Luận văn thạc sĩ sinh học ứng dụng đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập từ loài trung quân ancistrocladus cochinchinensis ở việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http //www lrc tnu edu vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGÔ THỊ HUỆ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI TRUNG QUÂN Ancis[.]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGÔ THỊ HUỆ

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI TRUNG QUÂN

Ancistrocladus cochinchinensis Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGÔ THỊ HUỆ

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ LOÀI TRUNG QUÂN

Ancistrocladus cochinchinensis Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Quỳnh Liên

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận văn tốt nghiệp với đề tài “Đánh giá hoạt tính

sinh học của một số hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus

cochinchinensis ở Việt Nam” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi dưới

sự hướng dẫn của TS Lê Quỳnh Liên và sự hỗ trợ của đề tài nghiên cứu cơ

bản “Nghiên cứu đa dạng các loài thuộc chi Trung quân (Ancistrocladus) ở

Việt Nam dựa vào phân tích hóa sinh và di truyền”, mã số: 104.01-2013.53,

do tiến sĩ Lê Quỳnh Liên là chủ nhiệm đề tài, không sao chép của bất cứ ai

Tôi xin chịu trách nhiệm về công trình nghiên cứu của mình

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016

Người cam đoan

Ngô Thị Huệ

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc của mình, tôi xin cảm ơn TS Lê Quỳnh Liên - Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và các anh/chị làm việc tại Phòng Tài Nguyên sinh vật đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn đề tài Nghiên cứu cơ bản: “Nghiên cứu đa dạng các

loài thuộc chi Trung quân (Ancistrocladus) ở Việt Nam dựa vào phân tích hóa sinh và di truyền”, mã số: 104.01-2013.53, do TS Lê Quỳnh Liên chủ nhiệm

đề tài đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Khoa học sự sống, các thầy cô giảng dạy tại trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và các thầy cô công tác tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong 2 năm học tập tại trường

Trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tôi luôn nhận được

sự động viên của bạn bè, đồng nghiệp và người thân trong gia đình

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016

Người cam đoan

Ngô Thị Huệ

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ thực vật 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Những nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên từ thực vật trên thế giới 5

1.1.4 Tình hình nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên từ thực vật tại Việt Nam 7

1.2 Một số hoạt tính sinh học cơ bản của thực vật 8

1.2.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật 8

1.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa 10

1.2.3 Hoạt tính gây độc tế bào 11

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu về Chi Trung quân (Ancistrocladus) 13

1.3.1 Đặc điểm, phân bố 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2 Phạm vi nghiên cứu 21

2.2.1 Phạm vi 21

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 21

2.2.3 Thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 09/2015-09/2016 22

2.3 Đối tượng, thiết bị nghiên cứu 22

2.3.1 Các hóa chất, thiết bị chuyên dùng 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh: 24

2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa thu dọn gốc tự do DPPH 25

2.4.3 Phương pháp thử độc tính tế bào 26

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của cây Trung quân (Ancistrocladus cochinchinensis) 29

3.1.1 Đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis 29

3.1.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis 37

3.1.3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài Trung quân Ancistrocladus cochinchinensis 38

KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ADN Axit Deoxyribo Nucleotit DMSO Dimethylsulfoxide

DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể

SRB Sulforhodamine B

SA Scavenging Activities Khả năng trung hòa gốc

oxy hóa tự do

SC Scavenging Concentration at 50% Nồng độ trung hòa được

50% gốc tự do HL-60 Human promyelocytic leukima Tế bào ung thư bạch cầu SK-MEL-2 Human skin caner Tế bào ung thư da

TCA Trichloroacetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số loài thực vật có hoạt tính kháng vi sinh vật 9

Bảng 1.2 Một số hợp chất chống oxy hóa từ thực vật 11

Bảng 1.3 Một số hợp chất có khả gây độc tế bào từ thực vật 13

Bảng 2.1 Tên gọi, ký hiệu các hợp chất nghiên cứu 20

Bảng 2.2 Danh sách và đặc điểm chính của các loài vi sinh vật thử nghiệm 23 Bảng 3.1 Khả năng ức chế vi khuẩn E.coli của 6 hợp chất phân lập 30

Bảng 3.2 Khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus 31

Bảng 3.3 Khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella tiphymurium 32

