Đồ án tốt nghiệp khảo sát đột biến gen ret trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RET TRÊN CA LÂM SÀNG U SẮC BÀO TUYẾN THƯỢNG THẬN MANG TÍNH GIA ĐÌNH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS.BS Đỗ Đức Minh Sinh viên

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RET TRÊN CA LÂM SÀNG

U SẮC BÀO TUYẾN THƯỢNG THẬN

MANG TÍNH GIA ĐÌNH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS.BS Đỗ Đức Minh Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Hiền MSSV: 1515100017 Lớp: 15HSH01

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan nội dung trình bày trong đồ án tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát

đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia

đình” là thành quả nghiên cứu trên cơ sở số liệu thực tế và được thực hiện dưới sự

hướng dẫn trực tiếp của giáo viên hướng dẫn

Mọi tham khảo trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng nguồn gốc

Mọi sao chép vi phạm quy chế của nhà trường em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Mỹ Hiền

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp.HCM đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức, lòng nhiệt huyết cũng như niềm đam mê nghiên cứu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS.BS Đỗ Đức Minh, người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn em các thông tin về lâm sàng, về kiến thức sinh học phân tử trong suốt thời gian làm đồ án

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các anh chị ở Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược Tp HCM đã luôn quan tâm, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này Thời gian học hỏi và làm việc trong môi trường thân thiện, luôn nhận được sự giúp đỡ cũng như góp ý nhiệt tình của anh chị ở Trung tâm là khoảng thời gian quý báu, mang lại cho em thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm việc

Và trên hết, con xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới gia đình Cảm ơn cha, mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng con khôn lớn, luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, dõi theo bước đường con đi

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Mỹ Hiền

i

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.3 Vật liệu 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

iii

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ

Aa Amino acid

GDNF Glial cell line Derived Neurotrophic Factor

GFLs Family Ligands

MEN2 Đa u tuyến nội tiết loại 2

MRI Chụp cộng hưởng từ (Magnetic resonance imaging)

NCBI National Center For Biotechnology Information

NF1 Neurofibromatosis loại 1

PCCs Pheochromocytomas

PGLs Paragangliomas

SNP Điểm đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms) VHL Hội chứng Von Hippel-Lindau

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng PCR 21

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 2.3: Các thông số điê ̣n di DNA bằng gel agarose 28

Bảng 2.4: Thành phần trong một phản ứng cycle sequencing 32

Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA 33

Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ nucleic acid trong mẫu 35

Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự phát hiện SNP tại exon 11, 13 [1] 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết 5

Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang 8

Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10 10

Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET 12

Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide 14

Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide 15

Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân 18

Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 26

Hình 2.3: Các chu kỳ của PCR 26

Hình 2.4: Mô tả quá trình tinh sạch sản phẩm PCR 30

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm các exon 10, 11,13, 14 - 15,16 36

Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn 39

Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn 39

Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn 40

Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn 40

Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn 41

Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn 41

Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn 42

Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn 42

Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn 43

Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn 43

1

MỞ ĐẦU

U sắc bào tuyến thượng thận (PPGLs) là bệnh nội tiết hiếm tại Việt Nam Tìm hiểu về căn bệnh này giúp chúng ta có những biện pháp phòng ngừa, giảm nguy cơ mắc bệnh cũng như kịp thời thăm khám nếu gặp các triệu chứng bất thường Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs), với các triệu chứng lâm sàng là đánh trống ngực, nhức đầu và ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp, tiết các chất catecholamines (CATE) [9] Theo dõi lâm sàng là điều cần thiết để chẩn đoán và điều trị PPGLs, hầu hết các khối u tiết CATE nếu không được điều trị thì tỷ lệ tử vong do tim mạch cũng như di căn sang các mô, cơ quan lân cận rất cao Việc xác định bất thường di truyền là quan trọng vì ít nhất 1/3 bệnh nhân bị PPGLs có đột

biến dòng mầm gây bệnh ở 1 trong số 14 gen gây bệnh gồm: NF1, RET, VHL,

SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [5,9,11] Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm

sàng, bệnh nhân PPGLs cần được thăm khám và kiểm tra di truyền cho người thân

để sàng lọc di truyền gây bệnh Xuất phát từ thực tiễn trên nhóm tiến hành đề tài

“Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận

mang tính gia đình” bằng cách sử dụng phương pháp mô tả hàng loạt ca, với mục

tiêu cụ thể:

Center For Biotechnology Information (NCBI)

Đồ án tốt nghiệp gồm có 4 chương:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Đối tượng – Vật liệu – Phương pháp

Chương 3: Kết quả – Bàn luận

Chương 4: Kết luận – Kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2

1.1 U sắc bào tuyến thượng thận

1.1.1 Giới thiệu

Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs) và thường tiết các chất catecholamines (CATE): epinephrine, norepinephrine, dopamine Khoảng 80-85% các khối u là PCCs và 15-20% là PGLs [9]

Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của mỗi tuyến thượng thận bao gồm các tế bào thần kinh nội tiết (chromaffin) sản xuất và giải phóng epinephrine (adrenaline) vào máu để đáp ứng với kích hoạt của hệ thống thần kinh giao cảm Neuroblastoma (u nguyên bào thần kinh) và pheochromocytomas (PCCs) là hai loại u quan trọng nhất phát sinh từ tủy thượng thận Cả hai loại u này cũng có thể phát sinh từ các vị trí ngoài tuyến thượng thận, cụ thể trong vùng cận hạch của chuỗi giao cảm [17]

U sắc bào tuyến thượng thận bao gồm u lành tính hoặc ác tính của thượng thận Một trong số đó được chú ý đến do sản xuất thừa hormones nội tiết Ung thư thượng thận là sự hiện diện của các khối u ác tính ở tuyến thượng thận, bao gồm u nguyên bào thần kinh, ung thư biểu mô vỏ thượng thận (adrenocortical carcinoma) và một

số u tế bào ưa crôm thượng thận (PGLs) [1] Hầu hết u tế bào ưa crôm và tất cả các

u tuyến thượng thận là những khối u lành tính, không di căn hoặc xâm lấn các mô lân cận, nhưng có thể gây ra vấn đề sức khỏe đáng kể bởi sự mất cân bằng hormones

Sự phổ biến của PPGLs ở bệnh nhân tăng huyết áp trong phòng khám ngoại trú nói chung dao động từ 0,2 - 0,6% Ở trẻ em bị tăng huyết áp, sự phổ biến của PPGLs là khoảng 1,7% Gần 5% bệnh nhân PCCs có khối u thượng thận tình cờ được phát hiện trên hình ảnh giải phẫu Nghiên cứu khám nghiệm tử thi cho thấy khối u không được chẩn đoán trong 0,05 - 0,1% bệnh nhân [9]

PCCs sản xuất, tích trữ và tiết CATE Hầu hết PCCs tiết cả epinephrine và norepinephrine và sự tiết này không liên quan đến kích thích thần kinh Ngoài ra, PCCs còn tiết các hormones khác như adrenocorticotropic hormone, somatostatin,

calcitonin, oxytocin và vasopressin Nhiều công trình nghiên cứu về PPGLs đã đúc kết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là: 10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài thượng thận và 10% không chức năng [11]

PCCs có ở mọi lứa tuổi, có thể độc lập hoặc liên kết với một hội chứng ung thư

di truyền, chẳng hạn như đa u thần kinh nội tiết (Multiple endocrine neoplasma-MEN) loại 2A và 2B, u xơ thần kinh (neurofibromatosis) loại 1 (NF1), hoặc hội chứng Von Hippel-Lindau (VHL) Chỉ có 10% PCCs thượng thận ác tính, phần còn lại là lành tính [21] Chẩn đoán xác định bằng đo nồng độ của các chất chuyển hóa CATE trong nước tiểu Hầu hết PCCs được điều trị ban đầu với các thuốc kháng adrenergic, phẫu thuật được sử dụng để loại bỏ khối u khi bệnh nhân ổn định

1.1.2 Nguyên nhân

U sắc bào tuyến thượng thận có thể xuất hiện đơn lẻ (các khối u đặc, một bên và

u ở trong vùng thượng thận) hoặc có tính chất gia đình (điển hình cũng ở tủy thượng thận nhưng thường nhiều ổ và ở cả 2 bên), ở hai nghiên cứu lớn, tần suất u tủy thượng thận có tính chất gia đình chiếm khoảng 30% và thường nằm trong bệnh cảnh của hội chứng di truyền trội nhiễm sắc thể thường Những bất thường di truyền phối hợp với u tủy thượng thận có thể là nguyên nhân do đột biến gen sinh ung thư

như RET hoặc gen ức chế u như VHL hoặc NF1 Khuyến cáo sàng lọc di truyền cho

những bệnh nhân được chẩn đoán u tủy thượng thận trước 20 tuổi, u thượng thận 2 bên, đa u cận hạch, hay cho những bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc u tủy thượng thận hay u cận hạch [22]

Vì PCCs xuất phát từ vùng tủy thượng thận, các khối u này giải phóng không liên tục một lượng các CATE có tác dụng sinh học gây ra các triệu chứng co mạch với tăng cả huyết áp tâm thu, tâm trương và tăng nhịp tim Trong tế bào ưa crôm, norepinephrine và epinephrine được chuyển hóa bởi enzyme O-methyl transferase thành các dẫn xuất O-methyl tương ứng lần lượt là normetanephrine và metanephrine Vì chuyển hóa CATE trong khối u độc lập với sự tình trạng giải phóng CATE (CATE có thể được giải phóng từng lúc hoặc với tỷ lệ thấp), định lượng các chất chuyển hóa của CATE ở huyết tương và ở nước tiểu có độ nhạy cao

4

hơn và đóng vai trò căn bản trong chẩn đoán u tủy thượng thận [22]

Ngoài ra, môi trường ô nhiễm, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, sử dụng rượu bia trong thời gian dài,… cũng làm tăng nguy cơ ung thư tuyến thượng thận

1.1.3 Biểu hiện

- Triệu chứng lâm sàng thường có: đánh trống ngực, nhức đầu, ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp (lúc này triệu chứng trên sẽ có độ nhạy 91%, độ đặc hiệu 94%)

