Khóa luận tốt nghiệp ngành dược sĩ tìm kiếm một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng hạ đường huyết hướng điều trị tiểu đường tuýp 2 sử dụng phương pháp in silico

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC SINH VIÊN PHẠM THỊ THU UYÊN ********** ĐỀ TÀI TÌM KIẾM HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT HƢỚNG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƢỜNG TUÝP 2 SỬ DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SILIC[.]

KHOA Y DƯỢC

SINH VIÊN: PHẠM THỊ THU UYÊN

**********

ĐỀ TÀI TÌM KIẾM HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT HƯỚNG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG TUÝP 2 SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP

IN SILICO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

Lời cảm ơn

Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới người thầy của tôi – TS Phạm Thế Hải, người thầy đã ân cần quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi từ những bước đi chập chững đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học và trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Hà Thị Thanh Hương công tác tại Khoa Y Dược, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nhận và thực hiện đề tài

Tôi cũng xin được cảm ơn cô Lê Thị Thu Hường đã dẫn dắt tôi trong những bước đi đầu tiên thực hiện khóa luận của mình

Tôi xin cảm ơn người bạn trong nhóm nghiên cứu của mình, em Lại Đức Anh

đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi cũng vô cùng biết ơn và xin được chân thành cảm ơn, các thầy cô ở bộ môn Dược liệu và dược học cổ truyền, các thầy cô ở Phòng đào tạo & CTHSSV, cũng như các thầy cô trong Hội đồng chấm Khóa luận tốt nghiệp đã hết sức nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ tôi và tất cả những người thân trong gia đình đã luôn ở bên yêu thương, ủng hộ để tôi có được ngày hôm nay!

Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2020

Phạm Thị Thu Uyên

KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: PHẠM THỊ THU UYÊN

**********

ĐỀ TÀI TÌM KIẾM HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT HƯỚNG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG TUÝP 2 SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP

IN SILICO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC SĨ

Khóa: QH - 2015Y Người hướng dẫn: TS PHẠM THẾ HẢI

ThS HÀ THỊ THANH HƯƠNG

HÀ NỘI - 2020

i

Lời cảm ơn

Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới người thầy của tôi – TS Phạm Thế Hải, người thầy đã ân cần quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi từ những bước đi chập chững đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học và trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Hà Thị Thanh Hương công tác tại Khoa Y Dược, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nhận và thực hiện đề tài

Tôi cũng xin được cảm ơn cô Lê Thị Thu Hường đã dẫn dắt tôi trong những bước đi đầu tiên thực hiện khóa luận của mình

Tôi xin cảm ơn người bạn trong nhóm nghiên cứu của mình, em Lại Đức Anh

đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi cũng vô cùng biết ơn và xin được chân thành cảm ơn, các thầy cô ở bộ môn Dược liệu và dược học cổ truyền, các thầy cô ở Phòng đào tạo & CTHSSV, cũng như các thầy cô trong Hội đồng chấm Khóa luận tốt nghiệp đã hết sức nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ tôi và tất cả những người thân trong gia đình đã luôn ở bên yêu thương, ủng hộ để tôi có được ngày hôm nay!

Hà Nội, ngày 10, tháng 6, năm 2020

Phạm Thị Thu Uyên

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

CSDL Cơ sở dữ liệu

CVD Bệnh tim mạch

DPP4 Dipeptidyl peptidase-4

ĐTĐ Đái tháo đường

IC50 Nồng độ ức chế 50%

IDF Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới

GIP Peptide insulinotropic phụ thuộc glucose

GLP-1 Peptide giống glucagon 1

GLUT2 Vận chuyển glucose loại 2

HbA1c Huyết sắc tố glycosyl hóa

LADA Latent Autoimmune Diabetes of Adulthood

PPARγ Thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator γ (Peroxisome

proliferator-activated receptors gamma) QSAR Mô hình liên quan giữa cấu trúc và tác dụng

RMSD Root mean square deviation (Độ lệch căn quân phương)

