

 Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo Amylase bằng phương pháp lên men bềmặt là cám mì, cám gạo Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tửduy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các chất khác nữa

 Cám mì có 16-Amylase (22% tinh bột, 10-Amylase (12% protein, trong đó các amino acid quan trọngnhư methionine (0.19%), cystine (0.3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0.3%), 3-Amylase (4% chất béo, 10.3% celulose, các nguyên tố trơ (Na-Amylase (0.09% , K-Amylase (1% , Ca-Amylase (0.16% , P-Amylase (0.94% ) vàcác nguyên tố vi lượng cùng các chất khác Cám gạo có khoảng 20% tinh bột, 10-Amylase (15% chấtbéo, 10-Amylase (14% protein, 8-Amylase (16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37-Amylase (5 9 %)

 Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính của Enzyme Cámkhông được chứa tinh bột dưới 20-Amylase (30% Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vịđắng, không hôi mùi mốc Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0.05%

 Độ ẩm tối thích cuả môi trường

 Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58-Amylase (60% vàphải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi Độ ẩm mà tăng quá 55-Amylase (70%

sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50-Amylase (55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của

vi sinh vật cũng như sự tạo Enzyme Amylase

Bảng 2: Ảnh hưởng của việc giữ độ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-Amylase Amylase của Asp.Ozyrae nuôi bằng phương pháp bề mặt

Phương án thí

Nghiệm

Độẩm

%

Hoạt tính củaAmylase dv/gCanh trường khô

Độẩm

%

Hoạt tính củaAmylase dv/gCanh trường khô

Độẩm

%

Hoạt tính củaAmylase dv/gCanh trường khôKhay để hở 27.

Khay đậy nắp 26.

 Nhiệt độ nuôi :

 Thời kỳ trương và nảy mầm của bào tử đính (đối với nấm mốc 10-Amylase (11 giờ đầu tiên,đối với vi khuẩn 3-Amylase (4 giờ) Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ chonhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23-Amylase (300C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32-Amylase (380Ccho vi khuẩn Độ ẩm tương đối của không khí là 96-Amylase (100%

 Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4-Amylase (18 giờ) Ở giai đoạnnày nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn Kết quả là trong lớpsợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37-Amylase (400C , đôi khi cao hơn tới 470C Vì vậy cần phải

hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc đều và đẹp Ở nhà máy người ta thổi không khí

vô trùng có nhiệt độ 28-Amylase (290C và độ ẩm cao vào phòng nuôi

 Thời kỳ tạo Enzyme Amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10-Amylase (20 giờ) Trong thời kỳ nàycác quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh Các Enzyme Amylaseđược tổng hợp mạnh mẽ Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3-Amylase (

40C so với giai đoạn đầu Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môitrường rắn là 28-Amylase (300C , cho Bac.subtilis là 35– 370C

 Thời gian nuôi để có được lượng Amylase cực lớn thường được xác định bằng thựcnghiệm Sự tạo bào tử là một hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt tính của

Enzyme Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo Amylase cực đại thường kết thúc khi

nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi

để có thể tích lũy lượng Amylase cực đại đối với từng loại nấm mốc và vi khuẩn như sau:

b Nuôi vi sinh vật tạo Amylase bằng phương pháp bề sâu

 Môi trường dinh dưỡng

 Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi vi sinh vật tạo Enzyme Amylase là cóchất cảm ứng: tinh bột, dextrin hay maltose Nguồn nitơ dinh dưỡng thường dùng là nitơ vô

cơ (NaNO3)

 Đối với sinh trưởng của một số nấm sợi tạo maltase và oligo-Amylase (1,6-Amylase (glucoamylase hoạttính lại rất cần có sự có mặt của Mg trong môi trường Để tạo điều kiện cho vi sinh vật pháttriển tốt và sinh nhiều Amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết nhưnước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành

 Sục khí và khuấy trộn :

 Phần lớn vi sinh vật tạo Amylase là những vi sinh vật hiếu khí Vì vậy sinh trưởngcủa chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hoà tan trong dịch nuôi cấy.

 Việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới quá trình sinh trưởng vàtích luỹ sinh khối cũng như sinh tổng hợp các Enzyme của vi sinh vật Việc khuấy đảo có thểtiến hành bằng các cách:

 Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi

 Bằng máy móc chuyên dùng

 Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy

 Bằng tác dụng của các khí sinh ra khi lên men

 Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-Amylase (12m3 không khí vô trùng trên 1m3môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68-Amylase (72 giờ

Bảng 3 Nhiệt độ và pH của một số Enzyme Amylase do vi sinh vật tổng hợp

Asp.Awamori

α-Amylase (Amylase 4,5-Amylase (6,2 40β-Amylase (Amylase 3,5-Amylase (7,0 50GlucoAmylase 4,5-Amylase (4,7 55-Amylase (75

s α-Amylase (Amylase 5,7-Amylase (6,0 55-Amylase (60

2.2 Thu dịch Enzyme

a Đối với Enzyme nội bào nuôi bằng phương pháp bề mặt

 Giải phóng Enzyme bằng cách phá vỡ tế bào bằng nhiều cách như:

 Nghiền nhỏ với cát, thủy tinh

 Để tế bào tự phân hủy

 Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng dungdịch muối trung tính, dung môi hữu cơ.

