Đồ án tốt nghiệp tìm hiểu về vi khuẩn nitrat hóa, phương pháp tăng sinh, phân lập, xác định hoạt tính của vi khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU VỀ VI KHUẨN NITRAT HOÁ, PHƯƠNG PHÁP TĂNG SINH, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA VI KHUẨN Ngành CÔNG NGHỆ SIN[.]

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU VỀ VI KHUẨN NITRAT HOÁ, PHƯƠNG PHÁP TĂNG SINH, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT

TÍNH CỦA VI KHUẨN

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS: Huỳnh Văn Thành Sinh viên thực hiện : Hồ Thị Hạnh Nguyên MSSV: 1191111033 Lớp: 11hsh02

TP Hồ Chí Minh, 2013

LỜI MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Các chế phẩm vi sinh vật được sử dụng sẽ loại bỏ hàm lượng các chất C, N, P…dư thừa trong nước theo các quá trình khác nhau như: tạo sinh khối tế bào vi

Nitơ dạng hữu cơ và vô cơ thành dạng khí Nitơ thoát ra ngoài môi trường, tích tụ P trong cơ thể tế bào…Quá trình loại bỏ Nitơ dư thừa trong nước hồ diễn ra chủ yếu bởi các quá trình amon hoá, nitrat hoá, phản nitrat hoá Trong đó, nitrat hoá là quá trình hiếu khí, đầu tiên NH4+ oxy hoá thành nitrit NO2-, sau đó nitrit NO2- sẽ

Nitrosomonas và Nitrobacter Tiếp đó nitrit, nitrat chuyển thành Nitơ phân tử phát

tán vào trong không khí nhờ tác dụng của những vi khuẩn phản Nitrat hoá

Ngày nay, việc ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật để xử lý nước các hồ bị ô nhiễm được sử dụng ngày một phổ biến Khác với phương pháp vật lý, hoá lý… việc bổ sung các chế phẩm vi sinh vào trong hồ giúp tăng cường khả năng phục hồi

và thúc đẩy quá trình tự làm sạch trong hệ sinh thái của hồ Do vậy, đây là phương pháp có tính ổn định cao và là một hướng đi rất thân thiện với môi trường

Ngành công nghiệp chế biến thủy sản ở nước ta đã phát triển không ngừng trong những năm gần đây và đang là ngành mũi nhọn trong việc thúc đẩy phát triển nền kinh tế của nước nhà, mang lại nhiều lợi nhuận kinh tế cho đất nước, tạo ra nhiều công ăn việc làm cho người dân … Tuy nhiên, bên cạnh những mặt tích cực

ấy, thì còn rất nhiều công ty, nhà máy xí nghiệp chế biến thủy hải sản ở nước ta chưa có đầu tư và vận hành hệ thống xử lý nước thải; nước thải chế biến thủy sản được thải với lượng lớn ra ngoài môi trường, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, đặc biệt là môi trường nước Chính vì vậy để khắc phục tình trạng ô nhiễm này đã có nhiều biện pháp xử lý khác nhau nhằm hạn chế và giảm bớt hàm lượng chất thải hữu cơ có chứa nitơ trong hệ thống xử lý nước thải trước khi nước được thải ra ngoài Và phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là xử lý bằng phương pháp sinh học để xử lý nước thải chế biến thủy sản, với việc bổ sung vi sinh vật

được phân lập nuôi cấy từ bên ngoài vào hệ thống xử lý nước thải nhằm tăng cường hiệu quả xử lý trước khi nước được thải ra ngoài Dựa vào điểm này, nên em

đã quyết định chọn đề tài “Tìm hiểu về vi khuẩn nitrat hoá: Nitrosomonas và

Nitrobacter, phương pháp tăng sinh, phân lập, xác định hoạt tính và ứng dụng của chúng trong việc xử lý nước thải” với mục đích là biết rõ hơn về vi khuẩn

nitrat hoá, các quá trình tăng sinh, phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa, khả năng xử lý nitơ từ các nguồn nước thải

2 Tình hình nghiên cứu:

2.1 Trên thế giới:

Sự phân lập vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường nuôi cấy thuần khiết đã