ROS Loại oxy phản ứng

iii

SGLT2 Protein đồng vận chuyển glucose 2 ( Sodium-glucose cotransporter-2) SMILES Simplified Molecular Input Line Entry Specification

STZ Streptozotocin

TrS Tập huấn luyện (Training set)

TS Tập kiểm tra (Test set)

TSPT Tham số phân tử

TZD Thiazolidinedione

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ viii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường 1

1.1.1 Khái niệm 1

1.1.2 Phân loại 1

1.1.3 Các liệu pháp hiện tại cho ĐTĐ tuýp 2 4

1.2 Mô hình in silico trong nghiên cứu phát triển thuốc mới 8

1.3 Đại cương về QSAR 10

1.4 Kỹ thuật Protein docking 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu 14

2.1.1 Dữ liệu các chất có hoạt tính dùng để xây dựng mô hình QSAR 14

2.1.2 Dữ liệu các chất có hoạt tính dùng để xây dựng mô hình phân biệt 15

2.1.3 Cơ sở dữ liệu dùng để sàng lọc hoạt tính 15

2.1.4 Cấu trúc tinh thể của các protein dùng trong nghiên cứu Docking 15

2.2 Thiết bị, phần mềm 16

2.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Xây dựng mô hình QSAR dự đoán hoạt tính trên các đích ĐTĐ tuýp 2 đã chọn 18

2.4.2 Sàng lọc in silico các hợp chất thiên nhiên hướng tác dụng trên đích ĐTĐ tuýp 2: PPARγ và SGLT2 22

2.4.3 Mô phỏng protein docking 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Kết quả nghiên cứu 25

3.1.1 Kết quả xây dựng hai mô hình QSAR trên phần mềm MobyDigs cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng sinh học trên từng đích phân tử là PPARγ và SGLT2 hướng điều trị ĐTĐ tuýp 2 25

3.1.2 Kết quả sàng lọc được một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng điều trị tiểu đường tuýp 2 sử dụng hai mô hình QSAR đã xây dựng 25

v

3.1.3 Kết quả kiểm tra tác dụng của các hợp chất đã sàng lọc qua mô hình in vivo 27

3.2 Bàn luận 28

3.2.1 Đánh giá kết quả xây dựng hai mô hình QSAR trên phần mềm MobyDigs cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng sinh học trên từng đích phân tử là PPARγ và SGLT2 hướng điều trị ĐTĐ tuýp 2 28

3.2.2 Về các hợp chất đã sàng lọc theo hai mô hình QSAR đã xây dựng 33

3.2.3 Đánh giá lại tác dụng của các hợp chất đã sàng lọc qua mô hình máy tính in vivo 35

KẾT LUẬN 39

KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các liệu pháp điều trị ĐTĐ hiện đang được phép sử dụng 5

Bảng 2.1 Các phần mềm tính tham số phân tử thông dụng 19

Bảng 3.1 Các hợp chất có tác dựng đồng thời trên 2 đích phân tử là PPARγ và SGLT2 26

Bảng 3.2 Các hợp chất được dự đoán là có hoạt tính in vivo 28

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá nội và đánh ngoại mô hình QSAR 30

Bảng 3.4: Bảng ý nghĩa các của các tham số phân tử trong mô hình QSAR trên đích PPARγ 31

Bảng 3.5: Bảng ý nghĩa các của các tham số phân tử trong mô hình QSAR trên đích SGLT2 32

Bảng 3.6 Giá trị Score của các hợp chất trong Docking trên 2 đích phân tử 33

Bảng 3.7 Kết quả Docking của 4 hợp chất đã sàng lọc được trên đích PPARγ 35

Bảng 3.8 Kết quả Docking của 4 hợp chất đã sàng lọc được trên đích SGLT2 36

Bảng 3.9 Một số thông tin về các hợp chất thu được sau quá trình sàng lọc 37

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Quá trình nghiên cứu phát triển thuốc 9

Hình 2.1 Cấu trúc khung các chất chủ vận PPARγ trong cơ sở dữ liệu 14

Hình 2.2 Cấu trúc 3D của thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator-γ 15

