BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI[.]
Trang 1ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ
VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP TRONG
THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : CN ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NHỚ MSSV: 1151110243 Lớp: 11DSH03
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong bài đồ án là do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của cô CN Đỗ Thị Tuyến Tôi cam đoan các kết quả nghiên cứu đưa ra trong luận án này dựa trên các kết quả thu được trong quá trình thực hiện đề tài, hoàn toàn trung thực không sao chép bất kì kết quả nghiên cứu nào của tác giả khác Nội dung trong đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các nguồn sách hay công trình nghiên cứu khác đều được đều được trích dẫn rõ ràng và liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo Nếu có vi phạm quy chế hay gian trá tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Nhớ
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với Ban Giám Hiệu cùng các thầy cô của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường
đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tôi học tập tại trường cũng như đã tạo điều kiện cho tôi thực tập để tích lũy kinh nghiệm cho công việc sau này
Để hoàn thành tốt khóa luận này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cô
CN Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài
Bên cạnh sự cố gắng hết mình của bản thân, tôi cũng thầm biết ơn sự ủng hộ, quan tâm và động viên của gia đình, bạn bè – những người thân yêu luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt thời gian qua
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong
sự nghiệp cao quý Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Sinh Học Nhiệt Đới luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc
Tôi xin chân thành cảm ơn!
TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Nhớ
Trang 4MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt v
Danh mục các hình vi
Danh mục các bảng vii
Danh mục các sơ đồ viii
Danh mục các đồ thị viii
Chương 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích 2
1.3 Yêu cầu 2
1.4 Phương pháp nghiên cứu 2
1.5 Kết cấu của đồ án 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp 3
2.1.1 Phân loại 3
2.1.2 Đặc điểm chung của chi Bacillus 4
2.1.3 Khả năng tạo bào tử 4
2.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi trồng thủy sản 6
2.1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp 7
2.2 Enzyme protease 8
2.2.1 Giới thiệu chung về protease 8
2.2.2 Phân loại protease 10
2.2.3 Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 12
2.2.4 Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease 13
2.2.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease 15
2.2.6 Ứng dụng protease vi sinh vật 16
2.3 Trùn quế 17
2.3.1 Phân loại và đặc điểm của trùn quế 17
2.3.2 Đặc tính sinh học của trùn quế 18
Trang 52.3.3 Đặc tính sinh lý của trùn quế 19
2.3.4 Sự sinh sản và phát triển 20
2.3.5 Tác dụng của trùn quế 20
2.3.6 Bổ sung Trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi 22
2.4 Chế phẩm probiotics 24
2.4.1 Định nghĩa về Probiotics 24
2.4.2.Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản 24
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26
3.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 26
3.2.1 Vật liệu 26
3.2.2 Hóa chất 27
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 28
3.3 Môi trường phân lập, định danh và giữ giống 28
3.4 Phương pháp nghiên cứu 29
3.4.1 Sơ đồ tổng quan thí nghiệm 29
3.4.2 Phương pháp phân lập Bacillus sp 30
3.4.2.1 Hoạt hóa giống Bacillus sp 30
3.4.2.2 Phân lập các chủng Bacillus sp 30
3.4.2.3 Cấy giữ gống Bacillus sp 30
3.4.2.4 Tăng sinh chủng Bacillus sp 30
3.4.2.5 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 31
3.4.3 Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa 31
3.4.3.1 Phương pháp nhuộm Gram 31
3.4.3.2 Test khả năng di động 33
3.4.3.3 Test catalase 33
3.4.3.4 Thử nghiệm khả năng sinh Indol 34
3.4.3.5 Thử nghiệm Methyl Red (MR) 35
3.4.3.6 Thử nghiệm khả năng sử dụng đường 36
Trang 63.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 36
3.4.4.1 Khả năng kháng khuẩn 36
3.4.4.2 Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease 37
3.4.4.3 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease 37
3.4.4.4 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease 38
3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế 38
3.4.5.1 Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu 38
3.4.5.2 Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế 39
3.4.5.3 Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng Nitơ tổng số) 40
3.4.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson cải tiến 41
3.4.5.5 Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin 44
3.4.6 Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease 45
3.4.6.1 Xác định nhiệt độ tối ưu 45
3.4.6.2 Xác định pH tối ưu 45
3.4.7 Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế 46
3.4.7.1 Khảo sát nồng độ cơ chất 46
3.4.7.2 Khảo sát nồng độ enzyme 47
3.4.7.3 Khảo sát thời gian thủy phân 47
3.4.8 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm 48
3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu 49
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50
4.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp 50
4.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp từ các chế phẩm Probiotic 50
4.1.2 Nhuộm Gram 52
4.1.3 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa 52
4.1.3.1 Khả năng di động 52
4.1.3.2 Khả năng sinh catalase 53
Trang 74.1.3.3 Khả năng sinh indol 54
4.1.3.4 Thử nghiệm methyl red 54
4.1.3.5 Khả năng lên men các loại đường 55
4.2 Đánh giá các hoạt tính sinh học 58
4.2.1 Đánh giá khả năng kháng khuẩn 59
4.2.2 Định tính khả năng sinh enzyme protease 59
4.3 Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế 60
4.4 Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ chế phẩm 61
4.4.1 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease 61
4.4.2 Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease 62
4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân 63
4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy phân 65
4.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân 67
4.8 Thủy phân trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn 70
4.9 Quy hoạch thực nghiệm 71
4.10 Đánh giá hiệu quả sản phẩm 77
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78
5.1 Kết luận 78
5.2 Kiến nghị 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO 80
Trang 8DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Bacillus sp 3
Hình 2.2 Quá trình tạo bào tử 5
Hình 2.3 Cấu trúc 3D của protease 8
Hình 2.4 Trùn quế 18
Hình 2.5 Trùn quế trong chăn nuôi 22