được thực hiện thành công đầu tiên bởi Winogradsky (1890) Sự thành công này

của ông đã được biết đến vài năm trước khi quá trình nitrate hóa được tìm ra là do

những sinh vật sống thực hiện (Schloesing & Muntz, 1877) và sự cố gắng của

Frankland cùng các cộng sự (1890) để phân lập những sinh vật ấy bằng những

phương pháp vi khuẩn học thường dùng đã gặp thất bại

Năm 1950, bằng phương pháp cải tiến từ phương pháp của Winogradsky,

Jane Meiklejohn đã thành công trong việc phân lập chủng Nitrosomonas europaea

từ sự nuôi cấy thuần khiết Và cũng trong nghiên cứu này, bà cũng đã tìm ra được môi trường thích hợp (có bổ sung thành phần vi lượng cần thiết) để duy trì hoạt tính của các chủng vi khuẩn nitrate hóa (qua nhiều lần cấy chuyển môi trường để tăng sinh mà không bị mất hoạt tính như ban đầu bà đã vấp phải khi mới bắt đầu

nghiên cứu) Năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong

việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện ra và đặt tên cho hơn

Năm 1968, S.Soriano và N.Walker đã thành công trong việc phân lập và tinh

sạch được Nitrosomonas spp.và Nitrosocystis spp bằng việc sử dụng môi trường

agar tinh chế và một phương pháp thu nhận những tập đoàn với những pipet mao quản thủy tinh được hoạt động bởi máy vi thao tác đơn trước đây đã được mô tả

bởi Soriano (1935)

2.2 Tại Việt Nam:

Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007) đã phân lập được

4 chủng vi khuẩn nitrate hóa ứng dụng vào xử lý nước hồ bị ô nhiễm

Hoàng Phương Hòa, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc (2008) đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa từ nước lợ nuôi tôm và ứng dụng xử lý nitơ trong ao nước nuôi tôm

3 Mục đích nghiên cứu:

Tìm hiểu về quá trình nitrat hoá và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này

Qui trình tăng sinh, phân lập, các cách xác định hoạt tính của vi khuẩn

Nitrosomonas spp và Nitrobacter spp

Biết được các phương pháp định lượng nitrite và amoni trong các mẫu nước thải Tìm hiểu về ứng dụng của vi khuẩn nitrat hoá trong nghành công nghiệp hiện nay

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Tìm hiểu về qui trình tăng sinh, phân lập, xác định hoạt tính của vi khuẩn

Nitrosomonas spp và Nitrobacterspp có nguồn gốc từ các mẫu nước thải

Tìm hiểu về ứng dụng của vi khuẩn nitrat hoá trong nghành công nghiệp hiện nay

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những ảnh hưởng của những chất thải có bản chất nitơ đến môi trường sống và nước thải:

Sự hiện diện của những chất thải có bản chất nitơ và những chất thải có chứa nitơ trong nước thải cuối cùng của một hệ thống nước thải nhà máy hay xí nghiệp được thải ra, có thể tác động bất lợi và gây ô nhiễm đến chất lượng của nguồn nước tiếp nhận (các nguồn nước mặt như: sông, suối, ao, hồ…) Nguồn gốc của những

diện của những chất thải có bản chất nitơ ấy bao gồm: sự cạn kiệt oxi hòa tan

(DO), độc tính (Toxicity), sự thiếu oxi trong nước (Eutrophications) và sự làm mất

khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia)

Để giảm bớt những ảnh hưởng bất lợi của những chất thải có bản chất nitơ cho nguồn nước tiếp nhận, một hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo yêu cầu xử lý và giảm lượng chất thải có bản chất nitơ xuống dưới hoặc bằng mức cho phép của tiêu chuẩn xả thải trong nước thải đầu ra của hệ thống

xử lý nước thải ấy Hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo quá trình oxi hóa nitơ (nitrify) và quá trình khử nitơ (denitrify) những chất thải

có bản chất nitơ xảy ra hoàn tất trong cả quá trình hoạt động của hệ thống Yêu cầu của quá trình nitrate hóa (nitrification) thường được đưa ra như giới hạn thải ra

giới hạn Tổng nitơ hay Tổng nitơ Kjeldahl (TKN)

1.1.1 Sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO):

Việc thải ra những chất thải có bản chất nitơ vào nguồn nước nhận là kết quả của sự cạn kiệt nguồn oxi hòa tan trong nguồn nước nhận ấy Sự cạn kiệt xảy ra thông qua sự tiêu thụ oxi hòa tan bởi hoạt động của vi khuẩn

Đầu tiên, NH4+ được oxi hóa thành NO2- và NO2- được oxi hóa thành NO3 -bên trong nguồn nước tiếp nhận Quá trình oxi hóa mỗi ion xảy ra bằng oxi hòa tan

NO2- Tiếp theo, NH4+, NO2- và NO3- đáp ứng như là nguồn nitơ dinh dưỡng cho sự

tăng trưởng của những thực vật sống ở nước, chủ yếu là những loài tảo Khi những thực vật ấy chết đi, oxi hòa tan sẽ được di chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn để phân hủy những thực vật đã chết ấy

NH4+ NO2- NO3

-1.1.2 Độc tính (Toxicity):

