ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC KIỀU HỒNG NHUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE 2 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID Ở NGƯỜI BỆNH LAO
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
KIỀU HỒNG NHUNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE 2
LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID
Ở NGƯỜI BỆNH LAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA
Hà Nội – Năm 2019
Trang 2Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
KIỀU HỒNG NHUNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE 2
LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID
Ở NGƯỜI BỆNH LAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA
Khóa : QH 2013.Y Người hướng dẫn : PSG.TS Đinh Đoàn Long
ThS Phạm Thị Hồng Nhung
Hà Nội – Năm 2019
Trang 3Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành quá trình nghiên cứu khóa luận này, lời đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Đoàn Long, ThS Phạm Thị Hồng
Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người thầy đã
hướng dẫn trực tiếp, chỉ dạy nhiệt tình, tỉ mỉ và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức cũng
như kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện khóa luận
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS Vũ Thị Thơm – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội - cố vấn khoa học, người thầy đã luôn tận tâm giúp
đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi
có thể hoàn thành khóa luận này Đồng thời, tôi xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thu Hà,
thành viên cùng nhóm nghiên cứu đã luôn tích cực giúp đỡ, chỉ dạy tôi rất nhiều trong
quá trình thực hiện các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm
Tôi xin cảm ơn Bộ Khoa học và công nghệ và Chương trình Newton Fund Việt Nam đã tài trợ kinh phí cho đề tài nghiên cứu KHCN cấp nhà nước (Mã số
HNQT/SPĐP/01.16) do PGS.TS Lê Thị Luyến chủ trì, mà đây là một nhánh đề tài
trong nghiên cứu đó
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Phổi
Hà Nội và Bệnh viện 74 Trung Ương đã cung cấp các mẫu phẩm phục vụ cho nghiên
cứu Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô, các bạn thực tập tại Phòng thí
nghiệm – Bộ môn Y Dược học cơ sở đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
nghiên cứu
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong
quá trình học tập tại trường
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và yêu thương tới gia đình và bạn
bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá
trình thực hiện khóa luận này
Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2019
Tác giả
Kiều Hồng Nhung
Trang 4Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AFB Vi khuẩn kháng axit (Acid Fast Bacillus)
CYP2E1 Cytochrom P450 2E1
ddNTP Dideoxynucleotide
DHPLC Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance
liquid chromatography) DILI Tổn thương gan do thuốc (Drug-induced liver injury)
DNA Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid)
EDTA Chất chống đông Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
NAT2 Enzym N- Acetyltransferase 2
OD Mật độ quang học (Optical Density)
PCR Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase chain Reaction)
PGx Dược di truyền học (Pharmacogenetics/-nomics)
RFLP Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment
Length Polymorphism) SNP Đa hình di truyền đơn nucleotit (Singles nucletotide
polymorphisms) STD Liều điều trị tiêu chuẩn (Standard Treatment Dose)
WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)
Trang 5Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1 1 Ảnh hưởng của kiểu hình acetyl hóa tới chuyển hóa một số thuốc .4
Bảng 1 2 Một số SNP phổ biến ở gen NAT2 .7
Bảng 2 1 Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt 23
Bảng 3 1 Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2 27
Bảng 3 2 Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2 30
Bảng 3 3 Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam 30
Trang 6
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1 1 Một số phản ứng chuyển hóa được xúc tác bởi NAT2 .4
Hình 1 2 Cấu trúc và vị trí gen NAT2 trên nhiễm sắc thể số 8 5
Hình 1 3 Ảnh hưởng ở mức độ phân tử của các SNP NAT2 .8
Hình 1 4 Tỉ lệ mắc bệnh lao tại một số khu vực trên thế giới năm 2017 .9
Hình 1 5 Chuyển hóa isoniazid ở gan 12
Hình 1 6 Số lượng người gặp tác dụng phụ của isoniazid từ 1997-2018 13
Hình 2 1 Các bước tiến hành nghiên cứu 20
Hình 2 2 Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit 21
Hình 2 3 Trình tự đoạn gen NAT2 được nhân dòng để xác định kiểu alen 22
Hình 2 4 Kết quả dự kiến cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7 23
Hình 3 1 Kết quả DNA tổ ng điện di trên gel agarose 1,2% 26
Hình 3 2 Kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5% 27
Hình 3 3 Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu 28
