Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum 89 4.3.2.. Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các l
Trang 1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
NGUYỄN DUY HƯNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI, TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT
TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020
Trang 2HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
NGUYỄN DUY HƯNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI, TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG
NẤM Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT
TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG
Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật
Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Hà Viết Cường
2 TS Hoàng Chúng Lằm
HÀ NỘI - 2020
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố hay dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Tác giả luận án
Nguyễn Duy Hưng
Trang 4
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo; sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình; sự tài trợ, sự giúp đỡ cả về vật chất lẫn tinh thần của các tổ chức và cá nhân
Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc thầy PGS.TS Hà Viết Cường, TS Hoàng Chúng Lằm đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Bộ môn Bệnh cây, Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Nghiên cứu Rau quả đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Duy Hưng
Trang 5MỤC LỤC
Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3 1.4 Những đóng góp mới của đề tài 4 1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 2.1 Nguồn gốc, tình hình sản xuất ớt trên thế giới và Việt Nam 6 2.1.1 Lược sử về cây ớt 6 2.1.2 Tình hình sản xuất ớt trên thế giới 7 2.1.3 Tình hình sản xuất ớt ở Việt Nam 8 2.2 Nghiên cứu về bệnh thán thư hại ớt trên thế giới 9 2.2.1 Tầm quan trọng của bệnh thán thư 9 2.2.2 Phân loại nấm Colletotrichum 10 2.2.3 Thành phần nấm Colletotrichum gây hại trên ớt 13 2.2.4 Một số loài nấm Colletotrichum chính gây hại ớt 15 2.2.5 Xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 22 2.2.6 Khả năng truyền qua hạt ớt của nấm Colletotrichum 24 2.2.7 Đặc điểm sinh thái nấm Colletotrichum gây bệnh trên ớt 25 2.3 Phòng chống nấm Colletotrichum trên ớt 26 2.3.1 Biện pháp canh tác 26 2.3.2 Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh 26 2.3.3 Biện pháp hóa học 27
Trang 62.3.4 Biện pháp sinh học 28 2.4 Những nghiên cứu về bệnh thán thư hại ớt tại Việt Nam 30 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 33 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 33 3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 34 3.2 Nội dung nghiên cứu 35 3.2.1 Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 35 3.2.2 Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông
Hồng và một số tỉnh 35 3.2.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài nấm
3.2.4 Đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng Bacillus
spp và dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện
được trong điều kiện in vitro 36 3.3 Phương pháp nghiên cứu 36 3.3.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh thán thư 36 3.3.2 Phương pháp xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt 38 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, tính gây bệnh của
các loài Colletotrichum 41 3.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum của một số
loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y và vi khuẩn đối kháng trong điều kiện
in vitro 46 3.5 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 49 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 4.1 Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 51 4.1.1 Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng 51 4.1.2 Kết quả điều tra thực trạng bệnh thán thư hại ớt tại các điểm thu thập mẫu 52 4.1.3 Kết quả thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 56 4.1.4 Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm gây bệnh thán thư ớt 57 4.2 Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông
Hồng và một số tỉnh 59 4.2.1 Định danh nấm dựa trên giải trình tự gen các mẫu nấm đại diện thuộc các
nhóm hình thái xác định được 59
Trang 74.2.2 Tổng kết thành phần loài Colletotricum phát hiện trên cây ớt tại đồng
bằng sông Hồng và một số tỉnh 70 4.2.3 Phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum
gây hại trên cây ớt 72 4.2.4 Xác định thành phần, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum
gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh bằng PCR 84 4.3 Đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài Colletotrichum gây bệnh
thán thư ớt được thu thập 89 4.3.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của các
