Luận văn thạc sĩ sinh học phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây màng tang tại tỉnh phú thọ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  Nguyễn Phú Tâm PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG TẠI T[.]

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- - -  - - -

Nguyễn Phú Tâm

PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG

TANG TẠI TỈNH PHÚ THỌ

Chuyên ngành vi sinh vật học

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Phí Quyết Tiến

HÀ NỘI - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả đƣợc công bố trong luận văn

là hoàn toàn trung thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2016

Học viên

Nguyễn Phú Tâm

LỜI CẢM ƠN

chủ nhiệm đề tài VAST04.07/16-17 đã hết lòng giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tiếp theo, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô của trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật và các thầy, cô

gian tham gia khóa học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên, NCS

Quách Ngọc Tùng và các cán bộ phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ

sinh học đã chỉ bảo nhiệt tình, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2016

Học viên

Nguyễn Phú Tâm

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu 3

1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh 3

1.1.2 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh 4

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 5

1.1.3.1 Kháng ung thư, kháng viêm 5

1.1.3.2 Kiểm soát sinh học 7

1.1.3.3 Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội sinh 7

1.1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 9

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 10

1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 12

1.3 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu15 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 15

1.3.2 Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh và các hợp chất trao đổi thứ cấp 17

1.3.2.1 Gen chức năng pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa vòng thơm 17

1.3.2.2 Gen chức năng nrps 18

1.3.2.3 Đánh giá đa dạng gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS 18

1.3.3 Chất kháng sinh và kháng sinh điều trị ung thư nhóm anthracycline 20

1.4 Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng

tang 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.1.1 Mẫu cây Màng tang, chủng giống vi sinh vật 24

2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 24

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Lấy mẫu cây Màng tang 25

2.2.2 Phương pháp xử lý bề mặt mẫu 25

2.2.4 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn 26

2.2.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28 26

2.2.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin 26

2.2.5.2 Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử 27

2.2.5.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 27

2.2.6 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ 30

3.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang 32

3.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang 32

3.2.2 Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trường phân lập 33 3.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 34

3.3 Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh 35

3.3.1 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn 35

3.3.2 Xác định gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 39

3.3.3 Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline 41

3.4 Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MPT28 42

3.4.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 43

3.4.1.1 Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử 43

3.4.1.2 Đặc điểm sinh hóa 44

3.4.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn 45

3.4.2 Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn MPT28 46

3.4.2.1 Khuếch đại gen 16S rDNA 46

3.4.2.2 Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA 46

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI và IDA 21

Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập trên một

số môi trường đặc hiệu sau 6 tuần nuôi cấy 30

Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố trên các bộ phận của cây Màng tang 32

Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang được phân lập trên các loại môi trường khác nhau 33

Hình 3.4 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh được phân theo nhóm màu 35

Hình 3.5 Hoạt tính kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A)

Bacillus cereus ATCC 11778 (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh 37

Hình 3 6 Sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II của một số chủng xạ

khuẩn nội sinh đại diện 39

Hình 3 7 Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps của một số chủng xạ khuẩn nội

sinh đại diện 40

Hình 3 8 Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trường ISP1 và bề mặt chuỗi bào

tử (B) dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng MPT28 44 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0% 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 9 Bảng 1.2 Xạ khuẩn mới được phân lập từ các cây dược liệu 14 Bảng 1.3 Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh 16

Bảng 1.4 Tần xuất xuất hiện gen pks-I, nrps trong các phân nhóm xạ khuẩn

khác nhau 19 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA……… 28 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ mẫu cây Màng tang 31 Bảng 3.2 Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 25 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang 36 Bảng 3.3 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn 37 Bảng 3.4 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng sinh anthracycline của 14 chủng xạ khuẩn nội sinh 41 Bảng 3.5 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng MPT28 42 Bảng 3.6 Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau 43 Bảng 3.7 Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C 44 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của chủng MPT28 45 Bảng 3.9 Trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng MPT28 47