Ba ion có bản chất nitơ trên (NH4+, NO2- & NO3-) có thể là độc chất cho sự sống của những loài thủy sinh vật, đặc biệt nhất là cá Những ion NH4+ và NO2- là

vô cùng độc Và NO2- là độc nhất trong 3 loại ion có bản chất nitơ

sống của thủy sinh vật

1.1.3 Sự thiếu oxi trong nước (Eutrophication):

Trong khi phosphate (PO42-) là nguồn gốc chính yếu của sự thiếu oxi trong nước thì những chất thải có bản chất nitơ cũng góp phần quan trọng cho vấn đề ô nhiễm nước này

Sự thiếu oxi trong nước nói đến sự thải ra những chất dinh dưỡng của thực vật (chủ yếu là: phốt pho và nitơ) vào nước sạch (như: hồ và ao) Sự hiện diện những chất dinh dưỡng này kích thích sự tăng trưởng nhanh chóng hay sự ra hoa của thực vật thủy sinh, bao gồm cả tảo Khi những thực vật thủy sinh này già và chết đi, xác của chúng sẽ làm cho nguồn nước thiếu oxi do quá trình hoạt động phân hủy hiếu khí của những vi sinh vật diễn ra Sự thiếu oxi trong nước dẫn đến

sự lão hóa nhanh chóng của nguồn nước ngọt khi chúng mất khá nhiều oxi cho sự phân hủy này Và sự tích lũy xác những thực vật thủy sinh ngày càng nhiều dẫn đến khả năng phân hủy của nguồn nước bị giảm đi đến mức chúng không thể phân hủy được nữa, không tự làm sạch được nữa thì dẫn đến nguồn nước ấy bị ô nhiễm

1.1.4 Sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia):

Từ “Methemoglobinemia” hay “Hội chứng da xanh ở trẻ em” nói đến một

căn bệnh của những đứa trẻ còn nhỏ (dưới 6 tháng tuổi) ăn uống phải nước ngầm

nhanh chóng liên kết với Fe trong nhân của Hemoglobin hay những tế bào hồng cầu

đi qua phổi của đứa trẻ Sự thiếu oxi trong cơ thể của đứa trẻ dẫn đến da của đứa

trẻ trở nên xanh xao, vì thế mới có thuật ngữ “Blue baby syndrome” Nếu thiếu oxi

trong não của đứa trẻ, chứng liệt hay chết có thể xuất hiện

Methemoglobinemia thường xuất hiện ở những vùng nông thôn, nơi mà nước

dùng để uống được thu từ nước ngầm Methemoglobinemia không có dấu hiệu để

cảnh báo và mặc dù nó có thể xuất hiện với những người trưởng thành, nó có thể độc hơn nhiều với những đứa trẻ sơ sinh bởi vì pH trong cơ thể chúng thấp hơn và trọng lượng cơ thể chúng thấp hơn khi so sánh với những người trưởng thành Và

mọi lứa tuổi

1.2 Chu trình nitơ trong nước thải (The Wastewater Nitrogen Cycle):

Hình 1.1: Chu trình nitơ trong nước thải

Có nhiều hợp chất có bản chất nitơ tồn tại trong môi trường sống và trong hệ thống xử lý nước thải Phần lớn nitơ tìm thấy trong môi trường sống tồn tại dưới

bầu khí quyển so với các khí khác)

Mặc dù sự cấu thành không nhiều của nitơ trong sinh khối so với carbon hay oxi nhưng nitơ là một yếu tố thiết yếu của tất cả sự sống sinh vật Nó được kết hợp chặt chẽ trong nguyên liệu tế bào và được dùng cho sự tăng trưởng, tạo ra enzyme

và thông tin về di truyền học Tuy nhiên, nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ nối với nhau bằng 3 dây nối N N, nó rất khó để hầu hết sinh vật có thể bẻ gãy May thay, nitơ phân tử được tạo ra sẵn có cho sự sống sinh vật khi mà liên kết

3 bị bẻ gãy bởi một nhóm vi khuẩn duy nhất và được cố định lại hay biến đổi thành

NH4+

nitơ Những vi khuẩn này có thể sống tự do trong đất xung quanh rễ của thực vật hay có thể tăng trưởng cộng sinh trong rễ của những cây họ đậu

Sự cố định nitơ tức là sự chuyển đổi nitơ phân tử thành NH4+, được hoàn thành bởi enzyme nitrogenase chỉ được tìm thấy trong những vi khuẩn cố định nitơ Trước khi sự sử dụng phân bón nitơ lan rộng, thực vật tăng trưởng nốt sần hay những cây họ đậu cung cấp nitơ cho đất Ví dụ những cây họ đậu bao gồm: Cỏ linh lăng, Cỏ ba lá và những cây Đậu nành