loài nấm Colletotrichum 89 4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm
4.3.3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm
4.3.4 Tính gây bệnh của các loài Colletotrichum thu thập 101 4.3.5 Xác định khả năng tồn tại của bào tử các loài nấm C siamense và
4.4 Đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng
Bacillus spp và dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum được
phát hiện trong điều kiện in vitro 114 4.4.1 Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến khả năng sinh trưởng, phát triển
của các loài nấm Colletotrichum phát hiện được trong điều kiện in vitro 115 4.4.2 Ảnh hưởng của một số mẫu vi khuẩn đối kháng Bacillus spp đến sinh
trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 136 4.4.3 Ảnh hưởng của một số dịch chiết địa y đến khả năng sinh trưởng của
nấm C siamense và C truncatum trên môi trường PDA 140 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 143 5.1 Kết luận 143 5.2 Kiến nghị 145 Danh mục các công trình công bố 146 Tài liệu tham khảo 147 Phụ lục 162
Trang 8DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ
bp Base pair (Cặp bazơ) BVTV Bảo vệ thực vật
CBTB Cấp bệnh trung bình CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CSB Chỉ số bệnh
CT Công thức CTAB cetyltrimethylammonium bromide ĐBSH Đồng bằng sông Hồng
DNA Deoxyrobonucleic acid
FAO Food and agriculture organization
(Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hiệp Quốc)
ha Hecta ITS Internal transcribed spacer
kb Kilo base PCA Potato Carrot Agar PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PDA Potato Glucose Agar
QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia s.l sensu lato = phức hợp loài s.s sensu stricto = loài đúng
TT Số thứ tự TLB Tỷ lệ bệnh
WA Water agar
µl Microliter
Trang 9DANH MỤC BẢNG
2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng ớt của thế giới (năm 2009 - 2018) 7 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng ớt Việt Nam (năm 2009 - 2017) 8 2.3 Thành phần loài Colletotrichum trên ớt tại một số quốc gia 14 3.1 Các mồi được sử dụng trong định danh phân tử nấm Colletotrichum 38 4.1 Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng trong
vụ xuân hè từ năm 2015 - 2017 52 4.2 Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng trong
vụ thu đông từ năm 2015 - 2017 52 4.3 Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2015 54 4.4 Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2016 55 4.5 Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2017 55 4.6 Triệu chứng mẫu bệnh thán thư thu thập tại các địa điểm 56 4.7 Đặc điểm hình thái các mẫu nấm thán thư hại ớt thu thập 58 4.8 Kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng gen 10 mẫu nấm Colletotrichum dựa
trên trình tự vùng ITS 60 4.9 Mức đồng nhất trình tự vùng ITS của 10 mẫu Colletotrichum gây bệnh
thán thư ớt tại thu tại Việt Nam với các loài thuộc phức hợp loài
C gloeosporioides s.l và các loài đã công bố gây bệnh thán thư ớt 61
4.10 Kết quả tìm kiếm trên GenBank 9 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán
thư ớt dựa trên trình tự vùng ApMat 65
4.11 Mức đồng nhất trình tự vùng ApMat của 9 mẫu Colletotrichum gây bệnh
thán thư ớt thu tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh với các loài thuộc
phức hợp loài C gloeosporioides s.l 67
4.12 Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C truncatum dựa trên trình tự ITS của
các loài Colletotrichum đã được công bố gây bệnh thán thư ớt 73
4.13 Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C gloeosporioides s.s dựa trên trình tự
ApMat của phức hợp loài C gloeosporioides s.l 74
4.14 Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C siamense dựa trên trình tự ApMat của
phức hợp loài C gloeosporioides s.l 75
Trang 104.15 Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C fructicola dựa trên trình tự ApMat của
phức hợp loài C gloeosporioides s.l 76
4.16 Đặc điểm 4 cặp mồi được thiết kế nhằm phát hiện C truncatum,
4.17 Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp của 4 cặp mồi thiết kế 80 4.18 Kết quả PCR so sánh hai phương pháp chiết DNA mẫu nấm 83
4.19 Phát hiện các loài Colletetotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập bằng PCR 85
4.20 Phân bố mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập tại đồng
bằng sông Hồng và một số tỉnh 87
4.21 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên các môi trường
dinh dưỡng 92 4.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài
4.23 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của các loài nấm
4.24 Kết quả lây nhiễm nhân tạo các loài nấm Colletotrichum trên một số giống ớt 106
4.25 Kết quả lây nhiễm các loài nấm Colletotrichum trên quả của một số ký chủ
hay nhiễm bệnh thán thư 109