- Tiết nhiều CATE có thể dẫn đến suy tim, phù phổi, loạn nhịp và xuất huyết nội sọ Tuy nhiên triệu chứng nổi trội nhất vẫn là tăng huyết áp Tăng tiết CATE làm cho bệnh nhân loạn nhịp tim Các cơn kịch phát thường kéo dài dưới 1 giờ và có thể

bị thúc đẩy bởi phẫu thuật, thay đổi tư thế, tập thể dục, mang thai [22]

1.1.4 Xét nghiệm chẩn đoán

Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng khuyến cáo:

- Xét nghiệm sinh hóa ban đầu: đo huyết tương metanephrines tự do hoặc metanephrines phân đoạn niệu, lấy mẫu máu bệnh nhân theo hướng dẫn của tài liệu tham khảo, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng: phổ khối lượng hoặc phát hiện điện hóa Đề nghị những bệnh nhân có kết quả xét nghiệm là dương tính cần được theo dõi mức độ tăng giá trị và biểu hiện lâm sàng [9]

- Hình ảnh học: chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp MRI ở bệnh nhân có di căn, sử dụng 123 I-metaiodobenzylguanidine (MIBG) ghi xạ hình, sử dụng 18 F-fluorodeoxyglucose (18 FFDG) chụp cắt lớp phát xạ [9]

- Kiểm tra di truyền: thử nghiệm di truyền tại các phòng thí nghiệm uy tín với những bệnh nhân nghi ngờ đột biến dòng mầm và được tư vấn sau khi có kết quả [9]

1.1.5 Điều trị

- Cắt bỏ hoàn toàn khối u

- Điều chỉnh chế độ ăn uống có nhiều natri và chất lỏng để điều hòa việc tiết CATE gây ra co huyết khối để ngăn chặn hạ huyết áp nghiêm trọng sau khi loại bỏ khối u

1.2 Bất thường di truyền

Cứ 3 ca PPGLs thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ yếu là do đột biến

dòng mầm tại 1 trong số 14 gen gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB,

EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [9]

Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết

Có thể nghi ngờ 6 bệnh khác nhau về gia đình có biểu hiện lâm sàng: bệnh NF1, MEN2, VHL, ung thư biểu mô tế bào thận với đột biến SDHB [13], khối u car-ney (u tuyến thượng thận, khối u hạch dạ dày, chondroma phổi) và hội chứng Carney-Stratakis (u tuyến tụy và sarcomas dạ dày) [14]

Các hội chứng MEN2 và VHL thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu lâm sàng

riêng biệt hướng tới việc kiểm tra các gen RET và VHL Phát hiện đột biến gen NF1 rất

phức tạp mặc dù xét nghiệm có sẵn trong các phòng xét nghiệm trực tuyến, việc chẩn đoán xác định hội chứng chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng [12]

Tuy nhiên, một số bệnh nhân có đột biến gen NF1 và một số báo cáo về PPGLs đều

có đặc điểm tương đồng [4, 6] Những phát hiện này cho thấy tầm quan trọng của việc

6

điều tra về dấu hiệu lâm sàng có thể xảy ra của một đột biến cơ bản ở tất cả các bệnh nhân PPGL

Với bệnh gia đình (di truyền) việc phát hiện nguyên nhân gây bệnh giúp tư vấn di truyền chẩn đoán, điều trị sớm các thành viên khác trong gia đình

*Theo tờ báo của Hiệp hội Mỹ về việc quản lý bệnh Ung thư tuyến giáp dạng tuỷ [16]

Nhóm bệnh MEN2A có đến 95% bệnh nhân đột biến gen RET ở codon 609, 611,

618 và 620 ở vị trí exon 10 hoặc codon 630, 634 của exon 11

Hầu như tất cả bệnh nhân có biểu hiện u tuyến giáp dạng tuỷ và một số ít bệnh nhân mắc bệnh PCCs hoặc u tuyến cận giáp, thường phụ thuộc vào đột biến đặc

trưng của RET

Ví dụ như đột biến RET ở codon 634 khiến nguy cơ mắc PCCs cao và tăng theo

độ tuổi

· 30 tuổi – 25%

· 50 tuổi – 52%

· 77 tuổi – 82%

Song, bệnh nhân mắc bệnh PCCs lại chiểm tỷ lệ thấp hơn khi bị đột biến exon

10 Tỷ lệ như sau:

· Codon 609 – 4 → 26%

· Codon 611 – 10 → 25%

· Codon 618 – 12 → 23%

· Codon 620 – 13 → 24%

Nhóm bệnh MEN2B Khoảng 75% trường hợp MEN2B riêng lẻ và bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi đột

biến ở gen RET, 25% trường hợp xảy ra có liên quan đến di truyền trong gia đình Với những bệnh nhân đột biến ở gen RET, có đến 95% bệnh nhân bị đột biến ở

exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F)

Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh MEN2B phổ biến ở độ tuổi 20 cho đến 30

Tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2005 – 2010), theo khảo sát ở 74 bệnh nhân về đặc điểm