Hình 2.3 Cấu trúc 3D của Protein đồng vận chuyển natri - glucose 2 16

Hình 2.4 Quá trình nghiên cứu đề tài tìm kiếm hợp chất hợp chất thiên nhiên có tác dụng trên các đích điều trị ĐTĐ tuýp 2 (PPARγ và SGLT2) theo mô hình in silico và in vivo 18

Hình 3.1 Khả năng kích thích thực tế so với số liệu tính toán của tập dữ liệu các chất kích hoạt PPARγ 29

Hình 3.2 Khả năng ức chế thực tế so với số liệu tính toán của tập dữ liệu các chất ức chế SGLT2 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thống kê từ liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (International Diabetes Federation) năm 2015 cho thấy, ước tính có khoảng 415 triệu người (nằm trong độ tuổi từ 20-79) mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và hơn 5 triệu ca tử vong trên tổng

số 111 nước được nghiên cứu [38] Khoảng 75% những người mắc và chết do tiểu đường đến từ các nước có thu nhập thấp và trung bình Trong đó bệnh đái tháo đường tuýp 2 chiếm hơn 90% các trường hợp mắc Số ca mắc và tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường đều tăng đều đặn trong vài thập kỷ qua Các liệu pháp ngăn ngừa và điều trị hiện tại mặc dù có hiệu quả, tuy nhiên cũng còn nhiều hạn chế như: sử dụng

Biguanide sẽ gây ra các vấn đề về tiêu hóa, Sulfonylureas gây hạ đường huyết, tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch Mặt khác chi phí trực tiếp cần thiết cho việc theo dõi lâu dài bệnh tiểu đường và các biến chứng của nó là một gánh nặng đáng kể đối với các nền kinh tế quốc gia Người ta ước tính rằng 12% chi phí chăm sóc sức khỏe toàn cầu được chi cho bệnh tiểu đường và tỷ lệ mắc trên toàn thế giới dự kiến sẽ tăng từ 8.8% trong năm 2015 lên 10,4% vào năm 2040 Gánh nặng kinh tế toàn cầu của căn bệnh này có thể được dự kiến sẽ tăng vọt [38] Do đó, cần phải đầu tư vào nghiên cứu các liệu pháp mới trong điều trị và quản lý bệnh tiểu đường

Nhiều nhóm thuốc hướng điều trị ĐTĐ tuýp 2 đã được phát triển và được đưa vào sử dụng rộng rãi như: insulin, nhóm thuốc biguanid, thiazolidinedione (TZD), sulfonylurea, meglitinide, chất ức chế α-glucosidase hay dipeptidyl peptidase-4 (DPP4), các chất đồng vận thụ thể GLP-1 và các chất tương tự amylin Chúng hoạt động chủ yếu theo 2 cơ chế là giảm hấp thu glucose đường ruột và kích thích tế bào

β đảo tuỵ Trong các thuốc mới phát triển, nhiều hoạt chất được tìm thấy thông qua quá trình thiết kế và sàng lọc hợp lý với sự hỗ trợ của các mô hình máy tính (in silico), đặc biệt là các mô hình liên quan định lượng giữa cấu trúc và tác dụng

(QSAR) Các mô hình in silico có lợi thế so với các mô hình thực nghiệm truyền thống về thời gian và chi phí vận hành Hiện nay các mô hình in silico đã trở thành

một phần không thể tách rời trong các dự án nghiên cứu và phát triển thuốc mới, chúng được sử dụng trong giai đoạn sàng lọc các thư viện hoá học lớn nhằm tìm kiếm hợp chất tiềm năng cho các nghiên cứu thực nghiệm [29]