Hình 3.1 Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập 26
Hình 3.2 Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP HCM 27
Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu 50
Hình 4.2 Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6 52
Hình 4.3 Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6 53
Hình 4.4 Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6 53
Hình 4.5 Kết quả thử nghiệm khả năng sinh indol của 3 chủng 1, 5 và 6 54
Hình 4.6 kết quả thử nghiệm methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6 54
Hình 4.7 Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1 55
Hình 4.8 Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5 56
Hình 4.9 Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6 57
Trang 10DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease 13
Bảng 2.2 Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá 22
Bảng 3.1 Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin 42
Bảng 3.2 Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu 42
Bảng 3.3 Lập đường chuẩn Albumin 44
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v) 46
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%) 47
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 48
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ các chế phẩm 51
Bảng 4.2 Kết quả thử nghiệm các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát 58
Bảng 4.3 Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng 59
Bảng 4.4 Kết quả xác định vòng phân giải casein của enzyme protease thu nhận từ 3 chủng sau 48 giờ 59
Bảng 4.5 Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân 60
Bảng 4.6 Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt trùn quế bằng enzyme thương phẩm và enzyme chế phẩm 70
Bảng 4.7 Kết quả so sánh các chỉ tiêu giữa hai sản phẩm thịt trùn sau thủy phân
70
Bảng 4.8 Mã hóa các biến số thực nghiệm theo các yếu tố ảnh hưởng 71
Bảng 4.9 Ma trận kế hoạch hóa đối với 4 yếu tố 71
Bảng 4.10 Kết quả hàm lượng acid amin theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy 72
Bảng 4.11 Kết quả bj và bij 73
Bảng 4.12 Xử lý số liệu tại tâm 73
Bảng 4.13 Bảng kiểm định Student 74
Bảng 4.14 Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa các tỷ lệ trộn 77
Trang 11DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ phân loại protease 10
Sơ đồ 3.1 Quá trình tiến hành thí nghiệm 29
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chế phẩm 61
Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chế phẩm 63
Đồ thị 4.3 Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ cơ chất khác nhau 64
Đồ thị 4.4 Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ enzyme khác nhau 66
Đồ thị 4.5 Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình thủy phân với các
mức thời gian khác nhau 68
Trang 12Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của đời sống con người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế, và là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự phát triển của ngành chế biến thức ăn thủy sản Trong những năm gần đây thủy sản đã trở thành nền kinh tế mũi nhọn ở nước ta, sản lượng thủy sản ngoài đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường các nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc Để tăng năng suất và lợi nhuận người nuôi đã tăng mật độ giống, sử dụng thuốc hóa học để phòng và trị bệnh đã làm xáo trộn hệ sinh học tự nhiên, ô nhiễm môi trường và thêm vào đó là ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản Với mục đích bảo
vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không
bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, mà thay vào đó là các sản phẩm sinh học giúp tăng cường sức đề kháng bệnh, tăng khả năng hấp thụ dưỡng chất, hay làm sạch môi trường nước bằng cách bổ sung thêm những vi sinh vật có lợi Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo
sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những hệ enzyme
vi sinh vật, hoặc những sản phẩm chuyển hóa trong quá trình lên men của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh
Thêm vào đó, việc ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm hữu
cơ trong thức ăn chăn nuôi cũng là một trong những hướng nghiên cứu chính nhận được nhiều sự quan tâm của cả các nhà khoa học và người chăn nuôi Với hàm lượng protein thô cao, hàm lượng đạm của trùn tương đương với bột cá, là thức ăn lý tưởng
để nuôi thủy sản Trùn còn chứa nhiều loại acid amin,vitamin, chất khoáng cần thiết cho gia súc, gia cầm và thủy sản Đặc biệt, thịt trùn còn có các loại kích thích tố sinh trưởng tự nhiên mà trong bột cá không có Thức ăn chăn nuôi có bột trùn sẽ không
Trang 13có mùi tanh và khét của cá và dầu cá, hấp dẫn với vật nuôi, lại bảo quản được lâu hơn thức ăn có dùng bột cá Tuy nhiên protein có trong thịt trùn tươi thường khó tiêu hóa nên thủy phân bằng protease mang lại nhiều ưu điểm như: Không độc hại, cắt đứt các liên kết peptid tạo các amino acid đơn giản giúp quá trình tiêu hóa, hấp thụ tốt hơn
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và
ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp trong thức ăn chăn
nuôi thủy sản”
1.2 Mục đích nghiên cứu
Chọn lọc được chủng Bacillus sp có khả năng sinh enzyme protease cao
Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân trùn quế bằng
enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp
1.3 Nội dung nghiên cứu
Phân lập chủng Bacillus sp từ các chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy sản
Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trùn quế bằng enzyme protease: nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân
So sánh khả năng thủy phân của enzyme protease thương phẩm và enzyme
protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp
Tối ưu hóa thực nghiệm quá trình thủy phân trùn quế
1.4 Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2013 và phần mềm statgraphics
1.5 Kết cấu của đồ án
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Mở đầu
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 4: Kết quả và thảo luận
Chương 5: Kết luận và kiến nghị
Trang 14Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp
2.1.1 Phân loại
Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong thời gian dài ở điều kiện bất lợi,
nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn
Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau:
Giới: Bacteria Ngành: Fimicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Chi Bacillus là một chi lớn, đa dạng và thuộc họ Bacillaceae Với một số loài thường gặp trong tự nhiên như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus mensentericus, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, bacillus Brevis, Bacillus simplex,
Hình 2.1 Bacillus sp
(http://nuoitomsu.blogspot.com/2013/03/vai-tro-cua-vi-khuan-bacillus-sp-trong.html)