Bảng 3.4 Khả năng ức chế nấm Candida albicans 35

Bảng 3.5 Khả năng ức chế nấm A fumigatus 36

Bảng 3.6 Khả năng chống oxy hóa của hợp chất thử nghiệm 37

Bảng 3.7 Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư LU-1 39

Bảng 3.8 Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư HL-60 40

Bảng 3.9 Hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư SK-MEL-2 41

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ HÌNH

Hình 1.1 Cây trung quân (Ancistrocladus cochinchinensis) 14

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một số naphthylisoquinonline alkaloids tách

từ Ancistrocladus 15

Hình 1.3 Các Napthylisoquinoline alkaloid tách chiết từ Cây Trung quân

Ancistrocladus cochinchinensis 18

Hình 2.1 Mẫu lá dùng để phân lập hợp chất nghiên cứu 19 Hình 2.2 Mô hình cấu trúc hóa học của các hợp chất nghiên cứu 21 Hình 3.1 Hoạt tính ức chế của hợp chất AC1 (M1), AC4 (M4) đối với 3 loài

vi khuẩn 33

BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Giá trị SC50 của 6 hợp chất thử nghiệm và đối chứng 38 Biểu đồ 3.2: Phần trăm tế bào khối u bị ức chế ở nồng độ: 20µg/ml đối với

chất thử và 10µg/ml đối với đối chứng dương Ellipticine 41

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Từ xa xưa con người đã biết sử dụng một số loại thực vật để làm thực phẩm và làm thuốc chữa trị bệnh tật, vết thương Ngày nay, cùng với sự phát triển của các kỹ thuật tách chiết các hợp chất thiên nhiên, con người càng có

xu hướng sử dụng những sản phẩm từ thiên nhiên trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe

Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Tổng số loài thực vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước tính Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30% Kết quả điều tra nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc Trong thời gian qua, nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng năm Như vậy, nhu cầu

sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn Không những vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang được các nước trên thế giới hết sức quan tâm Trong đó có các loài thuộc chi Trung quân

(Ancistrocladus) hiện được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm bởi

thành phần hóa học đặc trưng và các tác dụng sinh học của chúng Chi Trung quân phân bố phổ biến ở vùng nhiệt đới châu Á và Tây Phi, người ta đã tìm thấy ở loài thực vật này một số hợp chất có alkaloid giá trị và naphthoquinon

có độc tính tế bào, tác dụng trên một số tế bào ung thư, kháng vi khuẩn và kháng nấm Theo y học cổ truyền, cây Trung quân có vị đắng, chát, tính bình, không độc, có công năng hành huyết, hóa ứ, trừ phong thấp, mạnh gân xương, giải nhiệt, trục ứ huyết, trừ đờm, giải độc Thường được dùng trị đau lưng, đau xương khớp, phong thấp, chân tay tê mỏi; nhất là trường hợp phụ nữ sau

đẻ, người mệt mỏi, đau nhức toàn thân, yếu sức [1] Ngoài ra, lá Trung quân

còn dùng trị đau bụng do lỵ và sốt rét Loài thực vật thuộc họ Trung quân Ancistrocladaceae này mọc khắp các khu rừng ở vùng Đông Dương, cũng gặp tại Trung Quốc (đảo Hải Nam) và Ấn Độ, mọc hoang ở miền rừng núi khắp nước ta như Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Bà Rịa Vũng Tàu [25] Tuy nhiên tại Việt Nam những nghiên cứu về cơ sở khoa học để sử dụng chi Trung quân làm thuốc còn rất hạn chế, chưa có nhiều công trình khoa học đánh giá đầy đủ về hoạt tính của các hợp chất tách chiết từ chi Trung quân

Nhằm tạo tiền đề cho việc tìm kiếm các hợp chất mới có giá trị y dược học trong chi Trung quân ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập từ loài Trung quân

Ancistrocladus cochinchinensis ở Việt Nam”

2 Mục tiêu của đề tài

Khảo sát hoạt tính sinh học cơ bản (kháng vi sinh vật, chống oxy hóa,

gây độc tế bào) của một số hợp chất phân lập từ loài A cochinchinensis tại

Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật (vi khuẩn và nấm) của các hợp

phân lập từ loài A.cochinchinensis;

- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ loài

A.cochinchinensis;

- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài

A.cochinchinensis

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ thực vật

1.1.1 Khái niệm

Hợp chất thiên nhiên (natural product) là các chất hóa học được sản sinh trong các cơ thể sống và có hoạt tính sinh học, dược học nhất định Các chất thứ cấp này hầu như không có chức năng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật mà được sản xuất như là kết quả của sự thích nghi của sinh vật với môi trường xung quanh hoặc hoạt động như một cơ chế bảo vệ chống lại kẻ thù để đảm bảo sự tồn tại của bản thân sinh vật đó [9]

Trong số các loài sinh vật, thực vật được đánh giá là nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học đa dạng và phong phú Theo ước tính sơ

bộ, có khoảng 200 nghìn loài thực vật tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong vòng đời của chúng.Với độ đa dạng cao về cấu trúc hóa học, các hợp chất thứ cấp thực vật này đã và đang đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc tìm kiếm các chất có tiềm năng y dược phục vụ bảo vệ sức khỏe cho con người

1.1.2 Phân loại

Các hợp chất có hoạt tính sinh học thường được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, các con đường sinh tổng hợp ra các nhóm hợp chất và hoạt tính

cơ bản của chúng Dựa vào tiêu chí đó, Bernhoft (2010) đã phân nhóm một số hợp chất có dược tính từ thực vật như sau:

Nhóm Glycoside: nhóm hợp chất này có cấu trúc cơ bản là gồm một hoặc nhiều nhóm saccharide (nhóm đường) Các nhóm hợp chất chính gồm cardiac glycoside, cyanogenic glycoside, saponin và anthraquinone glycoside [14] Một hợp chất nổi tiếng thuộc nhóm này là ginseng saponin được phân

lập từ các loài nhân sâm như Panax Ginseng C A Meyer và Panax

quinquefolius

Nhóm Flavonoid và Proanthocyanidin: Flavonid là nhóm hợp chất

có cấu trúc vòng 3 mạch vòng trung tâm, và các oligomer của Flavonoid tạo thành Proanthocyanidin Flavonid thành phần các sắc tố và phổ biến trong hầu hết các thực vật bậc cao Hoạt tính nổi trội của các hợp chất Flavonoid là ngăn chặn sự hình thành của các gốc oxy hóa t ự do, từ đó làm giảm quá trình oxy hóa [14] Có thể kể đến hợp chất rutin thuộc nhóm Flavonid được tách chiết từ nhiều loại thực vật họ cam chanh Citrus có tác dụng bảo vệ thành mạch [24]

Nhóm Tanin: là hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền vững với các proteinvà các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác như các amino axit và alkaloid Tanin kết hợp với protein tạo thành màng trên niêm mạc nên thường dùng làm thuốc săn da Tanin có tác dụng kháng khuẩn dùng làm thuốc súc miệng khi viêm niêm mạc miệng hoặc chỗ loét khi nằm lâu hoặc chữa viêm ruột, tiêu chảy Tanin kết tủa với kim loại nặng và alkaloid thường dùng để chữa ngộ độc đường tiêu hoá [14]

Nhóm Terpenoid: Terpenoid, đôi khi được gọi là isoprenoid, là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn và rất đa dạng, có nguồn gốc từ các đơn vị isoprene (năm carbon) lắp ráp và biến đổi theo hàng ngàn cách khác nhau Hầu hết là những cấu trúc đa vòng này khác nhau không chỉ ở nhóm chức năng mà còn ở bộ khung carbon cơ bản của chúng [14] Terpenoid là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng nhất và có số lượng lớn nhất và được sử dụng rộng rãi từ công nghiệp thực phẩm và đồ uống đến công nghiệp dược.Có thể

kể đến những ví dụ nổi trội về ứng dụng của các hợp chất terpenoid như menthol chiết xuất từ cây bạc hà, hay artemisinin là thành phần chính của thuốc chống sốt rét và taxol có tác dụng diệt các tế bào ung thư người [15]

Nhóm Resin: có cấu trúc hóa học gồm lipid kết hợp với một nhóm có khả năng tan trong nước Các hợp chất này thường tồn tại ở dạng lỏng, có đặc tính dính nên thường có đặc tính ức chế vi sinh vật, làm lành vết thương [14]

Nhóm Lignan: là những hợp chất có bộ khung 18 carbon hình thành từ

sự kết hợp 2 nhóm phenylpropanoid và những nhóm chức khác Nhóm lignans thực vật thường có hoạt tính ức chế vi sinh vật, chống oxy hóa [14]

Nhóm Alkaloid: là nhóm hợp chất chứa Nitơ dị vòng, có hàm lượng rất thấp trong thực vật Các hợp chất alkaloid gồm nhiều phân nhóm như: trophane alkaloid, pyrrolizidine alkaloid, isoquinoline alkaloid, methylxanthine alkaloid, pseudoalkaloid Hầu hết các hợp chất thuộc nhóm alkaloid có hoạt tính mạnh, thường lên hệ thần kinh và gây độc tế bào nên được sử dụng làm các thuốc giảm đau và tiêu diệt khối u [14]

Nhóm Furocoumarine và naphthodianthrone: đây là những hợp chất nhạy sáng ở thực vật, do vậy một số hợp chất nhóm này tách từ thực vật có thể được sử dụng để điều chế thuốc chống trầm cảm [14]

1.1.3 Những nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên từ thực vật trên thế giới

Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe Thống kê cho thấy, khoảng hơn 100 hợp chất từ 90 loài cây có thể được xem là các thuốc quan trọng hiện đang được sử dụng tại một hoặc nhiều nước, với khoảng 70% trong số này có nguồn gốc từ các loài thực vật đươc dùng trong y học truyền thống [7]

Từ lâu, vỏ cây canh kina đã được dùng làm thuốc trị sốt rét ở Nam Mỹ

Từ năm 1630, người ta đã biết dùng vỏ cây này để trị sốt và từ năm 1677 đã được sử dụng ở Luân Đôn (Anh) với tên “Vỏ Peru” Từ cây mọc hoang, năm

1792, các nhà khoa học đã tổ chức trồng trọt cây canh kina ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới, nhất là ở Angeri, Peru, Java sau đó là ở Malaysia, Việt Nam và Châu Phi (Camorun, Ghine) Đây là cây thuốc với 2 loại alkaloid chính là quinin và quinidin

Hóa học các hợp chất thiên nhiên thực sự bắt đầu bởi công trình của Serturner người đầu tiên phân lập được morphine, hợp chất nhóm alkaloid từ