Nghiên cứu khoa học về thực vật là một chiến lược thay thế hiệu quả để tìm

ra các tác nhân trị liệu mới Ví dụ, 1,1-dimethylbiguanide, hoạt chất trong thuốc metformin trị đái tháo đường nổi tiếng, có nguồn gốc từ guanidine - một hợp chất

hạ huyết áp được phát hiện từ cây lilac của Pháp, Galega officinalis [5] Một số loại

ix

thuốc thông thường được kê đơn cũng được phát hiện từ thực vật Các ví dụ phổ

biến bao gồm morphine giảm đau từ Papaver somniferum (thuốc phiện), thuốc chống viêm aspirin từ Salix alba (cây liễu trắng) và thuốc chống sốt rét, quinine từ Cinchona succirubra [17] Vì vậy nghiên cứu khoa học về cây thuốc dựa trên bằng

chứng để khám phá các sản phẩm tự nhiên hoạt tính sinh học với các ứng dụng điều trị là một con đường đầy hứa hẹn để thiết lập các liệu pháp mới cho bệnh này

Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng dồi dào và phong phú, đây là một nguồn quan trọng và đầy hứa hẹn để xác định các hợp chất chống đái tháo đường mới Hàng ngàn hoạt chất đã được xác định và phân lập từ các cây dược liệu là nguyên liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu sàng lọc tìm kiếm các hợp chất dẫn đường có tác dụng tốt trong kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2

Từ những phân tích nêu trên, nhằm góp phần tìm kiếm các chất có hoạt tính tốt

phù hợp phát triển thành thuốc điều trị ĐTĐ tuýp 2, tôi tiến hành đề tài “Tìm kiếm một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng hạ đường huyết hướng điều trị tiểu đường tuýp 2 sử dụng phương pháp in silico” với mục tiêu chính như sau:

1 Xây dựng hai mô hình QSAR cho phép tìm kiếm các hợp chất có tác dụng sinh

học trên từng đích phân tử là PPARγ và SGLT2 hướng điều trị ĐTĐ tuýp 2

2 Sàng lọc được một số hợp chất thiên nhiên có tác dụng điều trị tiểu đường tuýp

2 sử dụng hai mô hình QSAR đã xây dựng

3 Kiểm tra hoạt tính sinh học của các hợp chất đã sàng lọc qua mô hình in vivo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Khái niệm

Theo Bộ Y tế Việt Nam năm 2017, Đái tháo đường (ĐTĐ) được định nghĩa là

“bệnh rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, có đặc điểm tăng glucose huyết do khiếm khuyết về tiết insulin, về tác động của insulin, hoặc cả hai Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh”[1]

Theo số liệu của Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF-International Diabetes Federation), năm 2015, trong 111 nước được điều tra có đến 415 triệu người (20-79 tuổi) mắc ĐTĐ, và ước tính đến năm 2040 con số này sẽ tăng lên 642 triệu, tức là

cứ 10 người có 1 người bị ĐTĐ Mặt khác, cùng với việc sử dụng thực phẩm không khoa học, an toàn, thiếu vận động ở trẻ nhỏ, bệnh ĐTĐ tuýp 2 đang có xu hướng tăng ở cả trẻ em, trở thành một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, điển hình như các bệnh tim mạch (tăng huyết áp, xơ vữa động mạch,…), mắt (đục thủy tinh thể), thận (suy thận), và cắt cụt chi [1]

Tại Việt Nam, năm 2012, tỷ lệ hiện mắc ĐTĐ trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5.42%, tỷ lệ ĐTĐ chưa được chẩn đoán trong cộng đồng là 63.6% Theo kết quả điều tra STEPwise về các yếu tố nguy cơ của bệnh không lây nhiễm do Bộ

Y tế thực hiện năm 2015 ở nhóm từ 18-69 tuổi cho thấy tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc là 4,1%, tiền ĐTĐ là 3,6% [1]

1.1.2 Phân loại

a) Đái tháo đường tuýp 1 (do phá hủy tế bào beta tụy, dẫn đến thiếu insulin tuyệt đối) [1]