Hình 3 4 Phân tích kiểu gen NAT2 dựa vào PCR - RFLP 28
Hình 3 5 Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9 30
Hình 4 1 Các tần số phân bố của alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 tại một số vùng và khu vực trên thế giới 34
Hình 4 2 Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm trên 99 quần thể trên thế giới 35
Hình 4 3 Nồng độ INH sau 2 giờ của mỗi kiểu hình acetyl hóa 36
Hình 4 4 Tỷ lệ tổn thường gan do INH gây ra (INH-DILI) theo thời gian trong số 172 người bệnh 37
Trang 7Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Tổng quan về enzym N-Acetyltransferase 2 (NAT2) 3
1.2 Tổng quan về gen N-Acetyltransferase 2 5
1.2.1 Vị trí, c ấu trúc và vai trò của gen NAT2 5
1.2.2 Đa hình gen N-Acetyltransferase 2 6
1.3 Đặc điểm chung về bệnh lao và vai trò của isoniazid trong điều trị lao 9
1.3.1 Đặc điểm chung về bệnh lao 9
1.3.2 Điều trị và dự phòng lao 10
1.3.3 Isoniazid trong điều trị lao 11
1.3.3.1 Dược lý, chuyển hóa của isoniazid 11
1.3.3.2 Độc tính của INH với cơ thể 12
1.3.4 Gen liên quan đến chuyển hóa isoniazid ở người 14
1.4 Các nghiên cứu về đa hình di truyền NAT2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở người bệnh lao 15
1.5 Các phương pháp phân tích đa hình NAT2 16
CHƯƠNG 2 ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1 Vật liệu nghiên cứu 19
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19
2.1.2 Hóa chất 19
2.1.3 Thiết bị 19
2.2 Phương pháp nghiên cứu 20
2.2.1 Thu mẫu sinh phẩm 21
2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 21
2.2.3 Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR 22
2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 23
2.2.5 Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP 23
Trang 8Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
2.2.6 Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp giải trình tự 24
2.2.7 Xác định tần số của các SNP và dự đoán kiểu hình acetyl hóa 24
2.3 Đạo đức nghiên cứu 25
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26
3.1 Tách chiết DNA tổng số 26
3.2 Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR 26
3.2.1 Tối ưu quy trình PCR 26
3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 của 100 mẫu nghiên cứu 27
3.3 Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP 28
3.4 Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình tự 29
3.5 Kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2 30
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 32
4.1 Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2 32
4.1.1 Phương pháp PCR-RFLP 32
4.1.2 Phương pháp giải trình tự 32
4.2 Về đa hình di truyền NAT2 33
4.2.1 Tần số alen và tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa 33
4.2.2 Về mối liên quan giữa NAT2 và một số bệnh khác 39
KẾT LUẬN 40
KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 9Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis là một trong các bệnh nhiễm
trùng mạn tính phổ biến nhất ở người Bệnh gây nên các triệu chứng chủ yếu trên
đường hô hấp, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe và cuộc sống của người bệnh Theo
công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam hiện đứng thứ 16/30 nước có
gánh nặng bệnh lao cao nhất thế giới với số lượng người mới mắc năm 2017 là
124.000 người trong đó 12.840 người tử vong do lao [40]
Sau khi chẩn đoán mắc bệnh lao, người bệnh thường điều trị theo phác đồ của Chương trình Chống lao Quốc gia [1] Theo đó các thuốc chống lao hàng 1 gồm có 5
thuốc: Isoniazid (INH), Rifampicin, Ethambutol, Pyrazinamid, Streptomycin [1]
Trong đó, Isoniazid là thuốc then chốt trong điều trị và dự phòng lao do hiệu lực kìm
và diệt vi khuẩn lao cao Đối với các người bệnh lao mới mắc và không đa kháng
thuốc, hầu hết đều đáp ứng điều trị tốt với phác đồ hàng 1, tuy nhiên một tỷ lệ nào đó
gặp phải các tác dụng không mong muốn, một phần khác thất bại trong điều trị Nhiều
trường hợp điều trị thất bại và gặp các tác dụng phụ đã được một số nghiên cứu trên
thế giới trước đây chỉ ra liên quan đến đột biến gen N- Acetyltransferase 2 (NAT2) gây
ra kiểu hình acetyl hóa chậm Tùy vào vị trí đột biến mà làm biến đổi hoạt tính, cấu
trúc và độ bền enzym làm ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa isoniazid và các thuốc
chuyển hóa bởi NAT2 như hydralazin, procainamid, aminoglutethimid, sufasalazin,
nitrazepam, dapson [24] Kiểu gen NAT2 quy định kiểu hình acetyl hóa với 3 kiểu
hình acetyl hóa là acetyl hóa nhanh, acetyl hóa trung bình và acetyl hóa chậm [44]
Một số nghiên cứu đã chứng minh, người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy
cơ tổn thương gan, gặp các tác dụng phụ và tỉ lệ thất bại khi điều trị với các thuốc
chuyển hóa bởi NAT2 cao hơn 2 kiểu hình còn lại [23, 46] NAT2 ngoài liên quan đến
chuyển hóa một số thuốc nêu trên, nó còn đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa
một số hợp chất gây ung thư Một số nghiên cứu chỉ ra sự liên quan giữa kiểu hình
acetyl hóa và nguy cơ ung thư vú, ung thư bàng quang, ung thư đại trực tràng [10, 35]
Trong các đột biến liên quan đến kiểu hình acetyl hóa, 6 alen NAT2*5 (c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11 (c.481C>T),
NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) được ghi nhận phổ biến và được nghiên
cứu nhiều nhất ở một số quần thể trên thế giới [36, 37] Việc xác định đột biến trên
gen NAT2 nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa biến đổi di truyền và đáp ứng thuốc có
thể giúp các bác sĩ lâm sàng cân nhắc điều chỉnh liều điều trị INH, hạn chế tác dụng
phụ của thuốc, qua đó nâng cao hiệu quả điều trị cho người bệnh Đây chính là xu
Trang 10Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
hướng tối ưu hóa điều trị theo cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền trong phác đồ điều
trị đang được phát triển và mở rộng ứng dụng nhanh chóng trên thế giới Tuy vậy, ở
Việt Nam, việc nghiên cứu cũng như ứng dụng quy trình phân tích kiểu gen NAT2 vào
thực hành lâm sàng hầu như mới chỉ bắt đầu Từ nhu cầu lâm sàng và tính cấp thiết
của việc tích hợp xét nghiệm gen NAT2 trong liệu trình chẩn đoán, điều trị người bệnh
mắc lao, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phân tích
một số đa hình gen N-acetyltransferase 2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở
người bệnh lao” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:
Mục tiêu nghiên cứu:
- Xây dựng được quy trình phân tích một số đa hình di truyền gen NAT2 ở
người bệnh mắc lao tại Việt Nam
- Áp dụng được quy trình đã tối ưu để bước đầu đánh giá mức độ đa hình di
truyền gen NAT2 trên 100 mẫu người bệnh lao ở Việt Nam
Nội dung nghiên cứu:
- Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen mã hóa enzym NAT2
- Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự
- Khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen liên quan đến 6 đa hình SNP gồm
NAT2*5 (c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11 (c.481C>T), NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) ở nhóm người bệnh
tham gia nghiên cứu
Trang 11Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về enzym N-Acetyltransferase 2 (NAT2)
Như chúng ta đã biết, hiệu lực của nhiều loại thuốc và các chất ngoại lai từ môi trường tới cơ thể ngoài việc phụ thuộc vào các cơ chế truyền tin (cơ chế dược lực
học), còn phụ thuộc vào sự chuyển hóa và thải trừ thuốc của cơ thể (các cơ chế dược
động học) Trong các con đường chuyển hóa và thải trừ thuốc, sự acetyl hoá các thuốc
bởi enzym N-Acetyltransferase (NAT, EC 2.3.1.5) [24, 62] là một cơ chế chuyển hoá
quan trọng giúp cơ thể tránh khỏi các phản ứng quá khích với thuốc và các chất độc
hại từ môi trường Nhiều loại thuốc và hóa chất trong cơ thể có thể được NAT chuyển
thành các chất không độc và loại khỏi cơ thể, trong đó có cả các chất có khả năng gây
ung thư và gây độc cho cơ thể [14] NAT là enzym xúc tác phản ứng acetyl hóa, qua
đó có xu hướng chuyển một chất gây độc cho cơ thể thành chất không hoặc ít độc
NAT xúc tác phản ứng gồm N-Acetyl hóa, O-Acetyl hóa và N,O-Acetyl hóa, trong đó
N-acetyl hóa (Hình 1.1) được chỉ ra là con đường hiệu quả nhất thực hiện biến đổi
sinh học các hợp chất amin thơm, hydralazin và một số chất gây ung thư [14] NAT ở
người bao gồm 2 loại là N-Acetyltransferase 1 (NAT1) và N-Acetyltransferase 2
(NAT2) Enzym NAT1 có vai trò trong sự chuyển hóa các hợp chất folat, trong khi đó
NAT2 đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa một số hợp chất amin thơm và dị
vòng như isoniazid (một loại thuốc chống lao), hydralazin và endralazin (thuốc điều
trị tăng huyết áp), procainamid (thuốc điều trị loạn nhịp tim), aminoglutethimid ( một
chất ức chế tổng hợp hormon của tuyến thượng thận), nitrazepam (thuốc an thần) và
dapson (thuốc điều trị bệnh phong) (Bảng 1.1) [24]
NAT2 được phân bố chủ yếu ở gan, một phần ở ruột non và đại tràng trong khi NAT1 có ở hầu hết các mô trong cơ thể [14] Các gen mã hóa cả hai protein đều có
khung đọc mở dài 870 bp trên nhánh ngắn (vùng 22) của nhiễm sắc thể số 8 (vùng
8p22) [54] Các biến thể di truyền trên gen NAT1 và NAT2 quyết định kiểu hình
acetyl hóa của mỗi cá thể ảnh hưởng đến đáp ứng với nhiều thuốc và các chất có nguy
cơ gây ung thư Tùy vào trình tự các nucleotid trên NAT2 của mỗi cá thể mà phân
chia ra ba nhóm kiểu hình là acetyl hóa là nhanh, trung bình và chậm [15] Mối liên
quan giữa kiểu hình acetyl hóa (được quyết định bởi NAT2) và nguy cơ mắc các bệnh
khác nhau đã được báo cáo từ nhiều năm nay Năm 1960, lần đầu tiên các đa hình của
NAT2 được nghiên cứu liên quan đến chuyển hóa isoniazid, sau đó các nghiên cứu
tiếp theo chứng minh sự liên quan đến các thuốc khác được đưa ra nhiều hơn, và ngày
càng chứng minh được tầm quan trọng của NAT đối với cơ chế giải độc của cơ thể
[12]