Một vài loài tảo cũng có thể sử dụng nitơ phân tử để sản xuất ra amino acid

và protein Tảo lấy nitơ phân tử từ không khí và đồng hóa chúng thành những phân

tử hữu cơ Cuối cùng, những phân tử hữu cơ này với nitơ liên kết thành cấu trúc của chúng và được tiêu thụ trong suốt chiều dài của chuỗi thức ăn; như là tảo được tiêu thụ bởi những dạng sống cao hơn

Sự di chuyển của nitơ và sự thay đổi chính nó trong các trạng thái oxi hóa từ không khí sang sinh vật sống đến hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) và sự trở lại của nó vào không khí là chu trình nitơ trong nước thải Chu trình này liên kết với những hợp chất có bản chất nitơ then chốt liên tiếp như: nitơ phân

tử (N2), amino acid, protein, urea, NH4+, NH3, NO2- và NO3- Trong đó, amino acid

và protein là những dạng hữu cơ của nitơ; còn nitơ phân tử (N2), NH4+, NH3, NO2

-và NO3- là những dạng vô cơ của nitơ

Sự sản sinh ra NO2- và NO3- trong hệ thống cống rãnh là hiếm thấy Những điều kiện trong hệ thống cống rãnh là không phù hợp cho sự tạo ra hay quá trình nitrate hóa của những ion này Những điều kiện bất lợi trong hệ thống cống rãnh ngăn cản quá trình nitrate hóa bao gồm: sự thiếu oxi thích hợp, quần thể vi khuẩn

nguồn nước thải công nghiệp có những ion này, như là nước thải nhà máy thép Những amino acid và protein trong mô thực vật, trong rễ, trong hạt và từ thịt vật nuôi được thải trực tiếp vào hệ thống cống rãnh (rác vứt bỏ đi, nước thải chế

biến thực phẩm) và gián tiếp vào hệ thống cống rãnh (chất thải có bản chất là

deaminase và đưa đến kết quả là tạo ra NH4+ Sự tạo thành NH4+ còn được biết đến

cho thấy:

Phenylalanine–Proteus NH4+ Phenylpyruvic acid

Urea: là một hợp chất nitơ hữu cơ, chúng được tìm thấy trong nước tiểu,

phân bón và những chất thải từ chăn nuôi Khi mà được thủy phân bởi enzyme

nhiều sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ liên kết với phân bao gồm: Citrobacter

NH2COHN2 H2O –Citrobacter 2NH3 CO2

Những amino acid và những protein không được phân hủy trong hệ thống cống rãnh có thể được phân hủy trong hệ thống xử lý nước thải (bể aerotank) Sự phân hủy những amino acid và protein trong bể aerotank cũng đưa đến kết quả sản sinh ra NH4+

Những ion NH4+ trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) có vài nhiệm vụ Chúng có thể được dùng như nguồn dinh dưỡng nitơ bởi những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ và vi khuẩn nitrate hóa Chúng có thể được giải

không được sử dụng như nguồn dinh dưỡng, hóa thành khí hay oxi hóa, chúng được chảy vào trong hệ thống nhánh của bể aerotank

Dưới nhiệt độ lạnh hay điều kiện phương pháp hệ thống có giới hạn, ion NO2

lợi Nếu NH4+ và NO2- không có sẵn trong bể aerotank, NO3- được dùng như là nguồn dinh dưỡng nitơ bởi những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ Nếu những

thành các khí N2O và N2

dưỡng nitơ thì chúng được chảy vào hệ thống nhánh của bể aerotank Trong bể lắng 2, NO3- có thể được khử nitrate

Những ion NO3- là quan trọng chủ yếu trong chu trình nitơ nước thải Chúng

là sản phẩm của quá trình nitrate hóa, cơ chất của quá trình phản nitrate hóa và là

dinh dưỡng nitơ thông qua một hệ thống sinh học được biết như sự đồng hóa nitrate Những ion NO3- rất dồi dào, nguồn nitơ vô cơ trong nguồn nước

Sự phản nitrate có thể xảy ra trong lớp bùn của bể lắng 2 (trong Hệ thống xử

lý nước thải) khi mà điều kiện kỵ khí xảy ra trong lớp bùn Ở đây vi khuẩn kỵ khí

Sự phân hủy này được liên kết với sự giải phóng phân tử nitơ

Những ion NH4+ có thể được loại bỏ bởi hoạt động trộn hay sự hóa khí vào

ít hơn 10%

Khi mà những chất thải nitơ hữu cơ không còn có sẵn nữa để giải phóng ra

dinh dưỡng nitơ và bị oxi hóa thành NO2- và NO3- Nếu quá trình nitrate hóa bắt đầu một cách đúng đắn, không có sự tích lũy của NO2- xảy ra Một vài ion NO3- có

trình phản nitrate xảy ra thì lượng NO3- sẽ bị giảm rất lớn, có lẽ được loại trừ