Đái tháo đường tuýp 1 chiếm 5 - 10% của tất cả các trường hợp đái tháo đường

do tế bào beta bị tàn phá nên bệnh nhân không còn hoặc còn rất ít insulin Trong đó, 95% là do cơ chế tự miễn (tuýp 1A), 5% vô căn (tuýp 1B) Bệnh nhân bị giảm lượng insulin, tăng glucagon trong máu, nếu không điều trị sẽ bị nhiễm toan ceton Bệnh ĐTĐ tuýp 1 có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu xuất hiện từ sớm (trẻ

em, thiếu niên) Bệnh nhân cần bổ sung insulin để ổn định đường huyết Người lớn

2

tuổi có thể bị ĐTĐ tự miễn diễn tiến chậm (LADA - Latent Autoimmune Diabetes

of Adulthood), ban đầu bệnh nhân còn đủ insulin nên chưa bị nhiễm toan ceton và

có thể điều trị bằng thuốc viên nhưng tình trạng thiếu insulin sẽ nặng dần theo thời gian [1]

Dấu ấn di truyền của ĐTĐ tuýp 1: Mẹ bị ĐTĐ tuýp 1 nguy cơ con bị là 3%, nguy cơ tăng đến 6% nếu cha bị ĐTĐ Tỉ lệ cùng mắc ĐTĐ tuýp 1 ở hai trẻ sinh đôi cùng trứng là 25-50% [1]

Yếu tố môi trường của ĐTĐ tuýp 1: rubella bẩm sinh, virus quai bị, thuốc diệt chuột Vacor, hydrogen cyanide ở rễ cây sắn có liên quan đến ĐTĐ tuýp 1 [1]

b) Đái tháo đường tuýp 2 (do giảm chức năng của tế bào β tuyến tụy tiến triển

trên nền tảng đề kháng insulin) [1]

Đái tháo đường tuýp 2 trước kia được gọi là ĐTĐ của người lớn tuổi hay ĐTĐ không phụ thuộc insulin, là dạng phổ biến nhất của bệnh ĐTĐ (chiếm 90-95% trong tất cả các trường hợp) và do đó là trọng tâm chính của nghiên cứu bệnh tiểu đường

Kháng insulin và sự suy giảm liên tục của tế bào β đảo tụy là trung tâm của căn

nguyên của ĐTĐ tuýp 2 [22] Tuy nhiên thường ở giai đoạn đầu hoặc có khi suốt cuộc sống bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2 không cần bổ sung insulin để sống sót Bệnh

nhân không có sự phá hủy tế bào β do tự miễn, không có kháng thể tự miễn trong máu Do tình trạng kháng insulin, trong giai đoạn đầu tế bào β sẽ bù trừ và tăng tiết insulin trong máu, nếu tình trạng này kéo dài hoặc nặng dần, tế bào β sẽ không tiết

đủ insulin và ĐTĐ tuýp 2 lâm sàng sẽ xuất hiện Sự kháng insulin cũng có thể cải thiện khi giảm cân, hoặc dùng một số thuốc nhưng không bao giờ hoàn toàn trở lại bình thường [1]

Tăng đường huyết (mức đường huyết lúc đói ≥ 7,0 mmol/L, hoặc mức đường huyết ngẫu nhiên ≥ 11,1 mmol / L) là đặc điểm bất thường về sinh lý của bệnh tiểu đường Do đó, việc đo mức đường huyết được sử dụng để sàng lọc, chẩn đoán và theo dõi bệnh tiểu đường [1],[7] Có bốn loại xét nghiệm có sẵn: (1) đường huyết lúc đói; (2) xét nghiệm dung nạp glucose đường uống; (3) xét nghiệm glucose ngẫu nhiên; và (4) HbA1c, hoặc xét nghiệm hemoglobin glycated

Hầu đa bệnh nhân có triệu chứng béo phì hoặc thừa cân và/hoặc béo phì vùng bụng với vòng eo to Nồng độ đường huyết cao kéo dài (như trong trường hợp bệnh tiểu đường) gây tổn hại cho nhiều hệ thống cơ quan Do đó, ĐTĐ tuýp 2 có liên quan đến các biến chứng nặng nề lâu dài góp phần gây ra tỷ lệ mắc bệnh và tử vong