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ

1 ACCd Aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase

2 ACP Acyl carrier protein

5 DAB Deacetil baceatin

6 DNA Deoxyribonucleotide acid

10 HGT Horizontal gene transfer

12 IAA Indol-3-acetic acid

15 MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

16 NaOCl Sodium hypochlorite

17 NRPS Nonribosomal peptide synthetase

18 PKS Ppolyketide synthase

19 PKS-I Polyketide synthase I

20 PKS-II Polyketide synthase II

21 RNA Ribonucleic acid

22 RA Raffinose-histidine agar

23 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar

MỞ ĐẦU

Vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh là vấn đề nghiêm trọng và thu hút mối quan tâm rất lớn của cộng đồng Vì vậy, việc nghiên cứu, lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ưu tiên hàng đầu của các nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng như các loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng phụ tới sức khỏe của người bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra

Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật là một nguồn tự nhiên quan trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật và hỗ trợ điều trị chống

ung thư Chẳng hạn, cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) là cây bụi thuộc họ Lauraceae, trong quả Màng tang rất giàu tinh dầu, lượng tinh dầu tối

đa trong quả là khoảng 5% trọng lượng tươi Thành phần chính của tinh dầu

là citral có hoạt tính sinh học như chống viêm, chống oxy hóa, diệt côn trùng,

kháng khuẩn, chống ung thư Cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dược chất

trong tinh dầu của lá, vỏ cây và quả với 90% là cinnamaldehyde có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) Ngoài giá trị khoa học, thành phần của cây mang lại, cây dược liệu còn là môi trường cho các xạ khuẩn nội sinh (sống trong các loại mô thực vật) có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh Theo các nghiên cứu, ước tính khoảng 70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong y học lâm sàng hiện nay được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn Gần đây, một số công bố cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do xạ khuẩn nội sinh tạo ra trên cây dược liệu không chỉ có số lượng phong phú mà còn có sự đa dạng về chức năng như tính kháng vi sinh vật, chống ôxi hóa, chống sốt rét và kiểm soát sinh học Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang nói riêng và cây dược liệu nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Xuất phát từ những định hướng trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề

khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ”

Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm 3 nội dung chính:

- Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ

- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn nội sinh và xác định sự có mặt của ba gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases I (PKS-I), polyketide synthases II (PKS-II)

và nonribosomal peptide synthetase (NRPS)

- Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu

1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh

Hiện nay, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới công bố về tương tác giữa thực vật và vi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò như tác nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, phân giải phospho khó hoà tan, cố định nitơ tự do, tăng độ phì của đất [16], [53] Phần lớn các VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn được phân lập từ đất, vùng rễ, bề mặt hoặc trong các mô thực vật

Khái niệm xạ khuẩn nội sinh được đưa ra khi Smith và cộng sự (1957)

phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp có khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh [58]

Từ đó, đã có nhiều định nghĩa khác nhau về VSV nội sinh nhưng định nghĩa của Bacon và White (2000): „„VSV nội sinh là những VSV sinh trưởng trong

mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ‟‟ đã được các nhà VSV học thừa nhận [11] Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một

ý rất quan trọng: VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất [9]

Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi khả năng tổng hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [39] Song song với tác dụng dược lý thu nhận từ xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh vật học đã nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học (biocontrol) của xạ khuẩn nội sinh trong suốt hai thập

kỷ qua [61], [62] Xạ khuẩn đã được chứng minh khả năng tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [4] Những hiểu biết về sinh lý và mối tương tác phân tử giữa xạ khuẩn và thực vật là những đặc tính quan trọng để khai thác những đặc tính có lợi của xạ khuẩn nội sinh trong kích thích sinh trưởng thực vật và lĩnh vực khác

khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật là rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất

có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như: các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng [11], [51] Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới

1.1.2 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh

Xạ khuẩn cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thực vật [50]

Theo các công trình công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần

xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt Do đó, phải khử trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trước khi phân lập Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt Mẫu thực vật được ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43] Năm 1992, Sardi và cộng sự công bố sử dụng hơi của propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vì hóa chất khử trùng dạng lỏng [62] Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý

bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với qua trình phân lập VSV nội sinh