 Kết tủa Enzyme bằng các chất điện ly thích hợp

b Đối với Enzyme ngoại bào nuôi theo phương pháp chìm

 Tách sinh khối và bã bằng cách lọc li tâm, lọc ép có sử dụng tác nhân trợ lọc(diatomit, đất hoạt tính) hoặc các tác nhân trợ kết tủa (CaCl2 + (NH4)2SO4 CaSO4, lắng cặnkéo theo sinh khối giúp lọc dễ hơn)

2.3 Cô đặc thu chế phẩm Enzyme thô

 Chế phẩm Enzyme thô chưa được tinh chế có thể chứa 1 vài loại Enzyme chủ yếu,một số loại protein không phải Enzyme, các chất ổn định và các tạp chất khác Dịch Enzymethu được thường có nồng độ chất khô thấp 4-Amylase (6 g/l, bước đầu cần cô đặc chân không ở nhiệt độ

350C đến nồng độ 15-Amylase (20 g/l rồi tiếp tục xử lý như sau :

-Amylase ( Tiếp tục cô đặc chân không ở nhiệt độ 40-Amylase (450C để đạt nồng độ chất khô 30-Amylase (35 g/l,

bổ sung thêm chất bảo quản như NaCl, glycerin, sorbitol, benzoat…ta sẽ thu đượcEnzyme thô ở dạng có thể bảo quản ở nhiệt độ thường được 1-Amylase (2 năm

-Amylase ( Bổ sung thêm các chất ổn định để đạt nồng độ chất khô 30-Amylase (40 g/l rồi sấy phun ở

nhiệt độ 1200C, chế phẩm kỹ thuật thu được ở dạng bột

-Amylase ( Kết tủa Enzyme bằng các dung môi thích hợp như: dung môi hữu cơ (ethanol,

izopropanol, aceton) hoặc muối trung tính phổ biến nhất là (NH4)2SO4 Sau khi litâm tách kết tủa có thể trộn thêm các chất ổn định rồi sấy khô và nghiền mịn để thuđược chế phẩm dạng bột

Hình 5 Máy cô đặc chân không 2.4 Thu chế phẩm Enzyme tinh khiết

a Tinh chế Enzyme :

-Amylase ( Hòa tan Enzyme thô dạng bột vào nước hoặc dung dịch muối CaCl2 ở nồng độthích hợp hoặc dung dịch đệm, kết tủa trở lại bằng ethanol, aceton hay (NH4)2SO4.Quá trình này cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp để tránh sự vô hoạtEnzyme Sau khi kết tủa các muối vô cơ được loại đi bằng phương pháp thẩm tích,thẩm thấu ngược hoặc lọc gel

-Amylase ( Tách Enzyme bằng phương pháp hấp phụ chọn lọc: cho dịch Enzyme chảy từ từ

qua cột chất hấp phụ (thường là oxit nhôm, silicagel) các Enzyme khác nhau sẽđược hấp phụ với khả năng khác nhau, sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp đểchiết rút Enzyme ra khỏi cột

-Amylase ( Tách Enzyme bằng phương pháp trao đổi ion: dựa vào sự trao đổi ion giữa Enzyme

có điện tích trái dấu với các ion của chất nhựa Sau khi cột đã no, cho dung dịch rửa(dung dịch chất điện giải) có nồng độ tăng dần chảy qua cột để đẩy ra khỏi nhựacác Enzyme vừa liên kết với chúng Khi đó Enzyme nào có áp lực liên kết với nhựakém nhất sẽ bị đẩy ra khỏi cột nhựa trước Như vậy các Enzyme khác nhau sẽ đượcchiết ra khỏi cột theo từng phần khác nhau trong đó chứa phần chiết có Enzyme cầnthu với nồng độ cao nhất

b Sấy khô thu Enzyme tinh khiết :

Sau khi làm sạch cần sấy khô chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa,thu Enzyme tinh khiết có hoạt tính cao hơn nhiều lần so với chế phẩm Enzyme thô

V THU NHẬN ENZYME AMYLASE TỪ ASPERGILLUS ORYZAE

1 Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae:

Asp.oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes (nang

khuẩn) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-Amylase (

7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào)

Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó

có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-Amylase (2 mm nên có thể

nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng nàyphân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bàohình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử Đính bào tử

của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…

Hình 6 Nấm mốc Aspergillus Oryzae

Đặc điểm của giống Asp.oryzae: giàu các Enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào

(Amylase, protease, pectinasa,…) Ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong cácthùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏingô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng…, docác bào tử già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và phát tán khắp nơi, khi gặpđiều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

 Chọn giống nấm mốc Aspergillus oryzae có các ưu điểm sau:

-Amylase ( Không sinh tổng hợp độc tố

-Amylase ( Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính cao

-Amylase ( Khả năng thích nghi nhanh và tốc độ sinh trưởng mạnh

-Amylase ( Điều kiện nuôi cấy: đơn giản

-Amylase ( Môi trường nuôi cấy: rẻ tiền, dễ tìm

-Amylase ( Dễ dàng tách được khỏi môi trường nuôi cấy lỏng để thu nhận enzyme ngoại bào

2 Quy trình len men và thu nhận Amylase theo phương pháp lên men bề mặt:

2.1 Quy mô phòng thí nghiệm:

Hình 6 Quy trình thu nhận amylase trong phòng thí nghiệm

2.2 Quy mô công nghiệp :

Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệu