Luận văn thạc sĩ sinh học ứng dụng xác định gen kháng thuốc của các chủng salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở hà nội

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI LUẬN VĂ[.]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN

XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC

CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC

THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI

TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN

XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC

CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC

THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI

TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện với sự giúp đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Nghiêm Ngọc Minh Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳ công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nhã Quyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của mình tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh - Trưởng phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu; phòng Đào tạo; khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, các quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Võ Thị Bích Thủy, ThS Nguyễn Hoài Thu

và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp

đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luôn luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm luận văn này

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể có được kết quả tốt hơn

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nhã Quyên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella 3

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 5

1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella 7

1.2.1 Đặc điểm hình thái 8

1.2.2 Đặc tính nuôi cấy 8

1.2.3 Đặc tính hóa sinh 10

1.2.4 Cấu trúc của Salmonella 10

1.2.5 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella 12

1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella 13

1.3.1 Ngộ độc thực phẩm 13

1.3.2 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella 14

1.4 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella 15

1.4.1 Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn 15

1.4.2 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella 15

1.5 Gen kháng kháng sinh 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Thu thập và phương pháp lấy mẫu 19

2.1.2 Hóa chất nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.1.1 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella 20

2.2.2 Định type vi khuẩn Salmonella 21

2.2.3 Thử khả năng kháng kháng sinh 21

2.2.4 Phương pháp xác định một số gen kháng kháng sinh của chủng Salmonella Typhimurium bằng phương pháp RT-PCR 22

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Thu thập mẫu ở một số loại thịt tươi 26

3.2 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp trên các môi trường cơ bản 27

3.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp trong mẫu thịt lợn, gà, bò 27

3.1.2 Kết quả giám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập được 29

3.2 Kết quả định type vi khuẩn Salmonella phân lập được 30

3.3 Kết quả xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được 32

3.4 Kết quả phát hiện và đánh giá gen kháng thuốc của các chủng Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được 35

3.4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số: Lựa chọn 3 chủng Salmonella Typhimurrium S181, S360, S384 để tiến hành tách chiết RNA 35

3.4.2 Kết quả RT-PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh của chủng

Salmonella Typhimurium 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

dNTP : deoxyribonucleotide triphosphates EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

PCR : Polymerase Chain Reaction

RT-PCR : Reverse transcription- Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi và nhiệt độ gắn mồi của các gen sử dụng trong

nghiên cứu 24 Bảng 3.1 Danh sách thu thập mẫu thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội 26

Bảng 3.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ các mẫu thịt 27

Bảng 3.3 Kết quả giám định đặc tính nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của

các chủng Salmonella spp trong quá trình phân lập 29

Bảng 3.4 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi

khuẩn Salmonella spp phân lập được 30

Bảng 3.5 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn

Salmonella spp 31

Bảng 3.6 Tổng hợp kết quả kháng các nhóm kháng sinh của 3 type

Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được 33

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá gen kháng kháng sinh của các chủng

Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella 8 Hình 2.1 Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella theo tiêu

chuẩn ISO 6579 - 2005 20 Hình 3.3 Kết quả mức độ kháng các nhóm kháng sinh của 3 type

Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được 33

Hình 3.4 Kết quả điện di đồ sản phẩm RNA tổng số của 3 chủng

Salmonella 1,2,3: S181, S360, S384 35

Hình 3.5 Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen 16S (550 bp) của

chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 36

Hình 3.6 Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen tetA (494bp), sull II

(434bp, avrA (192bp), aadA (228bp), blaTEM (310bp), gyrB (219bp), prmA (187bp) của chủng Salmonella Typhimurium S181,

S360, S384 M: thang chuẩn (DNA 1Kb) 37

Hình 3.7 Tỷ lệ biểu hiện gen tetA, sull II, avrA, aadA, blaTEM, gyrB,

prmA/16S rRNA của chủng Salmonella Typhimurium được phân tích bằng phương pháp RT-PCR Gen 16S rRNA được

dùng để so sánh 39

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là

do vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo nhưng ngộ độc thực phẩm vẫn đang gia tăng và ngày càng nghiêm trọng Theo số liệu thống kê của Cục vệ sinh

An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Tính riêng năm 2008, có 205 vụ ngộ độc thực phẩm, với 7828 người mắc, 161 người chết, trong đó 7,8% số vụ do nguyên nhân vi sinh vật gây ra Sáu tháng đầu năm 2014, có 67 vụ ngộ độc thực phẩm với 2048 người mắc, 24 trường hợp tử vong

Có rất nhiều loài vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như Clostridium butolinum, Escherichia coli, Listeria monocytogenes Trong đó, Salmonella

được biết đến là vi khuẩn hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm trên thế giới với các triệu chứng như buồn nôn, nhức đầu, sốt nhẹ, sau đó xuất hiện nôn mửa

và tiêu chảy nhiều lần, có thể lẫn máu Thường thì bệnh nhân có thể tự khỏi, nhưng đối với trẻ em, người già hoặc người bị suy giảm miễn dịch bệnh có thể gây nguy hiểm đến tính mạng Mặc dù nhiễm trùng đường ruột do các

chủng Salmonella thường tự khỏi, nhưng việc điều trị kháng sinh để ngăn

chặn quá trình lây lan nhiễm trùng vẫn là điều cần thiết

Việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị cả người và động vật có thể

ảnh hưởng đến khả năng kháng thuốc của Salmonella Các chủng Salmonella

gây ngộ độc thực phẩm kháng thuốc phân lập được là mối đe dọa trực tiếp đến sức khỏe của con người do các chủng kháng thuốc này sẽ cản trở việc điều trị và là mối đe dọa gián tiếp khi sự kháng có thể được chuyển giao cho các mầm bệnh khác ở người Do vậy việc giám sát tính mẫn cảm kháng sinh

là quan trọng và cần thiết

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và tầm quan trọng của việc bảo vệ sức

khỏe con người chúng tôi đã tiến hành đề tài "Xác định gen kháng thuốc của các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được gen kháng thuốc của chủng Salmonella gây ngộ độc

thực phẩm phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trong các mẫu thịt tươi (gồm:

thịt lợn, thịt gà, thịt bò) thu thập tại các địa điểm khác nhau trên địa bàn Hà Nội

- Nuôi cấy, phân lập và định type các chủng Salmonella từ các mẫu thịt, xác định các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm

- Kiểm tra sự biểu hiện của gen kháng thuốc từ chủng Salmonella

Typhymurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Xác định được các gen kháng thuốc của chủng vi khuẩn Salmonella

gây ngộ độc thực phẩm giúp cho việc nghiên cứu các bộ kit chẩn đoán nhanh

vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1891, Jensen đã phân lập được Salmonella Dublin từ bệnh phẩm của

bê bị tiêu chảy Cũng vào năm đó Salmonella typhimurium được phát hiện ở

vùng Greiswald và Breslau (Đức) Vào năm 1983, tại Breslau đã xảy ra một vụ ngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả ngộ độc đã xảy ra ở người [61]

Vi khuẩn Salmonella được phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh phó thương hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S choleraesuis var kunzendorf, S typhimurium và S typhisuis [28] Trong một vài trường hợp, ở lợn còn tìm thấy S dublin và S enteritidis Hai serotype S dublin và S enteritidis cũng gặp

ở lợn con đang theo mẹ

Từ những năm 1990 trở lại đây tỷ lệ nhiễm Salmonella ở Châu Âu đều không giảm, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên

người được phát hiện tuy nhiên con số thực tế có thể cao gấp 10 lần Salmonellosis là bệnh nhiễm trùng đường ruột phổ biến thứ hai tại Hoa Kỳ Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) ước tính có hơn

1 triệu người nhiễm Salmonella, ơ Mỹ mỗi năm và trung bình có khoảng 20.000 ca nhập viện và gần 400 trường hợp tử vong do nhiễm Salmonella, theo

một báo cáo năm 2011 [60] Tháng 11/2013, tại thành phố Brisbane của Queensland (Australia) cũng xảy ra vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng do vi

khuẩn Salmonella khiến 1 phụ nữ 77 tuổi thiệt mạng và hơn 220 người nhiễm bệnh Nguyên nhân gây ra vụ việc do vi khuẩn Salmonella có trong trứng, thịt

gia cầm và các loại thịt chưa được nấu chín [40] Theo thông tin mới nhất được công bố vào 2/4/2015 bởi tổ chức Y tế thế giới (WHO), cho thấy mối đe dọa từ các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm do vi khuẩn gây lên Những con số được

công bố khiến người tiêu dùng trên toàn thế giới không khỏi hoang mang Bao gồm 582 triệu các ca mắc phải một trong 22 căn bệnh truyền qua thực phẩm; 351.000 số ca tử vong liên quan đến an toàn thực phẩm trong đó có 52.000 ca

tử vong do vi khuẩn Salmonella gây nên, 37.000 số ca tử vong do vi khuẩn E.coli, 35.000 người chết do norovirus (loại virus là nguyên nhân hàng đầu gây

nên dịch bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm tại Hoa Kỳ), và 40% là tỷ lệ người ở độ tuổi dưới 5 mắc các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm

Điều đáng chú ý nhất ở vi khuẩn Salmonella là sự gia tăng khả năng

kháng thuốc của vi khuẩn này Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính

kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella đã được báo cáo nhiều ở các nước

phát triển và cả những nước đang phát triển (Báo cáo của Bộ Y tế, 2008) Các nhà nghiên cứu của Wellcome Trust đã lập bản đồ mã gen trên 1.832 đối

tượng nhiễm khuẩn Salmonella typhimurium thu thập từ 63 quốc gia trong

khoảng thời gian từ năm 1992 đến 2013 cho thấy gần một nửa số vi khuẩn không hề bị tiêu diệt bởi những loại kháng sinh theo quy chuẩn Trong nghiên cứu mô tả các dữ liệu từ các chương trình giám sát tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc trong thịt gà của Brazil (PREBAF) từ thời gian tháng 9/2004 đến tháng 7/2006 cho thấy trong 2.679 mẫu thịt gà thu thập được tại 15 bang thuộc 5 khu vực địa lý của đất nước có tới 8,9% (trung bình 2,7%) mẫu nhiễm

Salmonella spp Trong đó chủ yếu nhiễm 4 loài Enteritidis (48,8%), Infantis

(7,6%), Typhimurium (7,2%) và Heidelberg (6,4%), nhưng nguy hiểm là các chủng đa kháng thuốc xuất hiện với tỷ lệ cao 53,2% (133 chủng/250 chủng thử nghiệm kháng thuốc) [43] Trong nghiên cứu 236 mẫu nước sông ở Đài

Loan, có 54 mẫu (chiếm 22,9%) nhiễm Salmonella ssp, 15 chủng Salmonella

được phân lập xuất hiện cả một số typ thường gây nhiễm trùng cho người và gia súc, bao gồm Albany (27,8%), Newport (14,8%), Bareilly (13,0%), Derby (11,1%) và Typhimurium (7,4%) Đặc biệt 51,9% các mẫu kháng với ít nhất 1

trong 8 loại kháng sinh được thử nghiệm do trong các chủng vi khuẩn này tồn tại các gen kháng thuốc [43]

Các nhà khoa học cũng đã chứng minh rằng trong bộ gen của các loài

vi khuẩn Salmonella gây bệnh có một loạt các gen liên quan đến việc ứng phó

với điều kiện thiếu dưỡng chất, sức đề kháng kháng sinh, sự trao đổi chất sắt

và các phản ứng sốc nhiệt [58] Một số gen hilA, prgH, invF được phát hiện

có mối quan hệ rất lớn đến khả năng kháng tetracycline của 2 chủng vi khuẩn

Salmonella Typhimurium DT 104 và DT 193 [32] Ngoài ra, amR là một yếu

tố phiên mã của protein Rama, một yếu tố đa kháng quan trọng cũng được tìm

thấy trong vi khuẩn [72] hoặc các gen kháng thuốc của Salmonella Typhimurium và Salmonella Newport thường được đặt trên plasmid CMY-2

[39] Sahu (2013) cũng đã phát hiện ra 1 vùng đột biến tại locus 1 có khả năng

đa kháng thuốc ở vi khuẩn S typhimurium [59]

Hiện nay, trên thế giới vẫn tiếp tục có các nghiên cứu về các gen kháng

thuốc của vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là vi khuẩn Salmonella nhằm xác định chính xác cơ chế đa kháng thuốc của các vi khuẩn Salmonella

gây ngộ độc thực phẩm

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về sự ô nhiễm Salmonella đã được thực hiện và công bố Salmonella thường được tìm thấy trên thịt gà, thịt lợn,

đồ nguội, trứng sống, nghêu sò là nguyên nhân của 70% vụ ngộ độc Trong tổng số 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt qua kiểm tra đã phát hiện tới

40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây các bệnh về đường tiêu hóa Vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia súc cũng đã

được bắt đầu từ những năm 50 Viện Parteur Sài gòn trong những năm

1951-1953 đã phân lập được 6 chủng Salmonella ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng

từ nước tiểu) Cũng ở Sài gòn, trong thời gian này cũng đã phân lập được 35

chủng từ 360 lợn, trong đó có 23 mẫu là S choleraesuis [1]