4.26 Khả năng tồn tại của nấm C siamense và C truncatum trên lá ớt sau lây
nhiễm nhân tạo bằng phương pháp gây tổn thương 111 4.27 Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng sinh trưởng của các loài
nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 118 4.28 Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng nảy mầm bào tử của các
loài nấm Colletotrichum 120 4.29 Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng sinh trưởng của các
loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 123 4.30 Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng nảy mầm bào tử của
các loài nấm Colletotrichum 126 4.31 Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài
nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 128 4.32 Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của
các loài nấm Colletotrichum 131
Trang 114.33 Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài
nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 133 4.34 Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của các
loài nấm Colletotrichum 135 4.35 Ảnh hưởng của một số mẫu vi khuẩn đối kháng đến khả năng sinh trưởng
của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 138 4.36 Ảnh hưởng của một số dịch chiết địa y đến khả năng sinh trưởng của các
loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 140
Trang 12DANH MỤC HÌNH
2.1 Cây phân loại các loài nấm Colletotrichum dựa trên phân tích trình tự các
chuỗi gen CHS-1 (251 bp), ACT (305 bp), TUB2 (545 bp) và ITS (599 bp) với 9 nhóm (clade) được chỉ rõ bằng các màu khác nhau 12 2.2 Đặc điểm hình thái của nấm C truncatum 15 2.3 Phức hợp loài C gloeosporioides s.l gồm 23 loài 16 2.4 Đặc điểm hình thái của nấm C siamense 18 2.5 Đặc điểm hình thái của nấm C fructicola 19 2.6 Đặc điểm hình thái của nấm C aeschynomenes 20 2.7 Đặc điểm hình thái nấm C acutatum s.s: mẫu chuẩn (BRIP 52652) 21 2.8 Đặc điểm hình thái nấm C acutatum s.s: mẫu chuẩn (CBS 112996) 22 2.9 Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum 23 2.10 Cách xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum bằng cách hình thành
sợi nấm dưới biểu bì 24 2.11 Nấm C capsici hình thành tiền đĩa cành 25 3.1 Kỹ thuật cấy trên lam để quan sát hình thái đĩa áp nấm Colletotrichum 42 4.1 Số lượng mẫu bệnh thán thư ớt thu thập tại các địa điểm từ 2015 - 2017 56 4.2 Triệu chứng bệnh thán thư điển hình do nấm Colletotrichum spp gây hại
trên quả ớt 57 4.3 Đặc điểm bào tử phân sinh (a, b, c) và đĩa áp (d, e, f) của nấm
Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng Đại diện 3
nhóm hình thái C4 (a,d); C29 (b,e) và C25 (c,f) 59 4.4 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của các mẫu nấm
Colletotrichum thuộc phức hợp loài C gloeosporioides s.l và các loài
được công bố gây bệnh thán thư ớt 64 4.5 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ApMat của các mẫu nấm
4.6 Đặc điểm hình thái 5 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định
được tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh 72
Trang 134.7 PCR xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 4 cặp mồi đặc hiệu
4.8 Phản ứng PCR so sánh 2 phương pháp chiết DNA (CTAB và NaOH) từ
nấm Colletotrichum với 4 cặp mồi đặc hiệu 83 4.9 Phân bố các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt từ tất cả các địa
điểm (A) và các tỉnh đồng bằng sông Hồng (B) 87 4.10 Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum trên các môi trường
dinh dưỡng 93 4.11 Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum ở các điều kiện nhiệt
độ khác nhau 97 4.12 Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum ở các mức pH khác nhau 101 4.13 Lây bệnh nhân tạo các loài nấm Colletotrichum trên một số giống ớt 105 4.14 Lây bệnh nhân tạo các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt trên quả
chín của một số loại ký chủ hay nhiễm bệnh thán thư 110 4.15 Lây nhiễm nhân tạo bào tử nấm C siamense và C truncatum trên lá ớt
giống Demon bằng phương pháp gây tổn thương 112 4.16 Đặc điểm của bào tử nấm C siamense và C truncatum trên bề mặt lá ớt
giống Demon được lây nhiễm bằng phương pháp gây tổn thương 114 4.17 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường
dinh dưỡng chứa thuốc Azony 25SC ở các nồng độ khác nhau 119 4.18 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường
dinh dưỡng chứa thuốc Antracol 70WP ở các nồng độ khác nhau 124 4.19 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường
dinh dưỡng chứa thuốc Tiptop 250EC ở các nồng độ khác nhau 129 4.20 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường
dinh dưỡng chứa thuốc Score 250EC ở các nồng độ khác nhau 134 4.21 Khả năng đối kháng của 2 mẫu vi khuẩn HT1 và N2 đối với các loài nấm
4.22 Khả năng ức chế sinh trưởng của dịch chiết địa y đối với một số loài nấm